用Percoll分离的大鼠睾丸间质细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应

目的:了解用分离液Percoll分离的Leydig细胞对人绒毛膜促性腺激素刺激的反应规律。方法:将大鼠睾丸间质细胞混悬液用不连续梯度(20%～80%)Percoll分离液分离并进行为期5d的培养,观察不同培养时间Leydig对不同剂量hCG刺激的反应。结果:Percoll分离、纯化的Leydig细胞纯度可达80%～85%;随着培养时间的延长,Leydig细胞功能逐渐减低,对hCG刺激反应以培养d1和d2最大;小剂量hCG(1IU/ml)即可使睾酮分泌达到峰值,加大剂量则会抑制细胞分泌睾酮的功能。结论:Percoll分离液能明显的提高Leydig细胞纯度;培养的d1～2为最佳刺激时间,hCG用量以1IU/ml为宜     

大鼠TNF-α对大鼠睾丸Leydig细胞作用的研究

目的 探讨大鼠TNF-α对大鼠Leydig细胞分泌功能的影响。方法 Leydig细胞纯化后进行原代培养。加入不同浓度的大鼠TNF-α(0．1、1、10ng／m1),hCG(50IU／ml)处理。放免方法测定上清液的睾酮含量。结果 TNF-α在0．1、1、10ng／ml浓度时,能够以剂量及时间依赖性地抑制睾丸kydig细胞睾酮的基础分泌及hCG刺激的分泌,差异显著。结论 大鼠TNF-α对睾丸Leydig细胞睾酮的基础分泌及hCG刺激引起的分泌均具有抑制作用。     

去势大鼠睾丸间质细胞移植的实验研究

目的：探讨对去势大鼠动物模型行睾丸间质细胞（Leydig细胞）移植的可行性。方法：随机选择SD大鼠离体睾丸进行Leydig细胞的体外培养及同种异体去势鼠大腿内侧肌群Leydig细胞移植，并进行绒毛膜促性腺激素（hCG)激发试验，监测其血清睾酮分泌情况的变化，结果：体外培养的Leydig细胞对hCG的刺激敏感，能分泌大量睾酮，而一旦进入机体后虽然短期内仍然成活，但分泌功能明显受阻，结论：通过施行同种异体睾丸Leydig细胞移植以提高血清睾酮含量的前景值得商榷。     

hCG调节原代培养小鼠睾丸Leydig细胞Atrn mRNA和Atrn蛋白的表达及与睾酮分泌的相关性

目的探讨hCG刺激的Leydig细胞睾酮分泌与Atrn mRNA和Atrn蛋白表达的关系。方法将原代培养的Leydig细胞分为5组,分别在培养液中加入0、0．1、1、10、100ng／mLhCG,培养24h后吸取培养液用于测定睾酮分泌量。同时提取细胞mRNA和总蛋白,用实时定量RT—PCR和Westernblot方法分别检测Leydig细胞中AtrnmRNA和Atrn蛋白表达量。结果刺激24h后,与0ng／mLhCG剂量组相比较,0．1,1,10,100ng／mLhCG剂量组睾酮生成量都明显增加,统计学差异较大（P〈0．01）。Leydig细胞AtrnmRNA表达量增加（0．1ng／mLhCG组P〈0．05,其余剂量组P〈0．01）。睾酮生成量与Atrn蛋白表达量（r=0．987,P〈0．01）和AtrnmRNA表达量（r=0．982,P〈0．01）呈正相关。结论原代培养的Leydig细胞在hCG刺激下,睾酮生成量、AtrnmRNA和Atm蛋白表达量都呈现hCG剂量依赖性的增加。     

甲状腺激素对睾丸间质细胞睾酮分泌的影响

目的：观察甲状腺激素对睾丸间质细胞（Leydig细胞）睾酮分泌的影响。方法：以不同浓度(0μg/ml、0．1μg/ml、1和10μg/ml）三碘甲状腺原氨酸（T3）刺激培养大鼠睾丸间质细胞（Leydig细胞）,观察细胞基础和应激状态时睾酮分泌的变化;同时测定不同甲状腺功能大鼠体外睾酮分泌水平。结果：直接用T3刺激培养的睾丸Leydig 细胞,睾酮分泌水平无显著变化;而将高甲状腺激素血症大鼠和低甲状腺激素血症大鼠Leydig细胞进行培养显示,无论在 基础还是在负荷情况下睾酮分泌能力均显著下降（P＜0．01）。结论：体外培养的睾丸Leydig细胞对甲状腺激素的刺激无反应。高甲状腺激素和低甲状腺激素状态时睾丸Leydig细胞分泌睾酮的能力均降低。     

胰岛素样生长因子-I和人绒毛膜促性腺激素对成年大鼠Leydig细胞葡萄糖转运蛋白基因表达调控

目的:研究胰岛素样生长因子I(IGF I)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)对成年大鼠睾丸Leydig细胞中葡萄糖转运蛋白(GLUT)基因表达的影响,为进一步探讨Leydig细胞中睾酮的合成、分泌与葡萄糖代谢的关系提供依据。方法:采用改良的Klinefelter方法从成年大鼠睾丸中分离获得Leydig细胞;用反转录聚合酶链技术检测IGF I和hCG对原代培养的Leydig细胞中GLUT基因表达的调控作用。结果:分离得到纯度为98%的大鼠Leydig细胞,并与对照组比较,hCG可显著增加Leydig细胞中GLUT8基因mRNA的表达水平(P<0.001),且此作用具有剂量依赖性与时效性。当在试验组细胞中单独加入IGF I或IGF I和hCG作用于细胞后,发现IGF I(100ng mL)可显著增加Leydig细胞中GLUT8基因mRNA的表达(P<0.01),也可与hCG协同作用显著提高GLUT8基因的mRNA表达,该结果与IGF I(100ng mL)和hCG(10ng mL)能协同作用极显著增加睾酮合成水平(P<0.001)的结果是相吻合的。在大鼠Leydig细胞中,无论10ng mL或100ng mL还是两者同时作用于细胞,都不能影响GLUT1和GLUT3基因的mRNA水平。结论:在成年大鼠Leydig细胞中,IGF I和hCG对细胞中的GLUT8基因表达的调节作用具有特异性,其协同作用能显著提高细胞中GLUT8基因mRNA水平,增强细胞摄取葡萄糖的能力,给细胞提供更多的代谢能源,最终增加Leydig细胞睾酮的合成与分泌。     

电离射辐致大鼠离体Leydig细胞对hCG反应性变化机理的初探

本实验采用幼年雄性大鼠睾丸Leydig细胞离体单层培养法,研究hCG对Leydig细胞睾酮和cAMP生成的影响,并探讨了不同剂量X线对Leydig细胞辐射效应的发生机理。实验结果表明,hCG能明显促进Leydig细胞睾酮和cAMP生成。细胞预培养24h接受不同剂量X线照射,停照后加入外源性hLCG(0.05IU/ml)继续培养48h,小剂量辐射(25～250mGy,剂量率12.5mGy/min)在25,50mGy剂量组引起Leydig细胞对hCG反应性增高,睾酮生成量明显高于对照组,细胞内cAMP含量也发生相应变化;大剂量辐射后(0.5～8.0Gy,剂量率0.5Gy/min),Leydig细胞在各剂量组对hCG反应性均降低,睾酮生成量和cAMP含量变化一致,并与照射剂量呈线性负相关。     

非酶糖基化终末产物介导的ERK1/2信号转导通路在大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌中的作用

目的：探讨非酶糖基化终末产物(AGEs)对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响及其潜在机制。方法首先,原代培养大鼠睾丸间质细胞,采用3β-HSD免疫细胞化学方法对间质细胞进行鉴定;其次,MTT法测定不同浓度的AGEs (25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)及200μg/mL BSA作用Leydig细胞后的细胞活力;最后,用不同浓度的AGEs及200μg/mL BSA预处理Leydig细胞12 h,之后更换含相应浓度AGEs或BSA的培养基并加入终浓度为4 U/mL的hCG,其中对照组不含AGEs和BSA,ELISA法和Western blot分别检测睾酮分泌量和p-ERK1/2的表达量。结果 MTT法表明AGEs (≤200μg/mL)对Leydig细胞的活力在本实验所研究的时间内没有影响;ELISA法和Western blot结果显示,不同浓度AGEs处理后,hCG诱导的Leydig细胞睾酮合成量和ERK1/2蛋白的磷酸化都呈现浓度依赖性下降,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 AGEs通过抑制ERK1/2的磷酸化降低大鼠Leydig cells睾酮的分泌。     

氯化锰对原代培养大鼠睾丸间质细胞睾酮合成的影响

目的:探讨氯化锰(MnCl2)对SD大鼠体外培养睾丸间质细胞(Leydig cells)睾酮合成的影响.方法:建立SD大鼠睾丸Leydig细胞体外原代培养模型.MnCl2染毒剂量组分为对照(0 μmol/L)、1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、25.0 μmol/L、 50.0 μmol/L、100.0 μmol/L,培养24 h后,采用台盼蓝染色法测定细胞存活率.同法分组,采用放射免疫法检测加入人绒毛膜促性腺激素(HCG)与不加HCG条件下,上述剂量MnCl2对Leydig细胞合成睾酮的影响.结果:随着MnCl2染毒剂量的升高,Leydig细胞存活率逐渐下降.MnCl2剂量≥5.0 μmol/L时,细胞存活率均低于对照组(P<0.05).基础状态下(不加HCG)MnCl2剂量≥5.0 μmol/L时睾酮水平均低于对照组(P＜0.05);HCG刺激状态下MnCl2剂量≥10.0 μmol/L时睾酮水平低于对照组(P＜0.05).结论:锰可以直接影响原代培养Leydig细胞睾酮的合成.     

邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯对原代培养小鼠胚胎睾丸Leydig细胞功能影响研究

目的探讨邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[Di(2-ethylhexyl)phthalate, DEHP]对体外培养的小鼠胚胎睾丸间质细胞(Leydig细胞)3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)活性及睾酮合成的影响.方法小鼠胚胎Leydig细胞原代培养.DEHP染毒剂量分别为25、50、100、200 mg/L,通过检测睾酮合成关键酶3β-HSD活性、放免法测定培养液中睾酮浓度,研究DEHP对Leydig细胞功能影响.结果小鼠胚胎Leydig细胞分离培养后,纯度和存活率分别达(81.17±2.32)%、(80.88±2.80)%.DEHP(25 mg/L)处理12 h,或DEHP(50 mg/L)处理6 h后,实验组与对照组比较3β-HSD酶活性明显降低(P《0.05),随着时间延长和药物浓度增加差异更显著(P《0.01).DEHP50、100 mg/L实验组,在12、24 h的睾酮水平明显低于对照组(P《0.05)或(P《0.01),存在时间-效应关系;DEHP 200 mg/L实验组在6、12、24 h与对照组比较均有非常显著差异(P《0.01),并可观察到Leydig细胞明显的形态学改变.结论 DEHP能影响原代培养小鼠胚胎Leydig细胞3β-羟基类固醇脱氢酶活性,并抑制睾酮合成,存在时间-效应和剂量-效应关系.     

The effects of 2—Bromopropane on Viability and Testosterone Production Ability7 of Rat Leydig Cells in Primary Culture

Epidemiological surveys and animal experiments have shown that 2-bromopropane induces oligozoospermia in exposed workers and inhibits spermatogensis in laboratory animals. However, the mechanism by which 2-bromopropane exerts its effects is unknown. To this end, we examined the formation of testosterone by the Leydig cells and their survival of these cells in the presence of different concentrations of 2-bromopropane in vitro. Leydig cells were isolated following vascular perfusion, enzymatic dissociation and Percoll gradient centrifugation techniques. The cells were cultured in culture dishes. After 8 h, different cultures were exposed to 2-bromopropane at concentrations of 0.01 mmol/L, 0.10 mmol/L and 1.00 mmol/L. In order to stimulate Leydig cells to secrete testosterone, human chorionic gonadotropin (hCG) was also added. Cell viability was determined using the trypan blue dye exclusion test and cell numbers were counted by hemocytometer. Testosterone secretion was detected by radioimmunoassay. The cell viability decreased after exposure to 2-bromopropane in a dose-dependent way, but no morphological change was observed. The cell number decreased in the 2-bromopropane-treated cultures. The secretion of testosterone did not manifest defectable changes in the culture treated with 0.10 mmol/L and 0.01 mmol/L of 2-bromopropane; however, it decreased significantly (P < 0.02) in the presence of 1.00 mmol/L. Therefore, our results strongly suggest that 2-bromopropane may exert its cytotoxic effects on Leydig cells in vitro. We speculate that the decrease in the numbers of Leydig cells caused by 2-bromopropane was mediated by a feedback mechanism resulting from a lower testosterone concentration.     

The effects of 2-Bromopropane on Viability and Testosterone Production Ability of Rat Leydig Cells in Primary Culture

Epidemiological surveys and animal experiments have shown that 2-bromopropane induces oligozoospermia in exposed workers and inhibits spermatogensis in laboratory animals. However, the mechanism by which 2-bromopropane exerts its effects is unknown. To this end, we examined the formation of testosterone by the Leydig cells and their survival of these cells in the presence of different concentrations of 2-bromopropane in vitro. Leydig cells were isolated following vascular perfusion, enzymatic dissociation and Percoll gradient centrifugation techniques. The cells were cultured in culture dishes. After 8 h, different cultures were exposed to 2-bromopropane at concentrations of 0.01 mmol/L, 0.10 mmol/L and 1.00 mmol/L. In order to stimulate Leydig cells to secrete testosterone, human chorionic gonadotropin (hCG) was also added. Cell viability was determined using the trypan blue dye exclusion test and cell numbers were counted by hemocytometer. Testosterone secretion was detected by radioimmunoassay. The cell viability decreased after exposure to 2-bromopropane in a dose-dependent way, but no morphological change was observed. The cell number decreased in the 2-bromopropane-treated cultures. The secretion of testosterone did not manifest detectable changes in the culture treated with 0.10 mmol/L and 0.01 mmol/L of 2-bromopropane; however, it decreased significantly (P<0.02) in the presence of 1.00 mmol/L. Therefore, our results strongly suggest that 2-bromopropane may exert its cytotoxic effects on Leydig cells in vitro. We speculate that the decrease in the numbers of Leydig cells caused by 2-bromopropane was mediated by a feedback mechanism resulting from a lower testosterone concentration.     

人骨髓间充质干细胞向Leydig细胞或产类固醇激素细胞体外诱导分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向睾丸Leydig细胞分化,并确定诱导条件。方法将分离培养所获得的第3代MSCs细胞经含黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血小板衍化生长因子(PDGF)及白介素-1α(IL-1α)的诱导液诱导,按诱导液中各因子浓度不同分为A、B、C组和对照组,分别于7d、14d、21d时观察细胞形态变化,并行3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫细胞化学染色和免疫荧光染色,检测各组细胞3β-HSD的表达。以人睾酮ELISA试剂盒检测诱导细胞分泌类固醇的功能情况。结果诱导10～14d后,细胞具有Leydig细胞的形态特点;免疫细胞化学染色及免疫荧光染色显示,本研究条件下,随着诱导液中各因子浓度加大及诱导时间延长,诱导细胞3β-HSD表达阳性数和阳性率逐渐增多,以A组浓度及21d为最佳诱导浓度及时间(P<0.05),并且A组诱导21d分泌睾酮量最高(P<0.05)。结论人骨髓MSCs经体外诱导后可以分化为Leydig细胞或产类固醇细胞。     

催乳素对原代培养恒河猴睾丸间质细胞睾酮合成的影响

目的 研究催乳素对睾丸间质细胞睾酮生成的调节作用. 方法 采用无血清培养方法 分析催乳素时原代培养恒河猴睾丸间质细胞睾酮合成的影响. 结果 催乳素可增强恒河猴睾丸间质细胞对猴绒毛膜促性腺激素(mCG)刺激的反应,睾酮分泌量显著高于mCG和催乳素单独作用时的总和.在mCG存在下,催乳素可调节不同的睾酮前身物孕烯醇酮、孕酮和17α-羟孕烯醇酮转化为睾酮.低剂量的催乳素(10～100 ng·mL-1)可使一定剂量的睾酮前身物转化为睾酮的量明显增加,而高剂量的催扎素(300～1000 ng·mL-1)却明显地抑制睾酮前身物为睾酮,其中以17α-羟孕烯醇酮的作用最为显著. 结论 催乳素对睾丸间质细胞睾酮合成的作用,可能部分是通过其促进17α-羟孕烯醇酮转化为睾酮来实现的.