不同引物检测甲型H1N1流感病毒的比较研究

目的筛选灵敏、特异的甲型H1N1流感病毒核酸检测方法。方法采用国家流感中心推荐的甲型流感病毒(H1N1)核酸引物和1对自行设计的引物,同时选择市售荧光定量PCR试剂盒,分别对不同浓度的流感病毒进行RT-PCR或荧光定量PCR扩增,比较其检测的灵敏度和特异性。结果荧光定量PCR检测H1N1病毒核酸的灵敏度为10-5(病毒稀释度),高于普通RT-PCR的灵敏度10-3~10-4;RT-PCR扩增甲型流感病毒(H1N1)核酸时,自行设计引物的灵敏度为10-4,高于中国CDC推荐引物的灵敏度10-3。2种引物的特异性一致。结论对于甲型(H1N1)流感病毒疑似样品的检测,荧光定量PCR是较灵敏的方法,但从成本和灵敏度两方面考虑,自行设计的引物更适合基层疾控机构采用。     

3例SARS患者的RT-PCR与ELISA确认

目的 为了对SARS疑似患者进行快速早期诊断和进行血清学确认。方法 从SARS疑似患者含漱液与细胞病毒分离上清液中提取病毒RNA，进行逆转录套式PCR反应，扩增SARS病毒特异性核酸片段，进行序列测定与序列比对。并对患者不同发病日期采集的血清标本进行SARS病毒ELISA抗体测定。结果 SARS患者含漱液标本和细胞病毒分离上清液中均能扩增出特异性核酸片段，经测序证实来自SARS冠状病毒。患者血清标本中SARS病毒抗体在发病后18d开始呈阳性。以后随发病日期增加而升高。结论 逆转录套式PCR是一种早期、敏感、特异、快速检测传染性非典型肺炎疑似患者临床样本中SARS冠状病毒的理想方法。浙江省3例SARS临床诊断病例的含漱液和血清标本经SARS病毒核酸和抗体检测。证实为SARS病例。     

应用Taq Man荧光定量RT-PCR快速检测肠道病毒的研究

目的建立一种快速、灵敏、特异的荧光定量RT-PCR检测肠道病毒的方法。方法根据GenBank中肠道病毒5′UTR序列,应用生物软件在保守区设计与筛选特异引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对急性临床样本的检测,评价该方法的实际应用价值。结果该方法对肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及柯萨奇病毒和埃可病毒等的检测有高度特异性,甲肝病毒、乙脑病毒、登革病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、诺如病毒等均呈阴性。该方法的检测下限达10-1TCID50/100μl。12份急性结膜炎病例结膜拭子标本中7份肠道病毒核酸阳性,普通RT-PCR方法5份阳性。结论TaqMan荧光定量RT-PCR方法快速、敏感、特异,适于肠道病毒的快速检测。     

一种A型流感病毒NP抗原快速检测试剂的建立

目的建立一种适合现场检测需要的A型流感快速诊断试剂。方法以自制的抗A型流感(FluA)病毒核蛋白(NP)单抗为原料,建立快速检测A型流感病毒的双抗体夹心酶免疫渗滤试验,并对其灵敏度和特异性进行了初步评价。结果该试剂对不同地区流行的各种亚型的A型流感病毒株均有较高的反应性,而对非FluA病毒株无交叉反应。比较该试剂与BD公司的两种流感快速诊断试剂,发现该试剂对随机选取的3株FluA病毒的检测分析灵敏度高出Directigen EZ Flu A试剂5~125倍,对2株FluA病毒的分析灵敏度高出Directigen Flu A试剂约20倍。另外,用该试剂对57份含漱液标本和170份动物拭子标本进行检测,结果显示:本试剂的灵敏度(>85%)和特异性(>95%)均优于当前主流的商品化A型流感快速诊断试剂。结论利用抗FluANP单抗为原料建立了A型流感快速诊断试剂,该试剂的应用无需任何专用仪器,操作简便快速,可满足现场检测需要。     

甲型流感病毒快速基因分型POCT方法的建立

目的建立一种无需核酸提取,直接检测鼻咽拭子中甲型流感病毒H1HA pdm09、H3HA亚型和季节性流感病毒H1HA non-pdm09的POCT快速分型方法。方法针对3种流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列保守区设计高度特异性的引物和HyBeacon探针,同时以人类RNaseP基因作为内参。优化多重PCR反应条件,建立用熔解曲线分析甲型流感病毒基因分型的方法,并将其应用到ParaDNA核酸POCT检测仪,对50例甲型流感病毒抗原初筛阳性且经过实时荧光定量PCR检测的临床鼻咽拭子标本进行检测。结果该方法可在1.5 h内完成对3种甲型流感病毒亚型HA基因的特异性扩增和分型,与其他7种呼吸道病原微生物无交叉反应,其核酸检测下限为50 copies/μl。对临床50例甲型流感病毒抗原阳性的鼻咽拭子标本进行直接检测,检出H1HA pdm09阳性标本48例,H3HA阳性标本2例,未检出季节性流感H1HA nonpdm09阳性标本。结论基于HyBeacon探针和ParaDNA核酸POCT检测仪所建立的甲型流感病毒快速分型方法能同时检测H1HA pdm09、H3HA和季节性流感病毒H1HA non-pdm09。该方法无需核酸提取,操作简便,检测时间短,适于对甲型流感病毒抗原初筛阳性的鼻咽拭子开展现场基因分型检测,可为流感的诊治和防控提供及时快速的实验室依据。     

猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。方法 根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR),进行了FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PCMV 感染临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了比对;对FQ-PCR检测结果为PCMV 阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测。结果 成功建立了PCMV 的FQ-PCR方法,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;检测灵敏度可达1 拷贝/μL,是常规PCR的100倍;特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好;对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行应用检测表明,其中有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。猪的内脏器管中PCMV含量最高为扁桃体,最低的为小肠。结论 成功建立了PCMV FQ-PCR方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测,对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。     

多重荧光RT-PCR同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒方法的建立

目的建立可同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的双重荧光RT-PCR快速检测方法,并应用于临床标本的检测。方法使用针对GI型和GⅡ型诺如病毒各亚型代表株保守序列设计的特异性引物和TaqMan探针,通过调整引物、探针浓度优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系。对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行评估,并对临床粪便标本进行检测,与已有的单重荧光RT-PCR方法进行比较。结果实验结果表明,该检测方法特异性强,对GⅠ型、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒进行检测,均无交叉反应;对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达1pg/mL和10pg/mL,并且重复性好;对101份临床标本分别用已有的单重荧光RT-PCR和本文建立的多重荧光RT-PCR进行检测,结果显示本文建立的多重荧光RT-PCR方法对GⅠ型诺如病毒的检测能力优于前者。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR方法能同时对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒进行快速检测,并且灵敏度高,特异性好,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速检测。     

病毒性传染病

荧光定量-聚合酶链反应法快速检测麻疹病毒核酸——姜明杰等（河北承德市疾病预防控制中心067000）；《中国卫生检验杂志》2007，17（4）：616-617[目的：采用荧光定量-聚合酶链反应（FO-PCR）法，检测麻疹病毒核酸，用以建立和推广一种敏感、特异、快速的麻疹检测新技术。方法：TaqMan特异性荧光标记探针法，进行特异性、     

狂犬病病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立狂犬病病毒快速检测法。方法根据狂犬病病毒核蛋白基因的保守序列分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针。构建pMD-N重组质粒,建立荧光定量RT-PCR绝对定量标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;作重复性和特异性检验后进行临床标本的检测。结果构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.998。狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测反应的灵敏度为10个TCID_(50);5种非狂犬病病原体检测均为阴性。结论建立的狂犬病病毒的荧光定量RT- PCR检测方法快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以应用于临床样品的检测。     

阪崎肠杆菌实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对阪崎肠杆菌的高灵敏、高特异的实时荧光双重TaqMan聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系。方法根据阪崎肠杆菌基因组16SrRNA～23SrRNA的内部转录间隔区（ITS）基因和外膜蛋白A（OmpA）基因的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光双重TaqMan PCR快速检测体系对阪崎肠杆菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对阪崎肠杆菌基因组的检测灵敏度为4×10-1pg/反应体系;该检测体系在检测50种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光双重TaqMan PCR检测体系可作为阪崎肠杆菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时检测阪崎肠杆菌的致病力。     

The development of a GeXP-based multiplex reverse transcription-PCR assay for simultaneous detection of sixteen human respiratory virus types/subtypes

ABSTRACT: BACKGROUND: Existing standard non-molecular diagnostic methods such as viral culture and immunofluorescent (DFA) are time-consuming, labor intensive or limited sensitivity. Several multiplex molecular assays are costly. Therefore, there is a need for the development of a rapid and sensitive diagnosis of respiratory viral pathogens. METHODS: A GeXP-based multiplex RT-PCR assay (GeXP assay) was developed to detect simultaneously sixteen different respiratory virus types/subtypes. Seventeen sets of chimeric primers were used to initiate the RT-PCR, and one pair of universal primers was used for the subsequent cycles of the RT-PCR. The specificity of the GeXP assay was examined with positive controls for each virus type/subtype. The sensitivity was evaluated by performing the assay on serial ten-fold dilutions of in vitro-transcribed RNA of all RNA viruses and the plasmids containing the Adv and HBoV target sequence. GeXP assay was further evaluated using 126 clinical specimens and compared with Luminex xTAG RVP Fast assay. RESULTS: The GeXP assay achieved a sensitivity of 20-200 copies for a single virus and 1000 copies when all of the 16 pre-mixed viral targets were present. Analyses of 126 clinical specimens using the GeXP assay demonstrated that GeXP assay and the RVP Fast assay were in complete agreement for 109/126 (88.51 %) of the specimens. GeXP assay was more sensitive than the RVP Fast assay for the detection of HRV and PIV3, and slightly less sensitive for the detection of HMPV, Adv, RSVB and HBoV. The whole process of the GeXP assay for the detection of 12 samples was completed within 2.5 hours. CONCLUSIONS: In conclusion, the GeXP assay is a rapid, cost-effective, sensitive, specific and high throughput method for the detection of respiratory virus infections.     

禽流感病毒H1、H3、H5、N2亚型多重RT-PCR检测方法的初步研究

目的根据禽流感病毒H1、H3、H5亚型的HA基因和N2型NA基因的保守序列,设计出四对RT-PCR引物,建立一步法多重RT-PCR对禽流感H1、H3、H5、N2四亚型进行快速检测。方法利用所设计的四对引物,通过对该方法扩增条件的优化,成功建立快速检测禽流感病毒H1、H3、H5、N2四亚型的一步法多重RT-PCR。利用禽流感H1、H3、H5、N2四亚型毒株和其它相关标准毒株进行敏感性和特异性试验。结果与结论所建立的一步法多重RT-PCR具有较高的特异性和敏感性,与禽流感其它亚型和NDV、IBV、ARV?IBDV的核酸均无交叉反应。用该方法检测现场样品395份(4省20多个地区),结果与经典检测方法一致。     

应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的 建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法 针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果 该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1 TCID₅₀/mL和1 TCID₅₀/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论 本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。     

Optical immunoassay test for rapid detection of influenza A and B viruses: an evaluation

The optical immunoassay test (FLU OIA, BioStar, USA) for rapid detection of influenza A and B viral antigens was compared with viral isolation in cell culture. A total of 103 respiratory specimens were tested on 75 pediatric patients with acute respiratory illnesses. Influenza viruses were recovered in 40 specimens (type A: 5, Type B: 35). FLU OIA demonstrated 80.0% sensitivity and 68.8% specificity for nasopharyngeal aspirates and 36.7% sensitivity and 83.9% specificity for throat swabs. We also tested FLU OIA, retrospectively, using 78 supernatant samples from pediatric patients with influenza A virus infection frozen after cell culture. FLU OIA demonstrated 91.4% sensitivity and 92.3% specificity for nasopharyngeal aspirates and 50.0% sensitivity and 91.7% specificity for throat swabs diluted in viral transport media. Nasopharyngeal aspirates showed higher sensitivity than throat swabs for detection of influenza virus by FLU OIA. We believe this rapid test kit is useful for the detection of influenza A and B viruses.     

Epidemiology and Molecular Analyses of Influenza B Viruses in Senegal from 2010 to 2019

Influenza virus types A and B are responsible for acute viral infections that affect annually 1 billion people, with 290,000 to 650,000 deaths worldwide. In this study, we investigated the circulation of influenza B viruses over a 10-year period (2010–2019). Specimens from patients suspected of influenza infection were collected. Influenza detection was performed following RNA extraction and real-time RT-PCR. Genes coding for hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) of influenza B viruses were partially sequenced, and phylogenetic analyses were carried out subsequently. During the study period, we received and tested a total of 15,156 specimens. Influenza B virus was detected in 1322 (8.7%) specimens. The mean age of influenza B positive patients was 10.9 years. When compared to reference viruses, HA genes from Senegalese circulating viruses showed deletions in the HA1 region. Phylogenetic analysis highlighted the co-circulation of B/Victoria and B/Yamagata lineage viruses with reassortant viruses. We also noted a clear seasonal pattern of circulation of influenza B viruses in Senegal.     

鸡胚法分离福建省甲型H1N1流感病毒及分离株特征

目的建立甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法,了解病毒分离株特征,为疫苗制备和开展实验室常规监测等奠定基础。方法呼吸道标本接种鸡胚尿囊腔;血凝(HA)法测定收获的尿囊液中病毒滴度;逆转录PCR法检测病毒亚型特异性。使用甲醛灭活鸡胚分离物,灭活效果采用鸡胚接种法评价。血凝抑制(HI)实验检测急性期和恢复期血清,评价检测病毒感染后的免疫应答情况。结果从13份患者的呼吸道标本中分离出12株甲型H1N1流感病毒。多数病毒可在第二次传代鸡胚中分离到。病毒分离株的血凝滴度较低,为1∶1～16。阳性分离物再次接种鸡胚无法显著提高其HA效价。同鸡和人"O"型红血球比较,使用豚鼠红细胞可得到更高的血凝滴度。1‰甲醛可在24h内完全灭活病毒,但同时病毒的HA效价显著降低。病毒感染后,恢复期的HI滴度较急性期有2～16倍升高,HI抗体4倍增长需要约3w时间。结论鸡胚分离可应用于甲型H1N1流感病毒的分离,病毒的HA滴度较低。尽管甲醛可迅速灭活病毒,但灭活后病毒抗原血凝效价难以维持。病毒感染后,特异性血凝抗体产生较慢,同时滴度较低。基层实验室采用豚鼠血球更适合于病毒的HA滴度测定。     

尼帕病毒巢式RT-PCR方法的建立和初步应用

目的 建立灵敏、特异的检测尼帕病毒的巢式RT-PCR方法。方法 根据GenBank公布的尼帕病毒N基因序列,设计2对特异性引物(外引物和内引物),建立巢式RT-PCR方法,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行临床样品的检测。结果 该方法扩增的片段序列与源序列同源性均为100%。特异性试验结果表明本试验设计的内外侧引物不能从新城疫病毒、牛瘟病毒和日本乙型脑炎病毒中扩增出条带。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测出的标准模板RNA浓度为39 fg/μL。100份临床样品检测结果全部为阴性。结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测尼帕病毒 N基因的巢式RT-PCR方法,可用于动物疫病监测和检验检疫等领域。