Cdk5在肾小球足细胞中的表达及作用

目的研究周期素依赖性蛋白激酶-5（Cdk5）及其激活剂p35在肾小球足细胞中的表达及作用。方法分别培养原代小鼠神经细胞、原代小鼠分化成熟的离体足细胞（简称足细胞）以及人胚肾细胞（HEK293细胞）,应用免疫印迹、免疫沉淀及同位素标记等方法检测Cdk5、p35的表达及Cdk5的活性;以原代小鼠分化成熟的离体足细胞为研究对象。分为正常组、ROS组（Cdk5．活性抑制组）、Cdk5siRNA组（Cdk5表达沉默组）,观察Cdk5的表达及活性,并应用Cdk5 siRNA、Cdk5化学抑制剂-Roscovitine进行抑制实验。结果离体培养原代小鼠分化成熟的足细胞中均有Cdk5及p35蛋白的表达;Cdk5在足细胞中具有活性;沉默Cdk5表达、应用Cdk5活性抑制剂Roscovitine抑制Cdk5活性后,可引起足细胞特异性标志物WT1的表达减少,说明足细胞受到损伤,数量减少。结论Cdk5的表达及活性在维持正常足细胞功能中起重要作用。     

周期素依赖性蛋白激酶5过度活性与肾小球足细胞凋亡的关系研究

目的 通过在肾小球足细胞中转染p25基因,探讨周期素依赖性蛋白激酶5（Cdk5）的活性对足细胞结构及功能的影响。方法 2014年度,于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养分化成熟的小鼠离体足细胞,将足细胞分为对照组、空转染组和p25转染组。应用pAdTrack-CMV病毒载体克隆p25基因,并转染足细胞,48 h收集细胞;采用Western blotting法测定Cdk5、p25、p35及细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3的表达水平;应用免疫沉淀和同位素γ-32P标记法测定Cdk5活性;足细胞免疫荧光化学染色,观察Cdk5、p35在足细胞中的表达,以及足细胞Actin的排列情况。结果 HEK293细胞Cdk5表达阳性,p35表达阴性,肾脏皮质、足细胞和肾小球中均有不同程度的Cdk5和p35的表达。对照组和空转染组p25表达阴性,p25转染组p25表达阳性。各组细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3表达水平和Cdk5活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中p25转染组细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase3表达水平和Cdk5活性高于对照组和空转染组（P＜0.05）。p25转染组足细胞内Actin排列紊乱,细胞形态发生异常改变,对照组和空转染组细胞内Actin排列正常,细胞形态没有发生改变。结论 p25引起Cdk5过度活性可致肾小球足细胞形态改变,Actin排列紊乱,诱发细胞凋亡。因此,Cdk5的活性在维持足细胞正常结构和功能方面发挥重要作用。     

抑制细胞周期素依赖性蛋白激酶5对小鼠足细胞凋亡的影响

目的探讨细胞周期素依赖性蛋白激酶5(Cdk5)在高糖刺激体外培养小鼠足细胞中的表达及抑制Cdk5表达对高糖诱导足细胞凋亡的影响。方法 (1)体外培养条件性小鼠足细胞,分为正常糖组、甘露醇组、高糖组,高糖组按不同刺激时间分为0、6、12、24、48h5组,应用蛋白质印迹(Western blot)法检测足细胞中Cdk5蛋白表达水平。(2)应用Cdk5miRNA干扰质粒抑制足细胞中Cdk5基因的表达水平。分别设立:NG组(正常糖);HG组(高糖);HG+S组(高糖+Scrambled阴性质粒);HG+C组(高糖+Cdk5miRNA质粒)。以上各组细胞培养48h后,应用流式细胞术和末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL)法检测足细胞凋亡水平,Western blot法检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和分裂型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表达水平。结果与正常糖组相比,高糖刺激后,足细胞中Cdk5的蛋白表达水平明显增加(P<0.05)。Cdk5miRNA干扰质粒能显著抑制足细胞中Cdk5的表达水平。与HG组和HG+S组相比,HG+C组足细胞凋亡率显著降低(P<0.05),凋亡相关蛋白cleaved caspase-3蛋白表达水平和Bax/Bcl-2蛋白表达比率也有明显降低(P<0.05)。结论高糖刺激可以增加足细胞中Cdk5蛋白的表达水平;抑制Cdk5表达可以降低高糖刺激诱导的足细胞凋亡。     

Cdk1在HepG2细胞的表达及活性对肝癌细胞凋亡的影响

目的观察Cdk1蛋白表达及其活性对肝癌细胞凋亡的影响。方法克隆Cdk1基因质粒和Cdk1siRNA,并将其转染到肝癌HepG2细胞中,另外应用roscovintine（Cdks的抑制剂）刺激细胞,然后给予紫外线（UV）照射。用Western Blot检测转染的Cdk1蛋白的表达,用核素标记测定其活性;用HO 33342（Hoechst 33342）的免疫荧光染色细胞核判断细胞凋亡的情况。分析Cdk1蛋白表达及活性对肝癌细胞凋亡的影响。结果 Cdk1可以在HepG2良好地表达;Cdk1siRNA可以有效地沉默Cdk1的表达;roscovintine可抑制Cdk1的活性;细胞凋亡率在roscovintine刺激细胞时最高比较Cdk1转染细胞组和Cdk1siRNA转染细胞组（P〈0.01）,在Cdk1转染细胞高于Cdk1siRNA转染细胞组（P〈0.01）和空载体转染细胞组（P〈0.05）,在Cdk1siRNA转染细胞最低。结论过度表达Cdk1可以增加肝癌细胞死亡,抑制肝癌的增殖。抑制Cdk1活性可更有效增加肝癌细胞死亡,抑制肝癌的增殖,可望成为研究和探讨肝癌靶点之一。     

环氧合酶-2基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响

目的观察足细胞环氧合酶-2（COX-2）基因敲低对足细胞凋亡及nephrin蛋白表达的影响。方法（1）以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象：分为正常对照组、5μl的siRNA组、10μl的siRNA组、15μl的siRNA组。经诱导分化成熟,在干扰48h后用半定量RT-PCR和Westernbolt分别检测COX-2mRNA及蛋白表达水平,用流式细胞仪检测足细胞凋亡水平。（2）以10μl的siRNA组作为研究对象,分别设立足细胞正常对照组、足细胞COX-2基因敲低组和足细胞阴性转染对照组,用Westernboh检测nephrin蛋白、BAX蛋白及BCL-X1蛋白的表达水平。结果（1）与正常对照组比较,随着干扰浓度的增加,COX-2mRNA及蛋白表达逐渐减少,而足细胞的凋亡率逐渐升高,15μ1的siRNA组凋亡率明显增高。（2）lμlCOX-2siRNA转染组nephrin蛋白表达显著低于阴性转染组（P〈0．05）。（3）与阴性转染组相比,10IxlCOX-2siRNA转染组Bax蛋白表达显著上调,而Bcl-xl蛋白表达稍有下调。结论敲低COX-2的基因表达可以导致足细胞凋亡,并随着干扰浓度的增加,足细胞凋亡率逐渐增加;在干扰浓度为10μl时,足细胞nephrin蛋白的表达下调;BAX蛋白上调及BCL-X1蛋白下调参与了足细胞的凋亡。     

Cdk5和TGF-β1在糖尿病肾病足细胞中的表达及其作用

目的应用糖尿病肾病模型,观察周期素依赖性蛋白激酶5(Cdk5)和转化生长因子-β1(TGF-β1)在糖尿病肾病足细胞中的表达及其在足细胞损伤中的作用。方法分实验组和对照组2组,实验组,应用13周db/db小鼠作为糖尿病肾病小鼠模型;对照组,应用13周C57BL/6J小鼠作为正常对照模型。相同条件下喂养小鼠,1周后处死,取小鼠肾脏组织切片,免疫组化染色方法测定小鼠足细胞中TGF-β1、Cdk5及肿瘤蛋白-1(WT1)的表达,并进行统计学分析。结果实验组(db/db小鼠)足细胞中Cdk5表达水平(0.30±0.03)较对照组(0.27±0.25)明显升高(P<0.05);TGF-β1表达水平(0.26±0.03)较对照组(0.23±0.02)明显升高(P<0.05);足细胞特异性标志物WT1表达水平实验组(0.23±0.12)较对照组(0.26±0.02)明显降低(P<0.05)。结论糖尿病肾病小鼠足细胞中Cdk5和TGF-β1表达增多,可能是导致足细胞数量减少的原因,说明Cdk5、TGF-β1与足细胞凋亡机制密切相关。     

胎球蛋白–A调控糖尿病肾病 足细胞损伤机制研究

目的 研究胎球蛋白–A（fetoglobulin–a,Fetuin–A）调控糖尿病肾病足细胞的损伤机制。方法 选取健康SD成年大鼠5只,获取大鼠肾小球基膜（glomerular basement membrane,GBM）足细胞,分为上调Fetuin–A组、下调Fetuin–A组。采用反转录–聚合酶链反应（real time polymerase chain reaction,RT–PCR）技术检测Fetuin–A、足细胞表达,观察细胞增殖、凋亡,免疫组化法检测肾组织肿瘤坏死因子–α（tumor necrosis factorα,TNF–α）、混合系列蛋白激酶结构域蛋白（mixed–lineage kinase domain–like protein,MLKL）、受体相互作用蛋白激酶1（receptor–interacting protein kinase 1,RIPK1）水平,蛋白质印迹（Western blot,WB）法检测Wilms瘤基因1（wilms,tumor gene 1,WT1）、特异蛋白1（specific protein 1,Sp1）表达水平。结果 与对照组比较,下调Fetuin–A组Fetuin–A、TNF–α、MLKL、RIPK1表达水平、细胞吸光度值、细胞凋亡率均较低,WT1、Sp1表达水平较高;上调Fetuin–A组Fetuin–A、TNF–α、MLKL、RIPK1表达水平、细胞吸光密度值、细胞凋亡率均较高,WT1、Sp1表达水平较低（P<0.05）;与下调Fetuin–A组比较,上调Fetuin–A组Fetuin–A、TNF–α、MLKL、RIPK1表达水平、细胞吸光度值、细胞凋亡率较高,WT1、Sp1表达水平较低（P<0.05）。结论 Fetuin–A靶向作用于Sp1抑制足细胞生长失常。     

MIF基因沉默对肝癌细胞系增殖凋亡及ERK/RSK2信号通路的影响

目的探讨RNA 干扰介导的巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因沉默对肝癌细胞系SMMC-7721与HepG2 凋亡的影响及可能的作用机制。方法将MIF-siRNA 干扰序列转染SMMC-7721 与HepG2 细胞,以Con-siRNA序列转染的细胞作为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）及Western blot检测MIF沉默效果,CCK-8 法测定细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率。采用Western blot检测MIF 沉默后凋亡相关基因BCL-2、BAX、P53 的蛋白水平及细胞外信号调节激酶（ERK）、P90 核糖体s6 激酶2（RSK2）、糖原合成激酶3β（GSK3β）、Bad 蛋白水平及其磷酸化水平。结果沉默组细胞中MIF mRNA 及蛋白表达水平与对照组比较,差异有统计学意义（p <0.05）,沉默组低于对照组;两组细胞增殖能力比较,差异有统计学意义（p < 0.05）,MIF沉默组细胞增殖能力低于对照组;两组凋亡率比较,差异有统计学意义（p <0.05）,MIF沉默组细胞凋亡率高于对照组;两组细胞BAX、P53、BCL-2 蛋白水平比较,差异有统计学意义（p <0.05）,MIF 沉默组细胞BAX、P53 的蛋白表达水平高于对照组,而BCL-2 蛋白水平低于对照组;沉默组与对照组细胞中ERK、RSK2 及Bad 蛋白水平比较,差异均无统计学意义（p >0.05）,而沉默组与对照组细胞中GSK3β、p-GSK3β、p-ERK、p-RSK2 及p-Bad 蛋白水平比较,差异均具有统计学意义（p <0.05）。结论MIF 基因沉默抑制SMMC-7721与HepG2细胞的增殖能力并促进细胞凋亡可能是通过调节ERK/RSK2信号通路实现的。     

Cdk5与VEGF在糖尿病肾病小鼠肾小球足细胞中的表达及相关性研究

目的探讨周期素依赖性蛋白激酶5(Cdk5)和血管内皮生长因子(VEGF)在糖尿病肾病肾小球足细胞中的表达及相关性。方法选用db/db小鼠作为实验组(n=5),C57BL/6J小鼠作为对照组(n=5),2组小鼠在相同的饲养条件下,饲养至第14周并将其处死,取其肾脏,组织切片,采用免疫组化染色法测定Cdk5和VEGF表达并半定量分析。结果实验组、对照组小鼠Cdk5的表达均主要沿肾小球基底膜及足细胞分布,但实验组的表达强度高于对照组(实验组MOD值0.510±0.024,对照组MOD值0.486±0.023,P<0.05);对照组小鼠VEGF仅在足细胞有较弱表达(MOD值0.249±0.015 3),而实验组VEGF除了在肾小球足细胞阳性表达外,还可见系膜区阳性表达且表达强度明显增加(MOD值0.276±0.020),差异有统计学意义(P<0.05);Cdk5与VEGF表达的MOD值呈正相关(r=0.99)。结论 Cdk5和VEGF在糖尿病肾病肾小球足细胞中表达均增加,两者呈正相关关系,提示Cdk5和VEGF可能参与DN的发生发展。     

蛋白激酶5过度激活诱发β细胞凋亡和调节胰岛素分泌的机制研究

目的探讨高糖诱导细胞周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)过度激活在胰岛β细胞凋亡及胰岛素分泌调节中的作用机制。方法体外培养Min6小鼠胰岛β细胞。采用不同浓度的葡萄糖(5 mmol/L组、20 mmol/L组和30mmol/L组)刺激胰岛β细胞6 h,收取和固定细胞,行免疫印迹和免疫荧光法测定p35的表达;将p35基因克隆到腺病毒载体中,将p35病毒和空载体病毒(EV)分别转染到胰岛β细胞中(p35组和EV组),测定p35蛋白表达、CDK5活性及胰岛素分泌水平;采用CDK5抑制剂(p35+Ros组)进行抑制试验;采用细胞凋亡相关抗体Cleavedcaspase 3测定胰岛β细胞凋亡。结果 20 mmol/L组和30 mmol/L组p35的表达较5 mmol/L组升高,30 mmol/L组p35的表达较20 mmol/L组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同浓度葡萄糖培养的胰岛β细胞CDK5的表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。20 mmol/L组和30 mmol/L组胰岛β细胞CDK5活性较5 mmol/L组增高,30 mmol/L组胰岛β细胞CDK5活性较20 mmol/L组增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。20 mmol/L组和30 mmol/L组在刺激6 h较2 h胰岛素分泌均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。p35组p35表达较EV组增高,p35组可见p25条带,p35组CDK5活性较EV组增高,p35组胰岛素分泌水平较EV组增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。EV组和p35+Ros组细胞凋亡相关抗体Cleaved caspase 3表达较p35组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。EV组和p35+Ros组胰岛素分泌较p35组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论高浓度的葡萄糖可以抑制胰岛细胞正常分泌胰岛素。高糖环境下p35的表达增加进而诱发p25的表达,引起CDK5的过度激活和胰岛细胞的凋亡从而抑制胰岛素的分泌,可能是其作用机制之一。     

人参皂甙Rg1对Cdk5的调控在海马神经元放射性损伤防护中的意义

目的 探讨人参皂甙Rg1对Cdk5的调控在海马神经元放射性损伤防护中的意义.方法 通过建立放射性脑损伤的体内模型,将40只实验大鼠按随机数字表法分为4组,每组10只,即：0Gy组（简称空白组）,单纯人参皂甙Rg1预处理组（简称对照组）,30Gy组（简称模型组）,30Gy＋人参皂甙Rg1预处理组（简称中药组）,分离、培养海马神经元,用4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核方法检测各组海马神经元凋亡情况,采用Western blot检测p35、p25蛋白表达以及应用Cdk5抑制剂roscovitine抑制Cdk5,观察阻断Cdk5后X射线对各组海马神经元损伤的改变.结果 与空白组比较,对照组的核固缩百分数、神经元存活数目、p35、p25蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）,模型组与中药组的核固缩百分数、p35、p25蛋白水平则明显升高,神经元存活数目明显降低,且差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,中药组的核固缩百分数、p35、p25蛋白水平明显降低,神经元存活数目则明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;单就各组＋二甲基亚砜（DMSO）而言,与空白组＋ DMSO比较,对照组＋DMSO的核固缩百分数差异无统计学意义（P＞0.05）,模型组＋DMSO与中药组＋DMSO则明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组＋ DMSO比较,中药组＋DMSO的核固缩百分数明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 人参皂甙Rg1可通过调控Cdk5,降低神经元凋亡,而在海马神经元放射性损伤中发挥防护作用.     

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35（IL-35）基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过（Gly4Ser）3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b（＋）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b（＋）-IL-35在BL21（DE3）中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。     

吲哚胺2,3-二氧化酶对小鼠同种异体肝细胞脾内移植的作用

目的：研究携带吲哚胺2,3-二氧化酶（IDO）的小鼠肝细胞在同种异体脾内的表达及对脾淋巴细胞的凋亡作用。方法分离BABL/c小鼠肝细胞,肝细胞脾内移植（BABL/c→C57BL/6）,分为4组：Ⅰ组为携带IDO组;Ⅱ组为1-甲基色氨酸组;Ⅲ组为空壳腺病毒组;Ⅳ组为单纯肝细胞移植组。移植术后第2,5d取脾脏免疫组织化学检测IDO表达情况,TUNEL检测脾脏淋巴细胞凋亡情况。结果携带IDO腺病毒转染肝细胞后,能有效表达IDO。免疫组织化学显示,Ⅰ、Ⅱ组脾脏有IDO阳性的肝细胞。与其他组比较,移植术后第2,5dⅠ组淋巴细胞凋亡差别有统计学意义（P＜0．05）,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组之间比较,差别无统计学意义（P＞0．05）。结论携带IDO的肝细胞能在小鼠同种异体脾内稳定表达,并能诱导脾内淋巴细胞的凋亡。     

p35在胰岛β细胞中的表达及作用

目的研究细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)及其激活剂p35在胰岛β细胞中的表达及作用。方法分别离体培养小鼠胰岛β细胞株、Min6细胞、神经细胞及HEK293细胞,使用RT-PCR、免疫印迹和免疫沉淀等方法检测p35的表达及CDK5活性,并以小鼠胰岛β细胞株、Min6为研究体系,分为正常组(p35组)及p35+Ros组(CDK5活性抑制组),分别检测p35表达、CDK5活性及其对胰岛素分泌的影响。结果①体外培养的胰岛β细胞中,p35在mRNA和蛋白水平均有表达;②p35在胰岛β细胞通过形成CDK5/p35复合物激活CDK5的活性;③过度表达的p35可以使CDK5的活性增加3～4倍,明显抑制胰岛素分泌;④在p35组加入CDK5抑制剂Roscovi-tine(Ros),可抑制p35/CDK5的活性,增加胰岛素的分泌,说明CDK5的活性可抑制胰岛素分泌。结论结果证实p35在胰岛β细胞有表达,并通过激活CDK5的活性、调节胰岛素的分泌,可能在糖尿病胰岛β细胞的损伤机制中起重要作用。     

雄激素受体敲除小鼠睾丸生精功能变化及p63的表达

目的 研究雄激素受体（AR）敲除小鼠睾丸生精功能及p63在曲细精管中表达的改变.方法 采用雄性Flox-AR小鼠与雌性ACTB-Cre小鼠交配,并敲除胚胎中AR,筛选AR敲除（AR敲除组）和AR未敲除（对照组）雄性小鼠各10只,对比睾丸曲细精管生精功能及p63的表达.结果 两组小鼠曲细精管内径、管周膜厚度、管壁生殖细胞层数、生殖细胞成熟度评分及总Makler评分之间差异均有统计学意义（P＜0.05）,p63的阳性表达主要位于精原细胞及精母细胞,精子细胞及成熟精子中表达呈阴性,且AR敲除组表达阳性率及HSCRE评分均显著低于对照组（P＜0.01）.结论 AR表达与小鼠睾丸曲细精管p63表达关系密切,AR敲除小鼠睾丸曲细精管生精功能受损、p63表达下调,p63调控生殖细胞的早期分化.     

Nrf2和Trx1在华支睾吸虫感染小鼠肝脏中表达的初步研究

目的分析华支睾吸虫感染小鼠肝脏中Nrf2和Trx1编码基因的表达情况,初步探讨Nrf2及Trx1在华支睾吸虫致病过程中的作用。方法选用健康Balb/c小鼠建立华支睾吸虫感染模型,分别在实验第0、3、5、7、10、14、21、28和35d摘除小鼠眼球采血,分离血清,检测血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性;颈椎脱臼处死小鼠取肝脏,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝脏中Nrf2和Trx1的m RNA表达情况。结果与对照组相比,感染组小鼠在感染第5、7、10、14、21和35d血清ALT活性显著升高(P0.05);分别为(19.9332±1.98180)U/L、(64.3699±14.53874)U/L、(46.7455±6.27572)U/L、(99.0038±25.34329)U/L、(46.7590±8.85478)U/L和(50.3374±14.19886)U/L。感染组小鼠抗氧化应激通路上游基因Nrf2和下游Trx1的m RNA表达升高;其中Nrf2在感染第5天升高显著(P0.05);Trx1在感染第21d升高显著(P0.05)。结论 Nrf2和Trx1 m RNA在华支睾吸虫感染过程中表达升高,提示Nrf2/Trx1通路可能在华支睾吸虫致病过程中发挥一定的作用。     

小鼠肾脏足细胞的原代培养和鉴定

目的：建立可操作性好、简单易行且效率较高的小鼠肾脏足细胞分离及原代培养模式,为其进一步研究奠定基础。方法：取C57/BL6J小鼠肾脏,通过差异过筛法获取300目筛的肾小球,用制备好的KI-3T3培养基重悬肾小球后静置于铺被鼠尾胶原的培养皿中,4 d后开始换液,7 d后开始胰蛋白酶消化肾小球,并开始足细胞传代培养。5~7d传代1次,传代2~3次后收集细胞鉴定。采用倒置扭转显微镜观察小鼠肾脏足细胞形态表现,采用PCR法检测小鼠肾脏足细胞中nephrin,podocin和P-cadherin的表达。结果：肾小球种植3 d后可见足细胞从组织中爬出,足细胞传代培养7 d后在倒置相差显微镜下可观察到细胞胞体有突起生长。PCR法检测,分离培养的足细胞表达nephrin、podocin和P-cadherin。结论：差异过筛结合消化酶技术能够成功分离培养C57/BL6J小鼠肾脏足细胞。     

塞来昔布对嘌呤氨基核苷诱导的足细胞凋亡中COX-2表达水平的影响

目的:旨在通过特异性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对嘌呤氨基核苷诱导的足细胞凋亡中足细胞COX-2表达水平变化的影响,初步探讨特异性COX-2抑制剂对足细胞保护作用的机制。方法:以条件永生性小鼠足细胞为研究对象,分为6组:正常对照组(CON)、嘌呤霉素氨基核苷组(PA)、地塞米松组(DEX)、塞来昔布组(CELE)、地塞米松+嘌呤氨基核苷组(DEX+PA)、塞来昔布+嘌呤氨基核苷组(CELE+PA),分别于0h、8h、24h和48h四个时间点用Hoechst 33258染色检测足细胞凋亡率,24h抽提蛋白用于Western blot检测COX-2的蛋白表达。结果:PA组与正常对照组相比细胞凋亡率明显增多(P<0.001),DEX+PA、CELE+PA组与PA组比较细胞凋亡率明显减少(P<0.05);正常对照组表达COX-2,用PA诱导凋亡后,24h时COX-2表达明显增加,用CELE、DEX干预后COX-2表达水平有所减少(P<0.05)。结论:特异性COX-2抑制剂CELE可以减少PA诱导的足细胞的凋亡率;CELE抑制PA诱导的足细胞凋亡的作用机制可能与CELE对足细胞所表达的COX-2水平变化的影响有一定的相关性。     

小鼠肾血管球和肾小囊的生长曲线

目的研究小鼠肾小体发生发育过程中血管球和肾小囊体积的增长规律。方法光镜下应用体视学方法对胚胎和生后发育期小鼠肾血管球和肾小囊的绝对和体积进行测量。结果从胚龄16天到生后40天血管球体积增大约86倍,肾小囊体积增大约32倍。生后7天之前,血管球的相对体积增大迅速,而肾小囊的相对体积减小迅速,之后二者变化平缓。结论肾小体发育中血管球和肾小囊的体积变化为肾小体的滤过功能的逐渐成熟提供了形态结构基础。