骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养种子细胞特征及体内成软骨活性

目的：组织工程技术为解决关节软骨缺损修复这一难题提供了新的思路，但至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求。探讨以自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养为种子细胞修复关节软骨缺损的可行性，并评价修复效果。 方法：实验于2005-03/2006-02在兰州大学骨科研究所组织工程实验室和连云港市东方医院骨科实验室完成。①取浓度为3×108 L-1的第2代骨髓间充质干细胞和软骨细胞，按2:1比例混匀共培养作为种子细胞，观察细胞的增殖和基质合成，绘制细胞生长曲线。②将细胞终浓度为3×108 L-1的共培养细胞加入含有同种异体脱钙骨基质的24孔培养板中进行接种培养2，4，6 d，计算共培养细胞与脱钙骨基质的黏附率。③取54只青紫兰兔制备全层关节软骨缺损模型，随机分为实验组、脱钙骨基质对照组、空白对照组，每组18只。实验组于软骨缺损处植入同种异体脱钙骨基质与共培养细胞；脱钙骨基质对照组植入脱钙骨基质；空白对照组不作任何植入。移植术后6，12周取出膝关节对修复组织进行大体、组织学评分和免疫组织化学观测。 结果：54只青紫兰兔均进入结果分析。①共培养的软骨细胞基质合成丰富，细胞增殖加快。脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养第2，4，6天的黏附率分别为（46.50±1.40）%，（93.25±2.89）%和（88.34±0.76）%。②大体观察结果：实验组缺损修复组织呈软骨样，表面光滑平坦，与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟，修复组织与软骨下骨结合牢固。脱钙骨基质对照组、空白对照组的修复组织呈纤维组织和无修复。③组织学评分：实验组优于脱钙骨基质对照组、空白对照组，差异具有显著性意义（P﹤0.01），脱钙骨基质对照组与空白对照组比较差异无显著性意义（P﹥0.05）。④免疫组织化学染色显示实验组修复组织的细胞为透明软骨样细胞，柱状排列，Ⅱ型胶原染色阳性，与周围软骨及软骨下骨整合良好。 结论：自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养作为种子细胞，骨髓间充质干细胞能增强软骨细胞的增殖，促进软骨细胞基质合成，缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数，可节省大量的软骨细胞，与脱钙骨基质复合后能有效修复关节软骨缺损。     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化*

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出“同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨”的实验设技。 目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。 结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01)。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。     

外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响*

摘要 背景：透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢？ 目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。 方法：全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21 d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。 结果与结论：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。 关键词：透明质酸;骨髓间充质干细胞;软骨细胞;分化;细胞外基质 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.03.001     

不同脱钙程度的骨基质材料对骨髓基质干细胞增殖的影响

背景：脱钙骨基质（Demineralized bone matrix,DBM）具有天然网状孔隙结构,有较好的可塑性和生物相容性,是良好的软骨组织工程支架材料。国内已将DBM作为支架材料来修复软骨缺损,但报道制备DBM所用的脱钙时间不同,目前尚无脱钙时间对软骨形成方面的系统研究,故本研究用Urist方法制得不同脱钙时间的DBM,并探讨其对骨髓基质干细胞（bone marrow stromal stem cells, BMSCs）增殖的影响。目的：比较不同脱钙时间的DBM对兔BMSCs增殖的影响,为组织工程软骨找到最佳支架材料。设计、时间及地点：观察性实验,2007年－10月～2008年－1月在昆明医学院干细胞所完成材料：兔第三代骨髓基质干细胞 脱钙骨基质（DBM）方法：将日本成年大白兔髂骨按Urist方法脱钙6h, 12h和24h制得的DBM用扫描电镜观察其孔径大小,孔隙率。取上述脱钙6h, 12h和24h三个时间段的DBM各24块,分别置于6块24孔培养板中,将细胞密度为5x106/mL兔的第三代BMSCs接种于24孔培养板的材料上,培养箱中培养。分别在第2、4、6、8、10、12d时取出一块板进行MTT法测定。另将脱钙6h, 12h和24h三个时间段的DBM各4块,复合细胞培养后,在培养第2d及测得OD值最大的时间点分别各取出材料各2块,扫描电子显微镜下观察细胞在材料上黏附、增殖情况。主要观测指标：BMSCs细胞形态,DBM的孔隙率、孔径,MTT法测定OD值,扫描电镜下观察细胞在材料上黏附、增殖情况。结果：统计学分析脱钙6h, 12h和24h三个时间段DBM的孔隙率、孔径大小无统计学差异。兔BMSCs与DBM联合培养,发现BMSCs与脱钙6h的DBM复合更为紧密,DBM显示出更好的细胞相容性。SEM观察比较,附于脱钙6h的DBM上生长BMSCs最多。结论： 1. 脱钙骨基质具有天然网状孔隙结构、具有良好的细胞相容性;2. 分别脱钙6h、12h、24h的DBM的孔隙率、孔径大小没有差异;3. 脱钙6h的DBM复合BMSCs培养8d 后BMSCs增殖达到稳定,适合移植; 4. 脱钙时间对BMSCs在DBM上的增殖有影响,以脱钙6h的DBM活性最好     

骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景：半月板损伤后自行修复能力有限，组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞。 目的：观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性。 方法：采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞。取第3代的骨髓间充质干细胞，实验组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化，对照组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液。在诱导第7，14，21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果。 结果与结论：①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d，第4代以后相对延长，为5~9 d。②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变。③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色，尤其细胞密集生长的区域蓝染较深，染色强度随诱导时间延长而增强。对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染。④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性，各期染色无明显差异。对照组未见Ⅱ型胶原表达，实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达。提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质，作为半月板组织工程种子细胞来源可行。     

与软骨细胞共培养和条件培养液诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的比较**

背景：骨髓间充质干细胞体外转化很大程度上依赖于合适的培养条件。目的：比较与软骨细胞共培养和条件培养液2种不同的诱导方案诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的特点。方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和耳软骨细胞,采用骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养及条件培养液诱导成软骨的方法,诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。以MTT法及流式细胞仪检测细胞活性及周期,糖胺多糖、甲苯胺蓝以及免疫组化染色检测细胞生物学特性,以RT-PCR法检测诱导后的软骨细胞Ⅱ型胶原RNA表达情况。结果与结论：采用共培养方式诱导的软骨细胞,其生物学特性与采用条件培养液诱导的软骨细胞相比,前者优于后者,如分泌糖胺多糖的能力以及基质分泌量均较高。提示共培养方式诱导的软骨细胞更接近正常软骨细胞,更有利于作为组织工程软骨的种子细胞。     

不同接种密度骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复大鼠桡骨缺损

背景：在构建种子细胞与载体材料的复合体时,种子细胞的接种密度是影响复合体成骨能力的一个重要因素,目前关于种子细胞的接种密度认识尚不统一。 目的：构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体,观察构建复合体骨髓间充质干细胞的最适接种密度。 方法：体外单层培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,以不同的细胞密度将骨髓间充质干细胞接种到异种骨基质明胶上,构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体,通过扫描电子显微镜观察细胞在骨基质明胶中的黏附生长情况。制备SD大鼠双侧桡骨骨干5 mm节段性骨缺损模型。随机分成4组,采用骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复骨缺损,所用的接种细胞密度分别为1×108 L-1、5×108 L-1、1×109 L-1、5×109 L-1。各组于第2,4,8,12周取材,通过大体观察大鼠的术肢活动情况,X射线放射学、组织学,免疫组织化学等检测方法,对骨缺损的修复情况进行评价。 结果与结论：4种细胞密度与骨基质明胶复合培养24 h,骨髓间充质干细胞在骨基质明胶上的黏附率随着细胞接种密度的增高而增高,当密度为1×109 L-1时,黏附率最高为(76.00±2.94)%,继续增加细胞密度其黏附率反呈下降趋势。复合培养7 d,扫描电子显微镜观察结果显示,材料上均有细胞黏附生长。X射线放射学评分显示,同一组别8,12周评分均高于2周评分(P < 0.01);第4,8,12周1×109 L-1组与5×109 L-1组差异无显著性意义 (P > 0.05),均高于其余两组(P < 0.01)。组织学评分结果表明,同一组别8,12周评分均高于2周评分 (P < 0.01)。结果提示,在构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体时,骨髓间充质干细胞接种密度维持在1×109 L-1最佳。     

血管内皮生长因子165基因修饰人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质构建活性组织工程皮肤

背景：利用组织工程原理构建的人工皮肤替代物用于皮肤移植可有效解决供皮不足这一难题，但组织工程皮肤很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。 目的：以血管内皮生长因子165基因修饰的人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质，拟构建活性组织工程皮肤。 设计、时间和地点：以基因工程为基础的组织构建实验，于2008-03/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：普通级新西兰大白兔5只用于提取脱细胞真皮基质原料，由南昌大学医学院动物科学部提供，人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的患者，pShuttle-CMV/VEGF165质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。 方法：无菌条件下切取兔耳全层皮肤，将2 cm×2 cm皮片置于0.25%胰酶-EDTA消化液中去掉表皮，再置入曲拉通X-100溶液使真皮细胞完全脱净，磷酸盐缓冲液反复清洗，即为脱细胞真皮基质，4 ℃保存备用。采用密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，取传至第3代细胞，按5×105/孔密度接种，待细胞达80%融合时进行脂质体介导的pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染，接种于制备好的脱细胞真皮基质上体外联合培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质的形态观察，组织工程皮肤结构观察。 结果：体外培养的骨髓间充质干细胞大部分呈梭形，基因转染后细胞形态及活性无明显影响；脱细胞真皮基质呈瓷白色，柔韧有弹性。血管内皮生长因子165基因修饰的骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质共培养2 d后，所构建的组织工程皮肤呈淡红色，质软，接种细胞生长状态正常，苏木精-伊红染色及扫描电镜观察可见在脱细胞真皮基质的间隙中有大量长梭形细胞附着生长。 结论：血管内皮生长因子165基因转染的人骨髓间充质干细胞在兔脱细胞真皮基质中生长良好，可在体外联合构建活性组织工程皮肤。     

骨髓间充质干细胞与关节软骨细胞Transwell共培养诱导形成软骨

背景：研究证实,关节软骨细胞具有分泌诱导因子促进骨髓间充质干细胞向关节软骨细胞分化的能力,但至今未见两种细胞运用Transwell共培养诱导骨髓间充质干细胞形成软骨的报道。 目的：观察在Transwell共培养系统中共培养后,关节软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞向关节软骨样细胞转化的能力。 方法：骨髓间充质干细胞来源于4周龄SD大鼠的股骨及胫骨干骨髓,关节软骨细胞来源于4周龄SD大鼠的正常股骨头表面的关节软骨。分别吸取第3代骨髓间充质干细胞和关节软骨细胞,按1∶1的细胞比例分别植于Transwell共培养系统中,下室植入骨髓间充质干细胞,上室植入关节软骨细胞。同时设置相同浓度单纯骨髓间充质干细胞对照组,分别在含胎牛血清的DMEM培养基中培养,相差显微镜下观察细胞的增殖和基质合成情况,并对各组细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组化染色及氨基聚糖含量检测。 结果与结论：共培养组骨髓间充质干细胞数量增多,细胞外基质合成丰富,其基质能被Ⅱ型胶原免疫组化染色,细胞染色呈现黄色。氨基聚糖含量随着诱导时间增加而增多。提示关节软骨细胞分泌物具有促进骨髓间充质干细胞向关节软骨样细胞转化的能力,与此同时,骨髓间充质干细胞还能分泌促进组织细胞修复的细胞因子,使共培养中的软骨细胞功能得以加强。由此可见,软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养诱导具有独特的优势。     

疏密波最佳波段组合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：已证实疏密波对病变组织有兴奋作用,能够促进病变组织的新陈代谢,课题组前期研究发现其对骨性关节炎具有良好的治疗作用。 目的：探讨疏密波诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的最佳波段组合,并从分子生物学水平阐明疏密波调控骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的机制。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2006-10/2008-03在福建中医学院中西医结合研究院完成。 材料：清洁级健康4周龄SD大鼠45只,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。疏密波发射仪由福州大学生物医学仪器研究所提供。根据同一周期疏密波比例的不同,分为以下3种工作模式：模式Ⅰ为疏波∶密波=1∶1,模式Ⅱ为疏波∶密波=2∶1,模式Ⅲ为疏波∶密波=1∶2。 方法：抽取大鼠骨髓液,用全骨髓贴壁培养法体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞。取传至第3代细胞,接种后加入含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM培养液,根据仪器工作模式的不同分为：疏密波1∶1组、疏密波2∶1组、疏密波1∶2组、空白对照组。各诱导组按干预时间的不同又分为2个亚组：诱导30 min和诱导60 min,每天诱导1次,共14 d。 主要观察指标：RT-PCR半定量分析Cbfa1 mRNA及Sox9 mRNA的表达,甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖的表达,免疫组化染色检测Ⅱ型胶原基质的表达。 结果：体外培养14 d可获得均质性较好的骨髓间充质干细胞,传至第3代CD45阳性率为1.91%,CD90阳性率为98.22%。诱导14 d后,各疏密波诱导组Cbfa1 mRNA,Sox9 mRNA均呈阳性表达,而空白对照组未表达。甲苯胺蓝染色可见诱导后细胞胞质和细胞外基质异染,空白对照组无明显异染;免疫组化染色可见各诱导组多数细胞的胞浆呈棕黄色阳性表达,且疏密波1∶2组Ⅱ型胶原的表达优于疏密波2∶1组,疏密波2∶1组优于疏密波1∶1组,空白对照组细胞为阴性表达。 结论：疏密波能诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为软骨细胞表型,且疏波∶密波=1∶2的波段组合效果最佳,其作用主要是通过上调Cbfa1 mRNA和Sox9 mRNA的表达进而促进糖胺聚糖和Ⅱ型胶原基质的表达来实现的。     

复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆煅烧骨在大鼠下颌骨缺损修复中的

背景：用于修复骨缺损的方法有直接植入、复合细胞植入以及加入生长因子植入。近年来,复合细胞植入和加入生长因子植入的研究受到比较广泛的关注。 目的：观察复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆的煅烧骨修复颌骨缺损的作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-04在青岛大学医学院附属医院中心实验室及口腔研究室完成。 材料：取成年牛长骨骨骺端,经脱脂、脱蛋白、煅烧处理后制得煅烧骨。将第3代的骨髓间充质干细胞悬液加到煅烧骨上制备煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体。将富血小板血浆因子滴加到将要植入的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体上,制得含富血小板血浆因子的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体。 方法：用牙钻在Wistar大鼠左侧下颌骨下缘备出1.0 cm×0.8 cm大小缺损,将30只大鼠随机分为3组,每组10只。对照组：将煅烧骨直接植入大鼠下颌骨缺损中。复合骨髓间充质干细胞组：将煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体植入大鼠下颌骨缺损中。复合骨髓间充质干细胞+富血小板血浆组：将含富血小板血浆因子的煅烧骨-骨髓间充质干细胞复合体植入大鼠下颌骨缺损中。 主要观察指标：观察各组煅烧骨在4,8,12周的成骨情况。 结果：复合骨髓间充质干细胞+富血小板血浆组煅烧骨在4,8,12周3个时间点的成骨情况明显优于对照组煅烧骨及复合骨髓间充质干细胞组煅烧骨(P < 0.01),对照组和复合骨髓间充质干细胞组之间的成骨情况差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：复合骨髓间充质干细胞和富血小板血浆的煅烧骨可以促进下颌骨缺损修复,增加血管化与骨化。     

藻酸盐凝胶三维培养条件下体外定向诱导骨髓间充质干细胞成软骨

目的 探讨转化生长因子β1 （TGF-β1）,软骨源性形态发生蛋白1（CDMP1）在三维条件下诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的相互作用。 方法 无菌条件下,常规消毒12-20周流产胚胎,无菌术取出股骨。用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化人胚骨髓间充质干细胞,体外培养传代。采用特定的诱导培养使骨髓间充质干细胞向软骨分化,按培养基内添加生长因子的不同分成3个实验组和对照组。实验组分别为A组CDMP1+TGF-β1（300ng/mlCDMP1、10ng/mlTGF-β1）;B组10ng/mlTGF-β1;C组300ng/mlCDMP1;D组对照组不添加任何生长因子。先进行单层细胞培养10天,再置于藻酸盐凝胶中继续培养11天,然后进行蛋白多糖含量的测定、Ⅱ型胶原的检测。 结果 第21天后,各组细胞培养的个数均有显著性差异,即A组>B组>C组>D组;21天后各组的藻酸盐支架蛋白多糖含量检测结果即A组>B组>C组>D组（P<0.05）。 结论 骨髓间充质干细胞在三维条件下,CDMP1和TGF-β1联合作用有明显的促进骨髓间充质干细胞成软骨的作用。     

人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外诱导成骨的比较

背景：由于骨形成蛋白的释放速度与新骨生长速度不匹配,单纯应用骨形成蛋白的效果尚不理想,因此,应有合适的载体来调节骨形成蛋白的释放速度。目的：观察重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用。方法：全骨髓法培养兔骨髓间充质干细胞,分别应用人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒载体及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒转染兔骨髓间充质干细胞,设定感染复数值为5×104,观察两组细胞形态改变,分别行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、茜素红染色及碱性磷酸酶含量测定,比较两组成骨活性差异。结果与结论：人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组转染骨髓间充质干细胞后,细胞形态呈现典型的成骨改变,碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色、茜素红染色均出现成骨的特征性改变。绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组未观察到上述改变。人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组碱性磷酸酶含量高于绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组(P < 0.01)。提示人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞表现出更加明显的成骨活性改变。     

BMSCs-完全脱钙骨基质体外诱导构建组织工程纤维软骨

背景：半月板损伤后自行修复能力有限,组织工程技术构建纤维软骨组织为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径。目的：观察猪骨髓间充质干细胞与完全脱钙骨基质在体外诱导培养成纤维软骨组织并检测其凋亡。 方法：采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞,取第1代骨髓间充质干细胞并将细胞密度调整到1?07 /ml,均匀接种到完全脱钙骨基质上,37℃孵育4 h后以含有TGF-β1、IGF-Ⅰ、地塞米松、抗坏血酸及10%FBS的高糖DMEM诱导培养液培养作为试验组,单层诱导培养BMSCs作为对照组Ⅰ,单层基础培养的BMSCs作为对照组Ⅱ,空白完全脱钙骨基质为对照组Ⅲ,在培养第1、2、3、4周分别进行大体形态观察以及Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的RT-PCR定性检测;培养4周样本分别进行凋亡检测。 结果与结论：试验组可检测到Ⅰ型胶原的持续表达,Ⅱ型胶原及Aggrecan的表达逐渐增加。对照组Ⅰ可检测到Ⅱ型胶原及Aggrecan的表达及Ⅰ型胶原的持续表达,但表达量远低于试验组;培养4周样本凋亡检测显示试验组凋亡高于对照组Ⅰ,对照组Ⅰ与对照组Ⅱ凋亡无差异。TGF-β1、IGF-Ⅰ体外诱导培养的MSCs-完全脱钙骨基质可以表达特异性软骨基质,三维环境培养细胞外基质的表达量明显高于单层诱导培养;静态培养系统对三维培养的细胞凋亡有影响。     

40001/间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学研究

背景：大块软骨损伤目前临床上尚无方法治疗,干细胞技术出现后为解决这一难题提供了理论支持。采用新型的支架材料“壳聚糖-胶原蛋白”结合干细胞诱导分化移植给动物模型是一种较新的尝试。 目的：观察壳聚糖-胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学变化。 方法：体外培养扩增兔骨髓间充质干细胞。采用软骨诱导分化培养基对P2代细胞进行成软骨诱导。同时制备“壳聚糖-胶原蛋白”支架和兔关节软骨缺损模型。缺损用含有骨髓间充质干细胞的壳聚糖-胶原凝胶填充,另一条关节用没有细胞的支架或不做处理。其中12个关节作为实验组(接受骨髓间充质干细胞+支架),8个关节作为空白对照组(不做处理),8个关节作为单纯支架组(未植入细胞)。造模后于2,4,8,16周进行组织学评分并处死动物行组织学染色。 结果与结论：造模后16周移植的细胞一致分化为软骨细胞,大部分软骨缺损区被新生软骨修复,组织学评分实验组关节修复良好。提示应用骨髓间充质干细胞结合“壳聚糖-胶原蛋白”复合物可以修复关节软骨缺损。 关键词：壳聚糖-胶原凝胶;兔;骨髓间充质干细胞;软骨缺损;组织学变化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.25.006     

成人骨髓基质干细胞体外诱导为许旺细胞的实验研究

目的　探索成人骨髓基质干细胞 (h MSCs)诱导分化为许旺细胞 (Schwann cell,SC)的可行性 ,奠定组织工程学治疗周围神经疾病的理论基础。方法　采取 Ficoll-paque梯度离心骨髓 ,分离 h MSCs,经过纯化、扩增培养 ,并证实其细胞来源 ;之后采用 BHA、RA及 Forskolin、b FGF、PDGF、HRG顺次诱导、培养 ,经免疫组化鉴定S-10 0、GFAP的表达状况。结果　经过预诱导剂及诱导剂的先后作用 ,h MSCs的细胞形态发生明显改变 ,胞体呈长梭形 ,两极有丝状突起形成 ,经免疫组化的证实 ,S-10 0、GFAP阳性表达率分别为 (75%± 6.2 % )和 (67%± 4.5% )。结论　 h MSCs经诱导后 ,细胞形态、体积大小均发生明显改变 ,S-10 0、GFAP染色呈阳性 ,符合许旺细胞形态和功能特征 ,证实 h MSCs可以作为种子细胞转化为许旺细胞 ,促进周围神经疾病的愈合     

Bone marrow mesenchymal stem cells stimulated with low‐intensity pulsed ultrasound: Better choice of transplantation treatment for spinal cord injury

Stem cell transplantation, especially treatment with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), has been considered a promising therapy for the locomotor and neurological recovery of spinal cord injury (SCI) patients. However, the clinical benefits of BMSCs transplantation remain limited because of the considerably low viability and inhibitory microenvironment. In our research, low‐intensity pulsed ultrasound (LIPUS), which has been widely applied to clinical applications and fundamental research, was employed to improve the properties of BMSCs. The most suitable intensity of LIPUS stimulation was determined. Furthermore, the optimized BMSCs were transplanted into the epicenter of injured spinal cord in rats, which were randomized into four groups: (a) Sham group (n = 10), rats received laminectomy only and the spinal cord remained intact. (b) Injury group (n = 10), rats with contused spinal cord subjected to the microinjection of PBS solution. (c) BMSCs transplantation group (n = 10), rats with contused spinal cord were injected with BMSCs without any priming. (d) LIPUS‐BMSCs transplantation group (n = 10), BMSCs stimulated with LIPUS were injected at the injured epicenter after contusion. Rats were then subjected to behavioral tests, immunohistochemistry, and histological observation. It was found that BMSCs stimulated with LIPUS obtained higher cell viability, migration, and neurotrophic factors expression in vitro. The rate of apoptosis remained constant. After transplantation of BMSCs and LIPUS‐BMSCs postinjury, locomotor function was significantly improved in LIPUS‐BMSCs transplantation group with higher level of brain‐derived neurotrophic factor (BDNF) and nerve growth factor (NGF) in the epicenter, and the expression of neurotrophic receptor was also enhanced. Histological observation demonstrated reduced cavity formation in LIPUS‐BMSCs transplantation group when comparing with other groups. The results suggested LIPUS can improve BMSCs viability and neurotrophic factors expression in vitro, and transplantation of LIPUS‐BMSCs could promote better functional recovery, indicating possible clinical application for the treatment of SCI.     

兔骨髓间充质干细胞培养及向成软骨细胞的诱导分化

背景：骨髓间充质干细胞没有理想的特异性表面标志物,对其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定。目的：体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。方法：密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,采用倒置显微镜进行形态学观察;用含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液培养细胞,每日定时进行细胞计数,观察细胞生长速度;采用流式细胞学方法分别检测原代及第3代细胞CD44、CD45、CD29的表达情况;取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞,以特定培养液诱导(含体积分数为10%胎牛血清、转化生长因子1 10 μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ110 μg/L、转铁蛋白6.25 mg/L、地塞米松10 mmol/L、维生素C 0.05 mmol/L),倒置显微镜下观察形态变化,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：培养的细胞长梭形,呈成纤维细胞样生长,传代细胞生长迅速。流式结果表明,原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45,第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。骨髓间充质干细胞诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21 d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原阳性细胞较多。结果显示应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。     

骨髓间充质干细胞体外培养及其归巢机制

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能的特性,体外可多次传代培养,在特定的情况下,多种因子参与调控其到达损伤的组织器官进行修复重建。目的：综述骨髓间充质干细胞归巢机制及其临床应用前景。方法：应用计算机检索1999-01/2008-12 SCI数据库相关文章,检索词为“bone marrow mesenchymal stem cell,homing,clinical,therapy”,并限定文章语言种类为English。共检索到文献66篇。结果与结论：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中除造血干细胞以外的另一类具有“无限”增殖和多向分化潜能的干细胞。在一定的诱导条件下,这类细胞可归巢到特定的组织并分化为相应组织细胞,发挥修复重建作用,此外,它还具有易提取、扩增能力强、不存在伦理问题和排斥反应等优点,由于这些优点,其将成为当今社会医学领域中很多难治之症的希望所在。     

低渗结合自然沉降法分离兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

背景：骨髓间充质干细胞数量极少,10万个骨髓有核细胞中才有1个骨髓间充质干细胞,如何成功分离并鉴定骨髓间充质干细胞是研究中的关键工作。 目的：建立完善的骨髓间充质干细胞体外分离培养体系,从细胞的形态、表型和功能方面鉴定骨髓间充质干细胞。 方法：低渗原理去除杂细胞,结合自然沉降分离骨髓间充质细胞,并对其形态学特征进行光镜观察。对骨髓间充质细胞的表型进行流式细胞仪检测。并将骨髓间充质细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行诱导分化,行形态学观察和碱性磷酸酶、Von kossa、Ⅰ型胶原、油红O染色检测。 结果与结论：实验分离获取的骨髓间充质细胞经表型鉴定为：CD29(+),CD45(-);向成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶、矿化结节染色及Ⅰ型胶原检测均为阳性;向脂肪细胞诱导后,油红O染色阳性。结果表明实验分离的骨髓间充质细胞为类成纤维细胞样非造血类干细胞,此类细胞具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的功能。