小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

小鼠endostatin基因的克隆与C6鼠脑胶质瘤的治疗

目的 克隆小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因,检测其表达蛋白的生物学活性,应用该蛋白治疗大鼠Ｃ６脑胶质瘤。方法 从小鼠胶原ＸⅧｃＤＮＡ用ＰＣＲ法克 ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ基因,重组入ＰＵＣ１９,测序后构建非融合表达载体ｐＤＨ－ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ,使其在ＤＨ５α内经温度诱导表达,纯化该表达蛋白并用鸡胚绒 囊膜 内皮细胞抑制实验检测其活性,经荷瘤大鼠皮下注射该蛋白治疗其脑胶质瘤,结果 成功获得５５１ｂｐ的ｅ     

人血小板生成素cDNA的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆人血小板生成素（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡ，并研究其在ＣＯＳ－７细胞中的表达。方法：通过ＲＴ－ＰＣＲ法获得ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ，测序后克隆到真核表达载体ｐＥＤ上，以ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ－７细胞，巨核细胞集落形成培养法测表达产物活性。结果和结论：获得的ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ和献报道的序列一致。转染细胞ＲＮＡ斑点杂交结果显示ＴＰＯ ｃＤＮＡ获得转录，转染后４８和７２ｈ的细胞上清均可测到Ｔ     

人血小板生成素cDNA转染及表达产物对实验性血小板减少症的…

目的 探讨将人血小板生成素（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞中及表达产物对实验性小鼠血小板减少症（卡铂诱导）的治疗作用。方法 以哺乳动物表达载体ＰＣＩｎｅｏ为运载体，构建受控于ＳＶ４０早期启动子ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ的表达载体，利用脂质体介导转染技术，将重组ＰＣＩｎｅｏ－ｈＴＰＯ表达载体转染ＣＯＳ－７细胞中，经Ｇ４１８作用后，对挑选阳性克隆ＣＯＳ－７细胞中ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ和ｍＲＮＡ分别进行ＰＣＲ     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

重组人β—防御素基因在COS—7细胞的转染表达

为探索建立持续稳定表达ｈＢＤ－２的哺乳类动物工程细胞的可能性,作者研究构建真核重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＣ－２以进行ＣＯＳ－７细胞转染表达实验。将本室克隆获得的ｈＢＤ－２全长ｃＤＮＡ片段插入带有报告基因的真核表达质粒ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ构建出ｈＢＤ－２的重组表达载体ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２,并经ＤＮＡ测序证明ｈＢＤ－２ｃＤＮＡ片段的插入方向和其全长ｃＤＮＡ的碱基组成顺序均准确无误。通过脂质体转染法将ｐＣＭＶ．ｔａｇ２Ｂ／ｈＢＤ－２导入ＣＯＳ－７细胞。ＲＴ－ＰＣＲ法和免疫印迹法分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白质水平检测到被转染的ＣＯＳ－７细胞系能有效表达ｈＢＤ－２。     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

sPLA2cDNA表达载体的选择和亚克隆

目的：选择适当的载体，启动Ｃａ＾２＋依赖分泌型磷脂酶Ａ２（ｓＰＬＡ２）ｃＤＮＡ的表达，为进一步研究各种因素对该酶活性的影响奠定基础。方法：首先从ｓＰＬＡ２－ｐＧＥＭ７重组体（这一重组体不能在转染的真核细胞中表达）获得人ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ，克隆该片断进入中间载体ＢＳＳＫ（使ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ两端出现ＸｂａＩ、Ｈｉｎｄ３酶切位点），选择ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓＰＬＡ２－ＢＳＳＫ重组体进行扩增，双酶消化上     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

CR3的Ⅰ结构域的克隆和在CHO细胞中的表达及配体结合特性的研究

研究白细胞整体合素ＣＲ３α亚基的Ⅰ结构域在配体结合中的作用。方法克隆ＣＤ１１ｂ的Ⅰ结构域，用重叠ＰＣＲ的方法将其与信号肽ＤＮＡ连接，克隆到表达载体ＰＥＥ６ＨＣＭＶ．ＧＳ，转化ＣＨＯ－Ｋ１细胞。表达的Ⅰ－结构域经ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ｍｏｎｏ－Ｓ柱纯化后，与Ｃ３ｂｉ进行配体结构实验。结果用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得重组的Ⅰ结构域分子量为２９ＫＤ。重组的Ⅰ结构域可以与Ｃ３ｂｉ结合，Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析     

血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

含小鼠分泌型内皮抑素基因重组质粒的构建及表达

目的:克隆小鼠分泌型内皮抑素(sEndostatin)cDNA,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,检测重组质粒在B16细胞中的表达. 方法:用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出内皮抑素cDNA,经测序证实后,连入信号肽,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,以脂质体转染小鼠B16细胞,用Western blot方法检测B16细胞上清中内皮抑素的表达.结果:测序表明扩增的分泌型内皮抑素序列与报道完全一致, Egr-1启动子和分泌型内皮抑素cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1,Western blot证实转染B16细胞上清中有目的蛋白表达.结论:小鼠内皮抑素基因成功地被克隆和表达,为今后检测pEgr-分泌型内皮抑素的辐射诱导表达和恶性肿瘤的基因-放射治疗奠定基础.     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的 :构建人NKG2D重组真核表达载体 ,并研究其在COS 7细胞中的表达。方法 :应用RT PCR ,自健康人外周血单个核细胞 (PBMC)中获取NKG2DcDNA ,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后 ,构建含目的基因的真核细胞表达质粒 ,并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS 7细胞 ,用RT PCR和流式细胞术 (FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果 :重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS 7细胞中获得表达。结论 :成功地构建了重组表达载体pcD NA3.1 NKG2D ,并实现了在COS 7细胞中的瞬时表达 ,为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

带信号肽人胰岛素原突变体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的:构建带信号肽人胰岛素原突变体的真核表达载体并在COS-7细胞表达出成熟的人胰岛素.方法:采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM),将普通细胞内furin蛋白酶的识别和切割位点Arg-X-Lys-Arg-样序列,引入人胰岛素原C肽两端,同时加上信号肽、Kozak序列和限制性内切酶的酶切位点并克隆至载体pcDNA3.1( )中,构建成人胰岛素原突变体的真核表达载体,经测序验证后转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹、放射免疫法检测其在COS-7细胞中的表达.结果:DNA测序结果表明在预期位点突变符合要求,经RT-PCR、Western印迹、放射免疫鉴定,构建的人胰岛素原突变体的真核表达载体转染的COS-7细胞可表达、分泌人成熟胰岛素.结论:构建了人胰岛素原突变体的真核表达载体,并成功地在COS-7细胞中获得人胰岛素的分泌表达.     

人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

目的：构建人NKG2D重组真核表达载体，并研究其在COS-7细胞中的表达。方法：应用RT-PCR，自健康人外周血单个核细胞(PBMC)中获取NKG2D cDNA，应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后，构建含目的基因的真核细胞表达质粒，并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS-7细胞．用RT-PCR和流式细胞术(FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果：重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS-7细胞中获得表达。结论：成功地构建了重组表达栽体pcDNA3．1-NKG2D，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。     

TGF-β1真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建人转化生长因子-β1（TGF-β1）的真核表达载体,并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达,为阐明TGF-β1在肝纤维化发生、发展中的作用以及建立相应的基因沉寂治疗途径奠定基础.方法：从人的肝脏组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得人TGF-β1基因,将其克隆到真核荧光表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1,转染真核表达细胞COS-7中,通过荧光显微镜检测其表达,RT-PCR和Western Blot检测TGF-β1基因在真核细胞中的表达.结果：通过RT-PCR方法克隆人TGF-β1基因为1173bp,与目的基因片段大小相一致; 测序结果显示,于531位有1个碱基突变：T→C,为无义突变.通过RT-PCR和Western Blot检测到TGF-β1基因的表达,其融合蛋白分子质量约为52ku（绿色荧光蛋白分子质量约为27ku）,说明重组质粒在COS-7细胞内正常表达.结论：成功的构建了真核表达质粒pEGFP-N1-TGF-β1,并在真核细胞COS-7中表达,为进一步研究其在肝纤维化的基因治疗中奠定了基础.     

人DcR3 cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞.方法 以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定.将测序正确的DcR3 cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体.采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达.结果 PCR方法扩增出一1 000 bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA.将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达.结论 成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子.     

A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达

目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒（HRSV）G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定。方法自行设计引物,利用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,酶切鉴定后,脂质体法转染COS-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定基因转录和蛋白表达。结果真核表达载体pcDNA3．1（＋）G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,RT-PCR检测到G基因有转录,Western blotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带。结论成功克隆A亚型HRSVG基因,并在真核细胞中获得表达。     

海人藻酸受体亚基GluR6真核表达载体的构建及其表达

目的构建海人藻酸受体亚基GluR6的真核细胞表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法根据GenBank数据库中GluR6的cDNA序列（Z11548）,分3段分别设计并合成3对引物。从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,分别克隆至pGEM-T载体中。经测序确证后,将该3段cDNA片段依次与pcDNA3.1（＋）载体定向连接。将鉴定正确的重组体以脂质体法转染至COS-7细胞中,免疫印迹法检测GluR6蛋白质表达水平。结果克隆了GluR6的cDNA,并构建了其真核表达载体GluR6-pcDNA3.1,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;免疫印迹分析显示,GluR6在COS-7细胞中表达水平较高。结论成功构建GluR6-pcDNA3.1真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达。