雷帕霉素对肝癌肝移植术后复发影响的实验研究

 【目的】 探讨雷帕霉素对肝癌肝移植术后复发影响?【方法】 应用MTT细胞增殖实验观察雷帕霉素对walker-256肿瘤细胞增殖的影响;应用流式细胞仪观察雷帕霉素对walker-256肿瘤细胞周期的影响;应用荧光定量RT-PCR观察雷帕霉素walker-256肿瘤细胞VEGFmRNA表达的影响?观察雷帕霉素对免疫抑制肝转移癌大鼠模型肿瘤生长情况?肿瘤组织PCNA指数?肿瘤复发率及生存情况的影响?【结果】 MTT细胞增殖实验示雷帕霉素对walker-256肿瘤细胞有抑制作用,IC50为9.60 ng/mL;细胞周期检测示雷帕霉素组G1/G0期比例为55.2% ± 0.1%较对照组(45.2%±0.4%)高(P < 0.05);雷帕霉素组VEGFmRNA表达为(4.50 ± 0.13)×10-2较对照组[(70.8 ± 1.3)×10-2]低(P < 0.05)?雷帕霉素组荷瘤大鼠荷瘤肝重为(12.5 ± 0.2)g,较对照组[(14.4 ± 0.3)g]轻,两组间差别有统计学意义(P < 0.05);雷帕霉素组荷瘤大鼠荷瘤肝质量比为(61.3 ± 0.6)×10-3,较对照组[(70.8 ± 1.3)×10-3]小,两组间差别有统计学意义(P < 0.05);雷帕霉素组大鼠肿瘤复发率为90%,对照组为95%,两组比较差异无统计学意义;雷帕霉素组生存时间为(26.5 ± 2.5)d,对照组为(14.8 ± 2.3)d,两组间差别有统计学意义(P < 0.05)?雷帕霉素组大鼠PCNA指数为64.1% ± 2.1%,较对照组(80.8% ± 1.0%)低,差别有统计学意义(P < 0.05)?【结论】 虽然雷帕霉素对降低免疫抑制下的肿瘤复发率作用不明显,但能明显抑制肿瘤生长速度,延长带瘤生存时间?     

心力衰竭大鼠脑脊液及血清瘦素改变的研究

 【目的】检测心力衰竭大鼠血清、脑脊液瘦素水平及脑脊液／血清瘦素比值改变，对心衰大鼠的瘦素水平、瘦素抵抗及瘦素在血-脑脊液处的转运进行初步探讨。【方法】通过缩窄雄性Wistar大鼠腹主动脉制成心力衰竭模型。30只大鼠随机分成空白对照组、假手术对照组和心衰组。预实验应用超声心动图和血流动力学检测证实术后4个月大鼠已经出现明显心衰。术后4个月采集脑脊液、血清，ELISA法测定瘦素水平。【结果】心衰组的血清瘦素水平较假手术及空白对照组明显升高[（8．1±4．0）ng／mLvs（3．7±1．7）ng／mL，（3．1±1．4）ng／mL，P〈0．01]。3组脑脊液瘦素水平无显著差异。心衰组脑脊液／血清瘦素比值较两对照组明显降低（10±7vs18±8,22±12。P〈0．01）。两对照组血清瘦素水平及脑脊液／血清瘦素比值无显著差异。对照组脑脊液瘦素与血清瘦素呈正相关（r=0．724，P〈0．05），心衰组两者相关性消失。【结论】心衰大鼠血清瘦素水平升高，脑脊液瘦素水平无显著改变，脑脊液／血清瘦素比值下降，脑脊液瘦素与血清瘦素相关性减弱。支持瘦素血-脑脊液饱和转运系统的存在，提示瘦素进入中枢系统的转运障碍是瘦素抵抗的一个重要原因。     

白蛋白对近端肾小管上皮细胞增殖与凋亡的影响

 【目的】探讨白蛋白对近端肾小管上皮细胞（PTCs）增殖与凋亡的影响。【方法】用不同剂量（0．1，0．5，1，5，10，30mg／mL）去脂牛血清白蛋白（dBSA）超载体外培养的NRK52E，dBSA 0mg／mL作为对照。细胞增殖活性用MTS比色法检测和显微镜观察。细胞凋亡检测：荧光染料DAPI染核，DNA梯带实验，原位末端标记（TUNEL）实验和苔盼蓝染色计数。【结果】高剂量dBSA超载未完全融合NRK52E细胞144h后细胞变得更密集。MTS比色结果发现，高剂量dBSA（5、10、30mg／mL）超载可明显诱导NRK52E细胞增殖，增殖活性分别为（0．700±0．045）A、（1．021±0．029）A和（1．273±0．173）A，较对照细胞（0．441±0．020）A显著升高，P均〈0．05。高剂量dBSA超载的NRK52E细胞，有较多出现核碎裂和核固缩，有较强DNA梯带和原位末端标记信号。苔盼蓝染色计数发现，高剂量dBSA（5、10、30mg／mL）超载NRK52E细胞72h的死亡细胞数[（680000±28618）／mL，（970000±52915）／mL和（1132500±88954）／mL较对照的死亡细胞数[（312500±28395）／mL]显著升高，P均〈0．05；而且死亡细胞数呈剂量依赖性。【结论】白蛋白超载NRK52E细胞既可诱导细胞增殖，又可诱导细胞凋亡。     

心力衰竭大鼠脑脊液及血清瘦素改变的研究

【目的】检测心力衰竭大鼠血清、脑脊液瘦素水平及脑脊液／血清瘦素比值改变，对心衰大鼠的瘦素水平、瘦素抵抗及瘦素在血-脑脊液处的转运进行初步探讨。【方法】通过缩窄雄性Wistar大鼠腹主动脉制成心力衰竭模型。30只大鼠随机分成空白对照组、假手术对照组和心衰组。预实验应用超声心动图和血流动力学检测证实术后4个月大鼠已经出现明显心衰。术后4个月采集脑脊液、血清，ELISA法测定瘦素水平。【结果】心衰组的血清瘦素水平较假手术及空白对照组明显升高[（8．1±4．0）ng／mLvs（3．7±1．7）ng／mL，（3．1±1．4）ng／mL，P〈0．01]。3组脑脊液瘦素水平无显著差异。心衰组脑脊液／血清瘦素比值较两对照组明显降低（10±7vs18±8,22±12。P〈0．01）。两对照组血清瘦素水平及脑脊液／血清瘦素比值无显著差异。对照组脑脊液瘦素与血清瘦素呈正相关（r=0．724，P〈0．05），心衰组两者相关性消失。【结论】心衰大鼠血清瘦素水平升高，脑脊液瘦素水平无显著改变，脑脊液／血清瘦素比值下降，脑脊液瘦素与血清瘦素相关性减弱。支持瘦素血-脑脊液饱和转运系统的存在，提示瘦素进入中枢系统的转运障碍是瘦素抵抗的一个重要原因。     

重组海葵溶细胞素对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察重组海葵溶细胞素(Src)对离体大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响。方法体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VCMC),应用不同浓度的Src分别进行刺激VCMC并设立对照进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。结果各组的细胞增殖率分别为对照组:0.802±0.055;Src100μg/ml组:0.115±0.014;Src10μg/ml组:0.213±0.016;Src1μg/ml组:0.335±0.097,Src100ng/ml组:0.663±0.060;Src10ng/ml组:0.678±0.129;Src1ng/ml组:0.738±0.072。统计分析显示100ng/ml以上浓度的Src能明显抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖(P<0.05),并呈现剂量依赖性(P<0.05)。结论重组海葵溶细胞素Src对大鼠血管平滑肌细胞增殖有一定的抑制作用。     

重组人IL-6对近曲肾小管上皮细胞增殖及生物学表型的影响

 【目的】观察重组人白细胞介素6（rIL-6）在体外对人近曲肾小管上皮细胞株（HK-2）增殖及生物学表型的影响。探讨rIL-6对HK-2细胞作用的时间-效应及剂量-效应关系。【方法】用MTT比色法检测rIL-6对细胞增殖的影响；用流式细胞术检测rIL-6对细胞周期及α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）阳性细胞百分率的影响；倒置显微镜观察rIL-6对HK-2细胞形态改变的影响。【结果】MTT比色法示，rIL-6在10～50ng／mL作用浓度范围内促进HK-2细胞增殖，呈剂量、时间依赖效应；rIL-6作用浓度为100～200ng／mL时抑制细胞增殖，随作用浓度增加抑制作用加强（F=201．582，P〈0．001），（F=43．943，P〈0．001）。rIL-6影响HK-2细胞的DNA合成。HK-2细胞有基础量的α—SMA表达，25ng／mL rIL-6与HK-2孵育1～48h后，α—SMA阳性细胞百分率高峰出现在48h（F=442．22，P〈0．001）。rIL-6干预下，HK-2细胞形态由卵园型渐转变为长棱型、长条型。【结论】rIL-6可促进HK-2细胞增殖及生物学表型的转化，但大剂量的rIL-6可抑制HK-2细胞增殖。     

重组人IL-6对近曲肾小管上皮细胞增殖及生物学表型的影响

【目的】观察重组人白细胞介素6（rIL-6）在体外对人近曲肾小管上皮细胞株（HK-2）增殖及生物学表型的影响。探讨rIL-6对HK-2细胞作用的时间-效应及剂量-效应关系。【方法】用MTT比色法检测rIL-6对细胞增殖的影响；用流式细胞术检测rIL-6对细胞周期及α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）阳性细胞百分率的影响；倒置显微镜观察rIL-6对HK-2细胞形态改变的影响。【结果】MTT比色法示，rIL-6在10～50ng／mL作用浓度范围内促进HK-2细胞增殖，呈剂量、时间依赖效应；rIL-6作用浓度为100～200ng／mL时抑制细胞增殖，随作用浓度增加抑制作用加强（F=201．582，P〈0．001），（F=43．943，P〈0．001）。rIL-6影响HK-2细胞的DNA合成。HK-2细胞有基础量的α—SMA表达，25ng／mL rIL-6与HK-2孵育1～48h后，α—SMA阳性细胞百分率高峰出现在48h（F=442．22，P〈0．001）。rIL-6干预下，HK-2细胞形态由卵园型渐转变为长棱型、长条型。【结论】rIL-6可促进HK-2细胞增殖及生物学表型的转化，但大剂量的rIL-6可抑制HK-2细胞增殖。     

灵孢多糖对脂多糖诱导的原代多巴胺能神经元变性的保护作用

 【目的】观察灵孢多糖对脂多糖诱导的原代多巴胺能神经元变性的保护作用。【方法】建立原代中脑多巴胺能神经元与胶质细胞的共培养，随机分为6组：对照组、脂多糖组（20ng／mL）；单纯灵孢多糖组、脂多糖＋灵孢多糖（50，100，300μg／mL）3组。通过免疫组化检测酪氨酸羟化酶，OX-42的阳性细胞数，以RT-PCR检测TNF-α mRNA和iNOS mRNA表达。【结果】灵孢多糖（100，300μg/mL）组的酪氨酸羟化酶阳性细胞数明显多于脂多糖组，分别为（30．1±3．1，34．2±3．2，23．4±2．8）。脂多糖组激活的小胶质细胞体积增大，细胞数量增多（30．6±4．5），TNF-α mRNA和iNOS mRNA表达增高，但经较大剂量灵孢多糖（100，300μg／mL）预处理后，小胶质细胞的激活被抑制，总的细胞数量显著减少（26．4±5．1，25．1±4．6），TNF-α mRNA和iNOS mRNA表达量降低（P〈0．01）。【结论】灵孢多糖预处理对脂多糖诱导的原代中脑多巴胺能神经元变性具有保护作用，可能是由于灵孢多糖的预处理阻断了由脂多糖诱导的小胶质细胞的激活，从而减少了TNF-α mBNA和iNOS mRNA的表达。     

雷帕霉素对乳腺癌多药耐药细胞的耐药逆转作用初探

目的探讨雷帕霉素对乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7／ADR的耐药逆转作用。方法MTT法测定10μM雷帕霉素、阿霉素（10、50、100、500、1000、5000、20000、40000、100000ng／mL）、雷帕霉素联合阿霉素对MCF-7和MCF-7／ADR细胞的增殖率的影响。结果对于MCF-7细胞的增殖率,10μM雷帕霉素对其无显著影响;500ng／mL及以上浓度的阿霉素显著降低增殖率;联合10μM雷帕霉素后,能降低增殖率的浓度仍是500ng／mL及以上。对于MCF-7／ADR细胞,10μM雷帕霉素对其增殖率无显著影响;40000ng／mL及以上浓度的阿霉素降低其增殖率;联合10μM雷帕霉素后,1000ng／mL及以上浓度的阿霉素能降低其增殖率。结论雷帕霉素对MCF-7／ADR细胞有耐药逆转作用。     

对自制全氟化碳乳剂静脉输注安全性的实验研究

目的探讨自制全氟化碳乳剂（PFE）静脉输注的安全性。方法35只雄性Wistar大鼠随机分为对照组（5只）和PFE组（30只）。腹腔麻醉后，对照组静脉注射生理盐水10mL／kg后2h处死，PFE组大鼠于静脉注射PFE后5min经眼眶静脉取血200止测定全氟化碳（PFC）浓度，然后分别于2h，4h，6h，24h，48h和10d随机处死5只。观察各组血液PFC浓度，PaO2水平，GPT、00rr、BUN、Cr浓度，肺脏、肝脏、肾脏常规病理变化。结果PFE组大鼠活动、反应正常，无一例死亡；肝脏、肾脏病理无明显异常；PFC颗粒广泛分布于肺泡及肺微血管。PFE组2h，4h，6h，24h时间点GPT及GOT均显著高于对照组（P均〈0．05）；第10d降至（92．5±6．4）U／mL和（163．9±1.3）U／mL，与对照组比较无明显差异。BUN、Cr水平与对照组比较无明显差异（P均〉0．05）。静脉注射PFE10mL／kg后5min，2h，4h，6h，24h，48h，10d血中PFC浓度分别为（20．0±1.8）mg／mL，（1．8±0．7）mg／mL，（1．5±0.6）mg／mL，（1．2±0．4）mg／mL，（0．5±0．2）mg／mL，（0．2±0．03）mg／mL，0mg／mL。PFE组2h时间点PaO2显著高于对照组[（119．2±8．6）mmHg比（99．6±4．7）mm Hg，P〈0．05]。结论静脉输注PFE对大鼠一般情况、肺脏、肝脏、肾脏脏器病理无明显影响，具有较好的安全性。静脉输注PFE后PFC颗粒可广泛分布于肺泡及肺微血管，并显著提高健康大鼠PaO2，可试用于急性肺损伤的防治研究。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

内毒素对睾丸功能影响的研究进展

众所周知生殖道感染、炎症和其他疾病可抑制雄性生殖功能,但对系统性炎症和疾病引起男性不育的具体机制却所知甚少。内毒素是一种高效炎症激活物,可诱导炎症感染、内毒素血症、败血症休克及多组织器官损伤等,虽然内毒素广泛用于其他系统的炎症研究,但对其在生殖系统炎症的研究较少,因而深入了解内毒素对睾丸功能的影响,有助于进一步理解内毒素所致疾病对雄性生殖功能的影响。本文就内毒素的结构和生物学功能及其对睾丸生精细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞功能的影响进行了相关研究。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

莪术注射液抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的：探寻新的抗白血病药物。方法：采用ＭＴＴ法,以柔红霉素（ＤＮＲ）、阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）和羟基脲作对照,了解莪术注射液对Ｋ５６２细胞增殖抑制作用;通过流式细胞仪检测和ＤＮＡ凝胶电泳,观察莪术注射液诱导Ｋ５６２细胞凋亡的情况。结果：莪术注射液对Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显强于对照ＤＮＲ、Ａｒａ－Ｃ和羟基脲;而它更主要的作用是诱导Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。