Torin1、Nutlin-3a促进人诱导多能干细胞来源早期心肌细胞成熟的初步研究

目的探索Torin1、Nutlin-3a对促进人诱导多能干细胞来源早期心肌细胞成熟的影响。方法将Torin1和Nutlin-3a作用于3T3细胞,通过细胞免疫荧光、流式细胞分析技术等验证其抑制细胞增殖的效果;再将药物作用于人诱导多能干细胞来源的早期心肌细胞,利用Western blot检测心肌细胞成熟相关蛋白的表达情况;利用qRT-PCR检测心肌细胞成熟相关基因mRNA的表达情况;利用细胞免疫荧光染色观察心肌细胞的形态、肌节发育情况;利用膜片钳电生理技术评估心肌细胞动作电位的相关指标,包括频率、振幅、动作电位时程等,评价其成熟情况。结果细胞免疫荧光、流式细胞分析技术显示,Nutlin-3a和Torin1可以抑制3T3细胞的增殖,使细胞退出细胞周期。Western blot检测结果显示,Nutlin-3a组和Torin1组cTnT、cTnI蛋白表达量相比DMSO组有增高的趋势。qRT-PCR结果表明,Torin1处理后的心肌细胞增殖存在减少趋势,并且可能更多地以脂代谢为能量代谢方式,心肌特异性标志表达量增高提示心肌细胞内结构可能更加成熟。免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,实验组细胞形态趋近长棒型,其中Torin1组心肌细胞肌节更加丰富,排列更加规整,更加接近成熟心肌细胞形态。膜片钳电生理实验结果分析显示,Torin1组和Nutlin-3a组振幅、最大去极化速率、动作电位平台期、APD30、APD70、APD90、阈电位绝对值相比对照组有增大的趋势,Torin1组和Nutlin-3a组动作电位频率相比对照组有减少的趋势,表明Torin1和Nutlin-3a处理人诱导多能干细胞来源的早期心肌细胞,可能促进心肌细胞动作电位成熟。结论用Torin1和Nutlin-3a处理人诱导多能干细胞来源的早期心肌细胞,可一定程度上改善细胞成熟的相关指标,mTOR信号通路可能是心肌细胞成熟的关键调控通路。     

麻黄碱及阿托品对人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位的影响

目的探讨麻黄碱及阿托品对人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位的影响,为人诱导多能干细胞来源心肌细胞的临床应用提供依据。方法利用免疫荧光鉴定人诱导多能干细胞多能性,并利用CHIR99021及IWP-2小分子在体外将其分化为心肌细胞。利用免疫荧光及膜片钳对获得的心肌细胞进行形态学及电生理鉴定。随后通过灌流系统添加500μmol/L麻黄碱及100μmol/L阿托品,并用膜片钳记录动作电位的变化。结果人诱导多能干细胞高表达多能性标志物oct4、sox2、nanog及tra-1-60。分化得到的心肌细胞高表达ctnt、α-actinin、mlc2v等心肌特异性标志物,同时具有自发节律的动作电位。麻黄碱及阿托品能够显著加快自发动作电位的频率,但对动作电位去极化幅度、最大去极化速率及90%动作电位时程无明显影响。结论麻黄碱及阿托品能够加快人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位的频率,证明其具有良好的药物反应性。     

细胞因子在诱导多能干细胞向肝细胞分化作用中的研究进展

诱导多能干细胞揭开了一个干细胞研究的新途径,诱导多能干细胞可以在体外逐步分化为肝细胞,这一突破性地进展使得诱导多能干细胞成为了一个有前途的临床应用来源.在诱导多能干细胞向肝细胞分化的过程中,多种细胞因子通过协调各种肝细胞发育信号调控基因表达,促进诱导多能干细胞向肝细胞方向分化和成熟,本文就诱导多能干细胞向肝细胞分化过程中的相关细胞因子及其作用进行综述.     

人松质骨来源基质细胞克隆培养与成体干细胞特性研究

目的观察培养的人松质骨来源基质干细胞是否具有骨髓来源基质干细胞的多向分化的成体干细胞特性。方法取股骨、髂骨3mm×3mm×3mm松质骨，剪碎冲洗，用有限稀释法进行克隆培养，然后对传代细胞用化学药物或生长因子进行成骨、成软骨以及心肌细胞分化诱导培养，并检测成骨、成软骨及心肌细胞表型。结果克隆培养细胞培养2周开始表达CD29、CD59、CDll6；成骨诱导条件下2周细胞开始表达I型胶原、骨钙素，至第28天碱性磷酸酶阳性率可达95％；成软骨诱导条件下细胞表达Ⅱ胶原，甲苯胺蓝染色阳性；心肌细胞诱导条件下细胞表达肌钙蛋白，逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）检测有MLC-2V的mRNA表达，4周左右可见细胞连接形成合胞体样结构生长，并有自发性搏动。结论人松质骨来源基质干细胞具有多向分化能力的基质干细胞，在临床和实验研究中可以替代骨髓来源的问充质干细胞。     

脂肪组织来源的多能干细胞培养和外源基因的表达

目的：研究脂肪组织来源的多能干细胞（ADMSCs)体外长期培养和外源基因的表达。方法：常规方法培养脂肪组织来源的多能干细胞，细胞免疫化学方法对未分化的细胞进行鉴定。用不同的物质诱导脂肪组织来源的多能干细胞向脂肪细胞和成骨细胞方向分化。用Ad5βgal转染脂肪组织来源的多能干细胞。结果：从成年大鼠的脂肪组织中培养出多能干细胞，在体外生长形态类似成纤维细胞，可以维持未分化状态稳定增殖，体外扩增可超过10代。细胞表达波形蛋白。在不同物质的诱导下，干细胞可分化为脂肪细胞和成骨细胞。脂肪组织来源的多能干细胞体外可稳定表达外源基因。结论：由脂肪组织来源的多能干细胞可在体外培养并稳定增殖，能够表达外源基因，有潜力作为自体移植的一种细胞来源和基因治疗的一种载体。     

p53在心脏疾病发生、发展、治疗中的作用

心脏疾病为全球十大致死性疾病之一,严重威胁人类健康和生命安全。目前,治疗心脏疾病的方法多为姑息性疗法,我们亟待寻找新的更有效的心脏疾病治疗方案。近年来,p53在心脏疾病中的作用受到学术界广泛关注。p53作为一种转录因子,可通过抗血管生成、促进凋亡、调控自噬、阻滞细胞周期、调节代谢等途径,来参与心脏疾病的发生、发展和治疗。此外,p53在体外还可提高干细胞诱导分化效率、促进干细胞诱导分化的心肌细胞成熟。这些将有助于心脏疾病干细胞疗法的发展,故未来p53可能成为心脏疾病治疗的新靶点。本文对p53在心脏疾病的发生、发展、治疗中的作用进行综述。     

真皮来源成体多能干细胞的分离鉴定和生物学性状的研究

目的:从新生大鼠和成人真皮组织分离鉴定多能干细胞,并研究其生物学性状。方法:以新生大鼠背部皮肤和成人包皮为研究对象,依据体外贴壁生长的性状,采用酶消化法分离真皮多能干细胞,通过定向诱导其多向分化实验进行鉴定。结果:早期贴壁筛选的新生大鼠和成人皮肤组织原代真皮细胞克隆经过传代培养后细胞形态均一,约90%的细胞处于 Go/G1期,细胞表面波形蛋白表达阳性,但Ⅷ因子和角蛋白表达阴性。经诱导分化后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,具有多能分化潜能。体外培养的多能干细胞具有异质性,含有体积大小不同的细胞亚群。绿色荧光蛋白 GFP 基因转染真皮多能干细胞可获得良好表达。结论:大鼠和人真皮组织中均存在成体多能干细胞,提示真皮可能是成体多能干细胞的又一来源。     

多能干细胞向雄性生殖细胞分化的研究进展

多能干细胞(PSCs)包括胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs),具有分化为成体所有类型细胞的潜能。目前体外已能获得小鼠PSCs来源的成熟精子、人类ESCs(hESCs)/iPSCs(hiPSCs)来源的原始生殖细胞(PGCs)以及减数分裂前期精子细胞。若能诱导人类PSCs(hPSCs)体外分化为功能完整的成熟精子,可望治愈临床上非遗传因素无精子症;对于遗传因素导致少弱精子/无精子症,则可进一步结合基因编辑技术获得健康功能精子。iPSC分化的功能精子可避免精子细胞来源及医学伦理问题,具有更高临床价值。本文综述体外诱导PSCs向雄性生殖细胞分化的研究进展,为应用PSCs治疗男性不育提供参考。     

重组人血清白蛋白体外诱导干细胞向心肌细胞的分化

目的探讨植物源重组人血清白蛋白能否替代传统B27细胞培养添加剂作为基础培养基分化人多潜能干细胞为心肌细胞。方法人多潜能干细胞以1.2×10~4个/cm~2的细胞密度接种,汇合度达至75%后采用含有0、50、100、200 g/L不同浓度植物源重组人血清白蛋白的分化培养基对其进行诱导分化,在光学显微镜和荧光显微镜下记录干细胞向心肌分化的全过程。用流式细胞仪检测不同浓度植物源人血清重组白蛋白心肌细胞的分化效率。用免疫荧光染色检测心肌细胞特异性标志物α-辅肌动蛋白(α-actinin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT);用电镜观察人多潜能干细胞来源心肌细胞的超显微结构以及心肌细胞对药物的反应。结果大量的自发跳动心肌细胞在诱导分化第9 d左右出现,浓度为200 g/L的重组人血清白蛋白配成的心肌分化液的分化效率达60.4%;跳动心肌细胞α-actinin和cTnT染色阳性,超显微结构有肌丝的存在,且对异丙肾上腺素和维拉帕米呈剂量依赖性。结论利用成分明确的、无动物源性的方法在体外诱导人多潜能干细胞分化为心肌细胞,分化效率达60.4%,分化方法简单且低成本,可作为临床级别使用。     

DNA损伤在去分化源性表皮干细胞安全性评价中的作用及相关机制的研究

目的：：从分子、细胞及在体水平评估DNA损伤和非 DNA 损伤因素诱导所得去分化源性表皮干细胞的安全性,探讨DNA损伤及其应答分子对其安全性评估的意义与机制。方法：分别采用紫外线(UV)照射和bFGF处理诱导方案诱导表皮细胞去分化。采用 MTT法比较正常培养和血清培养条件下的两组去分化源性表皮干细胞的增殖能力;流式细胞术检测凋亡情况;Western blotting检测各组去分化过程中DNA损伤应答分子γ-H2AX、激活型 caspase、p53、p21表达的变化;在雌性BALB/c裸小鼠右侧腋窝皮下注射人黑色素瘤细胞及两种去分化源性表皮干细胞,同时设生理盐水注射对照,30 d 后取瘤块称重,评估两种去分化源性干细胞的成瘤性。结果：①两种去分化源性表皮干细胞均表现出较强的增殖能力,UV 照射所得干细胞具有较强的血清耐受性;②UV照射可导致表皮细胞DNA损伤和细胞凋亡,影响表皮细胞中 p53和 p21水平,而 bFGF处理组无此作用;③两种去分化源性表皮干细胞均无体内成瘤性。结论：去分化过程中细胞 DNA 损伤与否是评价去分化源性干细胞安全性的较敏感的关键指标,因此 bFGF处理诱导与 UV照射所得的表皮干细胞相比更为安全可靠。     

自噬和ASPPs在老年大鼠急性肾损伤早期的表达

目的观察自噬相关蛋白和p53凋亡刺激蛋白(ASPPs)在肾损伤早期的表达变化,初步探讨自噬相关蛋白和ASPPs是否可能成为老年大鼠AKI早期生物标志物。 方法建立顺铂致AKI青年与老年大鼠模型。雄性SD老年大鼠随机分为假手术组(Sham),顺铂模型组,同时设数量匹配的雄性SD青年大鼠为对照;模型组大鼠一次性腹腔注射顺铂4 mg/kg,Sham组相同途径注射生理盐水4 ml/kg;在给药12 h、1 d、3 d、5 d、7 d时检测大鼠Scr、BUN;光镜观察大鼠肾脏病理变化;透射电镜观察大鼠肾小管上皮细胞超微结构变化及自噬体的情况;免疫印迹法检测肾脏组织Beclin 1、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)、p62、p53及ASPP抑制物(iASPP)和ASPP1表达情况。 结果顺铂诱导12 h后,与Sham组比较,青年与老年大鼠Scr无明显变化(P>0.05);电镜观察到大鼠肾小管上皮细胞自噬体出现而且数量显著增多;老年大鼠肾组织Beclin 1、p62、LAMP-2和p53表达水平明显升高(P<0.05),iASPP表达水平明显降低(P<0.05),并且老年大鼠肾组织Beclin 1、LAMP-2和p53变化时间早于青年大鼠(P<0.05)。 结论自噬和ASPPs在老年大鼠AKI发生早期即可出现,在Scr开始升高前,反应性自噬已经启动。自噬相关蛋白和ASPPs有望成为AKI早期的损伤标志物,可能是AKI早期干预的新靶点,但仍需更深入的研究。     

人瘢痕疙瘩间充质样干细胞向成骨细胞分化过程中Notch信号表达的研究

目的研究人瘢痕疙瘩间充质样干细胞向成骨细胞分化过程中,Notch 1~4受体的表达情况,探讨Notch信号通路是否参与调控人瘢痕疙瘩间充质样干细胞的成骨分化。方法经患者知情同意后,分离培养人瘢痕疙瘩间充质样干细胞,采用流式细胞术检测CD29、CD34、CD44、CD45及CD90的表达;免疫细胞化学法检测Oct 4的表达;体外诱导其向成骨细胞分化,诱导3周后行茜素红染色;于诱导前及诱导后2、3周,采用实时定量-多聚酶链反应(RT-PCR)及免疫蛋白印迹法(western blot),分别检测细胞Notch 1~4受体mRNA及蛋白的表达。结果流式细胞术结果表明,分离培养的细胞高表达间充质干细胞表型CD29(98.76%)、cD44(98.11%)、CD90(97.86%),不表达造血干细胞表型CD34(0.05%)、CD45(0.03%);免疫细胞化学法检测多能干细胞标志物Oct4呈阳性表达;向成骨细胞体外诱导3周后,茜素红染色可见明显的钙盐结节。RT-PCR和western blot结果显示,随着诱导时间的延长,Notch 1~4受体mRNA和蛋白的相对表达量逐渐减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论在人瘢痕疙瘩间充质样干细胞向成骨细胞诱导分化过程中,Notch受体信号的表达逐渐减弱,低水平的Notch信号激活可能有利于瘢痕疙瘩间充质样干细胞的成骨分化。     

瘢痕中缺氧诱导因子-1α的表达及其与凋亡的关系

目的 探讨瘢痕内缺氧环境减轻的机制。方法 采用免疫组化法检测烧伤后肉芽、不同时期瘢痕和正常皮肤中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）、p53的表达，采用权重方法分别对各组瘢痕的HIF-1α、p53表达结果进行量化，分析各自规律及相互间关系。结果 随着瘢痕的成熟，HIF-1α表达强度逐渐减弱，p53表达强度在1年内逐渐增强，相互间具有负相关性（P〈0．01）。结论 p53在瘢痕成熟过程中起重要作用，HIF-1α可能通过协同p53诱导细胞凋亡，减少耗氧来减轻缺氧环境。     

诱导多能干细胞向尿道上皮细胞分化体系的建立

目的建立人脂肪干细胞(ADSCs)来源的诱导干细胞(i PSCs)分化为尿路上皮细胞的模型。方法经活检获取患者脂肪,制备原代ADSCs,采用仙台病毒法建立ADSCs来源的人诱导干细胞系(hi PS),对hi PS细胞进行向尿路上皮细胞的诱导分化,并使用免疫组化和流式细胞仪检测分化效果。结果脂肪干细胞高表达CD44,低表达CD45和CD105,使用仙台病毒法过表达脂肪干细胞OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC的转录水平建立非整合的hiPS细胞系,证明其表达多能性标志,具有三胚层多向分化的能力。在相关因子和尿路上皮细胞专用培养基的处理下,诱导21 d的hiPS细胞已出现上皮样结构,其表达尿路上皮细胞特异标志UP1a达到70%以上,免疫组化见分化后的细胞大量表达尿路上皮细胞特异标志UP1a,UP1b和UP2。结论 ADSCs源性i PSCs具备向尿路上皮分化的能力,该细胞系的建立有望为尿道缺损患者开展个体化的尿道修补治疗提供优质的种子细胞。     

大鼠真皮多能干细胞分离培养及其多分化潜能特性

目的建立分离培养大鼠真皮来源多能干细胞（SKPs）的方法并探讨其生物学特性。方法0．25％中性蛋白酶（protease）选择性的消化表皮与真皮的细胞连接，剥离真皮，采用0．25％的胰蛋白酶消化真皮层细胞于超低黏附培养板中进行悬浮无血清培养，机械法传代，免疫荧光染色法检测细胞表面分子的表达，体外诱导其向脂肪细胞分化，研究其多分化潜能。结果体外培养2～3d后真皮多能干细胞聚集成球悬浮生长，培养4代后去除生长因子后并添加血清培养，细胞帖壁生长，呈长梭形成纤维样，免疫荧光染色显示，体外培养的真皮多能干细胞可表达CD29和Nestin，不表达CD34与vimentin。体外诱导实验结果显示体外培养的真皮多能干细胞能够被诱导成脂肪细胞，油红染色阳性。结论采用悬浮培养方法可成功分离培养大鼠真皮多能干细胞，培养的细胞可表达神经干细胞标志并具有多分化潜能。     

人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的显微形态学研究

目的 观察人脐带间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化过程中的显微形态学改变及其意义,为心肌细胞的移植探索新的细胞来源.方法 从人脐带华尔通氏胶分离、培养MSCs,倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞分化前后细胞形态的变化及超微结构,用免疫组化的方法检测分化的心肌样细胞是否表达心肌肌钙蛋白I(troponin I)、心肌肌钙蛋白T(troponin T)和心肌结蛋白(desmin). 结果 扫描电镜观察到人脐带MSCs经5-aza和DMSO诱导后体积变大变长,呈杆状细胞且细胞浆中可见肌丝样结构出现;透射电镜可以观察分化的细胞浆中有肌丝的存在.同时分化的细胞表达心肌细胞的标记troponin I、troponin T和desmin. 结论 人脐带间充质干细胞可以分化为心肌样细胞,可以作为心肌细胞移植的来源.     

喉鳞癌组织中p53和bcl-2的表达及临床意义

目的探讨基因p53与bcl-2在喉鳞癌中的表达及它们的关系,以及它们在喉癌发生、发展中的作用。方法应用免疫组化法测定110例喉鳞癌标本及20例正常黏膜中p53和bcl-2的表达。结果正常黏膜几乎不表达p53及bcl-2,它们在喉鳞癌标本中表达率分别为62.7%和47.3%,p53表达和淋巴结转移情况相关,bcl-2和病理分级、淋巴结转移情况相关;p53和bcl-2表达呈正相关。结论p53和bcl-2关系密切,在喉癌的发生、发展中起重要作用,有望作为早期诊断的指标基因治疗靶点。     

直接贴壁法诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞

摘要：目的利用直接贴壁法体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,并检测其分化效率。方法人胚胎干细胞以1×10’个／cm2的细胞密度传代到铺备有基质胶的培养皿中培养,用带8ng／ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的条件培养基培养6d后,更换为RPMI1640．B27培养基,同时加入100ng／ml的人重组activinA处理24h,接着再加入10ng／ml的人重组骨形态发生蛋白4（BMP4）处理4d,之后更换为不带诱导因子的RPMI1640．B27培养基,每隔2～3d换1次培养基,持续2～3周。在光学显微镜下观察记录出现跳动心肌细胞的时间和跳动频率,并计算跳动克隆百分比,24孔板一组,共记录4组96孔;用免疫荧光染色法检测心肌细胞特异标志物心肌肌钙蛋白T（cTnT）;膜片钳实验检测心肌细胞自发性动作电位;跳动心肌细胞经过24h缺氧刺激后,用凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡比例。结果大量的自发跳动心肌细胞在诱导分化13d左右开始出现。分化出现自发跳动心肌细胞的时间为（13．0±1．1）d,百分比为66．7％,跳动频率为（63．0±7．0）次／分;跳动心肌细胞cTnT染色阳性;跳动心肌细胞检测到自发性动作电位;跳动心肌细胞缺氧24h后检测到凋亡比率为8．0％±0．5％。结论国内首次利用直接贴壁法在体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,分化效率达到66．7％,分化时间13d左右。     

胃癌抗原肽Hsp70复合物对转染全长野生型p53的树突状细胞免疫功能的影响

目的 应用联合修饰的树突状细胞(DC)在体外诱导高效而特异的抗胃癌免疫效应。方法 先将全长野生型p53导入脂质体内并转染小鼠骨髓来源的DC,然后用胃癌抗原肽-HSP70复合物等因素修饰已转染全长野生型 p53的 DC(wt-p53 DC),检测这种DC诱导小鼠脾脏淋巴细胞特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的能力,分泌细胞因子功能,以及表面分子表达的高低。结果Western blot检测转染小鼠 p53cDNA的 BMDC及其培养上清中均可以检测到 p53表达;细胞因子含量明显增加(P<0.05),而的其他组的细胞因子含量与对照相比,无显著变化;经流式细胞仪(FACS)检测 wt-p53DC表面高表达 B7-1、B7-2、MCH-Ⅰ、MCH-Ⅱ;脾淋巴细胞经刺激后,能够特异性地杀伤胃癌细胞,杀伤率为91.6％。结论 全长野生型p53基因转染+抗原肽联合修饰DC能诱导小鼠细胞毒性T淋巴细胞的特异性,显著提高DC的抗原提呈功能。     

脂肪干细胞原代培养及其向表皮细胞诱导分化的研究

目的 探讨人脂肪干细胞(adipose-derivedstem cells,ADSCs)体外原代培养方法及诱导分化为表皮细胞的可能性.方法 利用酶消化法原代培养ADSCs,免疫细胞化学检测其相关表面抗原CD29、CD34、CD44、CD49d、CD80、CD106的表达;用表皮细胞诱导培养基对ADSCs进行体外诱导,观察细胞的生长情况及形态变化;对诱导前后两种细胞行细胞增殖活性及细胞角蛋白表达检测.结果 利用脂肪抽吸液成功培养出ADSCs,且能稳定传代;免疫组织化学染色证实有特定的干细胞表面标记物表达;对ADSCs成功进行了体外诱导培养,其细胞形态及蛋白表达均有向表皮细胞分化的倾向,并且仍具较高增殖活性.结论 利用酶消化法可在体外成功培养ADSCs,并能持续传代;ADSCs表达特定的干细胞表面抗原;ADSCs可成功进行体外诱导,有向上皮细胞分化的倾向.