检测肿瘤坏死因子及可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ在预测孕妇发生感染性早产的临床意义

目的 研究肿瘤坏死因子(TNF-α)和可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ(sTNFR Ⅰ)与孕妇出现感染性早产的关系.方法 收集2009年12月-2011年5月在医院分娩的82例早产孕妇,分为早产非感染组45例和早产感染组37例,收集同期足月正常生产孕妇43例作为对照组,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TNFα、sTNFRI的水平.结果 正常对照组的TNF-α为(2.1±0.3)pg/ml,早产非感染组的TNF-α为(2.4±1.2)pg/ml,差异无统计学意义;正常对照组的TNF-α和sTNFRⅡ分别为(2.1±0.3)、(3.3±0.6)pg/ml,早产感染组分别为(3.0±0.9)、(5.4±1.1)pg/ml,差异均有统计学意义(P＜0.05);早产非感染组的TNF-α和sTNFRⅡ分别为(2.4±1.2)、(3.8±1.2)pg/ml,早产感染组为(3.0±0.9)、(5.4±1.1)pg/ml,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 与TNF-α相比,sTNFRI在预测感染性早产方面的准确性更高.     

胆管癌中肿瘤坏死因子α及肿瘤坏死因子受体Ⅰ表达情况的研究

目的研究肿瘤坏死因子α（TNF-α）和肿瘤坏死因子受体Ⅰ（TNFR-Ⅰ）在胆管癌中的表达及与胆管癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移等之间的关系。方法收集胆管癌手术标本48例，常规HE染色分组后，用SP免疫组织化学法检测TNF-α和TNFR-Ⅰ的表达情况。结果TNF-α主要在胆管癌细胞的胞浆中表达，阳性率为25％（12／48），其表达强度与胆管癌分化程度、浸润深度及淋巴结转移无关，P〉0．05；TNFR-Ⅰ主要在胞膜和胞浆中表达，阳性率为75％（36／48），其表达强度与胆管癌分化程度、淋巴结转移无关，P〉0．05，但与浸润深度呈负相关，P〈0．01。TNF-α与TNFR-Ⅰ二者表达强度比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论TNF-α和TNFR-Ⅰ在胆管癌细胞中均有表达，而且TNF-α的表达明显低于TNFR-Ⅰ。TNF-α的表达水平与胆管癌的分化、浸润、转移等生物学行为无关。TNFR-Ⅰ的表达水平与胆管癌的分化程度、有无淋巴结转移等无关，但与浸润深度呈负相关。     

卵巢上皮性肿瘤组织中肿瘤坏死因子-α可溶性肿瘤坏死因子受体表达及与微血管密度相关性

目的探讨卵巢上皮性肿瘤组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR-Ⅰ)的表达和微血管密度(MVD)及其与恶性卵巢上皮性肿瘤临床病理因素的关系。方法收集杭州市富阳区妇幼保健院2017年7月—2018年7月的恶性卵巢上皮性肿瘤(35例)、交界性卵巢上皮性肿瘤(32例)、良性卵巢上皮性肿瘤(34例)及正常卵巢组织(31例),采用免疫组化方法检测TNF-α、sTNFR-Ⅰ的表达和MVD,分析其相关性及与恶性卵巢上皮性肿瘤临床病理因素之间的关系。结果恶性卵巢上皮性肿瘤组织中的TNF-α、sTNFR-Ⅰ表达及MVD值明显高于其他三者(P<0.05),而交界性卵巢上皮性肿瘤高于良性卵巢上皮性肿瘤和正常卵巢组织(P<0.05),良性卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢组织差异无统计学意义(P>0.05);恶性卵巢上皮性肿瘤中TNF-α表达阳性者30例,MVD值为20.54±3.21;TNF-α表达阴性者5例,MVD值为17.98±2.59,与TNF-α表达阴性者比较差异有统计学意义(P<0.05),TNF-α阳性表达与MVD值呈正相关(r=0.541,P<0.05);sTNFR-Ⅰ表达阳性者27例,MVD值为20.31±2.65;sTNFR-Ⅰ表达阴性者8例,MVD值为17.01±3.33,与sTNFR-Ⅰ表达阴性者比较差异有统计学意义(P<0.05),sTNFR-Ⅰ阳性表达与MVD值呈正相关(r=0.484,P<0.05),进一步检测发现TNF-α与sTNFR-Ⅰ呈正相关关系(r=0.869,P=0.05);有淋巴转移者TNF-α、sTNFR-Ⅰ及MVD值较无淋巴转移者阳性表达率显著增高(P<0.05);但三者均与卵巢癌的年龄和临床病例分期等无关(P>0.05)。结论在卵巢上皮性肿瘤中,TNF-α及sTNFR-Ⅰ的表达与MVD呈正相关且与恶性卵巢上皮性肿瘤的转移有关,并可能成为恶性卵巢上皮性肿瘤临治疗的参考指标。     

阴茎癌患者血清可溶性肿瘤坏死因子受体水平与人乳头瘤病毒感染的研究

目的研究可溶性肿瘤坏死因子受体(STNFR)以及人乳头瘤病毒(HPV)感染与阴茎癌的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)法检测124例阴茎癌患者癌组织中的HPV,用双抗体夹心ELISA法检测患者血清中STNFRⅠ、STNFEⅡ水平,并与正常70例对照。结果阴茎癌患者癌组织中HPV感染率明显高于正常对照组(P<0.001);阴茎癌患者血清STNFRⅠ、STNFRⅡ水平较正常对照组明显增高(P<0.001);在阴茎癌患者中HPV感染阳性组STNFRⅠ、STNFRⅡ水平均高于阴性组(P<0.01);阴茎癌患者术后3个月血清中STNFRⅠ和STNFRⅡ水平明显低于术前(P<0.001)。结论STNFR与阴茎癌的发生发展有关,术后明显降低,STNFR水平的增高可能与阴茎癌HPV感染有关。     

胆管癌中肿瘤坏死因子α及肿瘤坏死因子受体Ⅰ表达情况的研究

目的研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肿瘤坏死因子受体Ⅰ(TNFR-Ⅰ)在胆管癌中的表达及与胆管癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移等之间的关系.方法收集胆管癌手术标本48例,常规HE染色分组后,用SP免疫组织化学法检测TNF-α和TNFR-Ⅰ的表达情况.结果 TNF-α主要在胆管癌细胞的胞浆中表达,阳性率为25%(12/48),其表达强度与胆管癌分化程度、浸润深度及淋巴结转移无关,P＞0.05;TNFR-Ⅰ主要在胞膜和胞浆中表达,阳性率为75%(36/48),其表达强度与胆管癌分化程度、淋巴结转移无关,P＞0.05,但与浸润深度呈负相关,P＜0.01.TNF-α与TNFR-Ⅰ二者表达强度比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 TNF-α和TNFR-Ⅰ在胆管癌细胞中均有表达,而且TNF-a的表达明显低于TNFR-Ⅰ.TNF-α的表达水平与胆管癌的分化、浸润、转移等生物学行为无关.TNFR-Ⅰ的表达水平与胆管癌的分化程度、有无淋巴结转移等无关,但与浸润深度呈负相关.     

人肿瘤坏死因子相关凋亡配体克隆、表达及纯化

目的应用基因工程技术克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子胞外区(TRAIL)114~281片段的cDNA,构建其原核表达载体,建立原核表达体系。方法采用RT-PCR方法从外周血单个核细胞的总RNA中扩增TRAIL分子的cDNA,克隆入T载体,阳性克隆经过RT-PCR、酶切和测序鉴定。将阳性克隆中TRAIL再亚克隆至原核表达载体pET28a,构建的表达载体用RT-PCR和酶切来验证,IPTG诱导表达。融合表达蛋白复性后,再用层析纯化表达产物。结果电泳显示RT-PCR产物约500bp,与预期值一致。TA克隆RT-PCR和酶切鉴定时的片段大小也为500bp。阳性克隆测序结果与GeneBank报道一致。构建的原核表达载体经RT-PCR和酶切鉴定后用IPTG诱导后,得到大量的融合表达蛋白,此蛋白是以包涵体形式存在的,对表达的蛋白复性和纯化后,电泳显示得到一条约20kD的蛋白条带。结论成功地构建了人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子原核表达载体。     

风疹病毒E1基因的克隆及原核表达

目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a(+),并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。     

早期自然流产妇女肿瘤坏死因子受体1的表达

目的 探讨自然流产妇女蜕膜组织肿瘤坏死因子受体1和血清中可溶性受体表达情况及其意义.方法 采用激光共聚焦显微镜检测技术,检测30例早期自然流产患者和30例同期正常妊娠要求人工流产者蜕膜组织肿瘤坏死因子受体1的表达含量;采用酶联免疫吸附试验测定两组血清可溶性受体的表达水平.结果 早期自然流产患者蜕膜间质细胞肿瘤坏死因子受体1表达高于正常妊娠人工流产者,腺体上皮细胞肿瘤坏死因子受体1表达低于正常妊娠人工流产者(t值分别为2.442和-2.130,均P＜0.05).早期自然流产患者血清可溶性受体的表达水平显著高于正常妊娠人工流产者(t=-2.033,P＜0.05).结论 早期自然流产妇女蜕膜基质细胞肿瘤坏死因子受体1的表达明显增高,腺体上皮细胞的表达明显降低.这种改变可能与不明原因早期自然流产有关.血清可溶性受体水平的升高可能对自然流产的发生起重要作用.     

肿瘤坏死因子受体和慢性丙型肝炎

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)有多种生物学效应,参与抗肿瘤、抗病毒、抗感染、凝血、发热、休克、多器官功能衰竭及恶液质等病理生理过程。但是TNF-α生物学效应的发挥,有赖于其与某些细胞上的TNF受体相结合。丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白能与TNF受体结合,导致异常信号传导,从而提出丙型肝炎新的致病模式。本文就TNF受体和HCV核心蛋白的关系及其在丙型肝炎慢性化中的作用作了综述。     

人源性基质金属蛋白酶-1原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人源性基质金属蛋白酶-1(MMP-1)原核表达载体. 方法从人肝组织提取总RNA,以此为模板,逆转录巢式 PCR扩增MMP-1全编码区基因片段,构建含目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-C2x重组质粒亚克隆,经双酶切及核苷酸测序进行分析鉴定. 结果成功地构建了人MMP-1原核表达载体. 结论构建的人MMP-1原核表达载体,为以后MMP-1融合蛋白的表达并获得具有抗原性的MMP-1融合蛋白奠定了基础.     

人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的克隆及在大肠杆菌的温控表达

人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的克隆及在大肠杆菌的温控高效表达 ,采用RT PCR技术从人肝脏组织总RNA中扩增谷胱甘肽硫转移酶M1基因的cDNA序列 ,将其插入到原核温控表达载体pBV2 2 0多克隆位点中 ,构建重组表达质粒 ,并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定 ,并进行了温控表达 ,表达量约达到 2 8 3 %。人谷胱甘肽硫转移酶M1基因克隆到原核表达载体pBV2 2 0中 ,测序结果同Genbank中的人谷胱甘肽硫转移酶M基因序列比较 ,在 619位点C→A ,氨基酸由Pro→Thr,在 5 2 8位点C→T ,编码氨基酸仍为Asp。通过温控诱导 ,在 2 8kDa的表达量约达到 2 8 3 %。人谷胱甘肽硫转移酶M1原核温控表达载体pBV2 2 0的构建 ,为毒理学、遗传药理学的研究提供了应用基础     

O_(139)霍乱弧菌内毒素LPS基因在大肠杆菌中的克隆表达

通过玻片凝集法从Ｏ１３９霍乱弧菌基因文库中筛选出可以表达Ｏ１３９霍乱弧菌脂多糖和Ｏ抗原的重组克隆大肠杆菌ＪＭ１０９（ｐＭＧ３１０），ＤＨ５α（ｐＭＧ３２０）和ＤＨ５α（ｐＭＧ３２１）。经免疫学方法鉴定三个重组克隆表达的脂多糖或Ｏ－抗原具有与Ｏ１３９霍乱弧菌脂多糖和Ｏ抗原相同的反应原性和免疫原性，并且三个重组克隆间的反应原性及免疫原性几乎无差别。限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ酶切重组粒ｐＭＧ３２０和ｐＭＧ３２１发现，两个Ｏ抗原基因大小相差近１ｋｂ，这说明这两个Ｏ抗原基因属于Ｏ１３９霍乱弧菌基因组ＤＮＡ的不同区域     

尘螨变应原Der p2基因克隆及原核表达

目的 原核表达尘螨主要变应原DerP 2。方法分离屋尘螨总RNA，根据GenBank已公布的DerP2核酸序列设计引物用RT-PcR扩增DerP2编码基因，克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET28a（＋），将表达质粒转化至Escherichia coliBL21（DE3）并用IFFG诱导表达，并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET28a（＋）-DerP2，SDS-PAGE和Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的DerP2编码基因与参考序列同源性达99．54％，推测其编码氨基酸130个，相对分子质量约为14348．5。结论尘螨变应原DerP2原核表达获得成功，为进一步生产重组变应原奠定了基础。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白的表达鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达肠道病毒71型强神经毒分离株VP1蛋白,为抗体制备和病毒诊断试剂盒的开发奠定基础。方法利用一步法RT-PCR扩增出病毒VP1基因,构建重组原核表达质粒,IPTG诱导后经SDS-PAGE和Western blot验证蛋白表达的特异性。结果重组质粒在1 mmol/L的IPTG 37℃诱导6 h后可诱导表达得到约33 KD的蛋白,且表达的蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。VP1蛋白特异性单抗和His蛋白单抗验证了蛋白表达的特异性。结论获得特异性的EV71病毒河南分离株VP1蛋白,可用于开发病毒诊断试剂盒。     

葡萄球菌肠毒素A基因的克隆、原核表达和鉴定

目的克隆葡萄球菌肠毒索A(SEA)基因,构建其原核表达系统,鉴定重组蛋白(rSEA)免疫原性。方法采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建pET32a-SEA表达质粒,转化入E.coli BL21DE3宿主菌,通过IPTG诱导表达,分离、纯化及Western印迹法鉴定。结果PCR获得SEA基因片段,DNA测序结果与已报道的SEA基因序列(GenBank No:L22566,AP004828)一致,构建了pET32a-SEA表达质粒,并成功地诱导、纯化了rSEA蛋白,rSEA表达量约为细菌总蛋白的40%。结论成功克隆了SEA全长基因,构建了rSEA原核表达系统,为进一步研制SEA的单克隆抗体及诊断试剂盒奠定了基础。     

人肝再生增强子原核表达系统的构建与筛选

目的构建多个人肝再生增强子(hALR)的原核表达系统进行原核表达、鉴定及筛选,得出理想的系统用于进一步的研究。方法构建4个重组表达质粒pET28a( )/hALR、pET23a/hALR、pGEX-5x-1/hALR、pGEX-5x-2/hALR,分别转化3种宿主菌,诱导表达重组hALR蛋白,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westem blotting鉴定重组蛋白。结果双酶切和DNA测序证实hALR cDNA正确插入4种表达载体并成功转化宿主菌,仅pET28a( )/hALR的BL21(DE3)菌株成功表达相对分子质量为23kDa的重组蛋白。结论筛选得出人肝再生增强子的原核表达系统,成功表达并鉴定重组hALR蛋白。     

人防御素-5基因原核表达载体pRSET-A的构建

目的利用分子生物学技术和方法将pRSET—A质粒改建为带有人α-防御素5（HD-5α）基因的新型表达载体pRSET—HD-5α。为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础。方法PCR技术，以设计的引物P1／P2从cDNA文库中扩增人α-防御素5基因片段，并将扩增出来的目的基因和pRSET—A质粒用BamHI和EcoRI双酶切后连接构成重组质粒，然后转化大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆。最后对PCR及酶切鉴定含有目的基因的克隆进行测序和电泳。结果获得α-防御素-5基因片断大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；电泳结果证明已将此片段克隆到pRSET—A内。结论成功构建了HD-5α基因的新型表达载体pR—SET—A／HD-5α。