人源性老年痴呆单链噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性老年痴呆(AD)单链噬菌体抗体库,为进一步筛选AD相关抗原的人源性抗体奠定基础.方法 从200 ml AD病人的外周血中分离B淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成总cDNA.以PCR技术,利用特定的引物分别扩增出人抗体的重链和轻链可变区基因片段(VH、VL),并分别克隆入噬菌粒pDAN5中,构建出含人单链抗体可变区(scFv)基因序列的pDAN5克隆载体,电转化感受态大肠杆菌XLI-Blue后,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建成初级噬菌体抗体库.从抗体库中随机挑选数个克隆,提取质粒,PCR扩增目的片段后,用内切酶BstN Ⅰ消化,每个克隆经消化后的DNA指纹印迹用琼脂糖凝胶电泳分析,评价抗体库的多样性.结果 所有抗体VH和VL基因片段均得到了扩增并成功克隆及转化,经辅助噬菌体感染后,构建成初级抗体库.BstN Ⅰ消化后的DNA指纹图谱显示各克隆抗体基因各不相同,经计算构建的噬菌体抗体库容量为1.5×106.结论 利用噬菌体抗体库技术成功构建了AD病人的单链可变区噬菌体抗体库.     

抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体噬菌体抗体库的初建

目的 建立抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体噬体抗体库,为进一步获得功能性抗体可变区基因,制备单链抗体和单链抗体－辣根过氧化物酶融合蛋白,用于甲状腺自身免疫性疾病的治疗和检测打下基础,方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从分泌抗甲状腺刺激性免疫球蛋白的杂交瘤细胞中扩增出轻重链可变区基因,与噬粒表达载体ｐ３ＳＣＭＨ连接,转化大肠杆菌,以甲状腺刺激性免疫球蛋白阳性患者血清ＩｇＧ为抗原对表达的噬菌体抗体进行筛选,结     

人源性抗日本血吸虫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的利用噬菌体抗体展示技术构建人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库并进行初步鉴定。方法RT-PCR从对血吸虫感染有一定抗性成年人外周血淋巴细胞中扩增出入IgG轻链和重链Fd段基因片段，将其克隆入PComb3中．构建人源性Fab段噬菌体抗体库。并用限制性内切酶酶切、序列分析、DOT-BLOT以及SDS-PAGE等方法对噬菌体抗体库进行初步鉴定。结果噬菌体抗体库的滴度为6．2×10^11／L。库容量为1．2×10^7。酶切鉴定结果显示噬菌体抗体库轻重链重组率达到66．6％，测序结果表明克隆入PComb3的是人免疫球蛋白轻链和重链基因,DOT-BLOT实验证明该抗体库表达了人源性的抗体，而SDS-PAGE证实了免疫球蛋白Fab段的可溶性表达。结论成功地构建了人源性抗日本血吸虫Fab段噬菌体抗体库，为筛选人源性抗日本血吸虫的抗体、研究这些抗体的特性和功能奠定了基础。     

特异性抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

噬菌体单链抗体（ＳｃＦｖ）弥补了传统ＭｃＡｂ制备繁琐、抗原性强、穿透力弱等不足,为ＨＣＣ临床和基础研究提供新的手段。我们用基因工程技术和噬菌体表面呈现技术构建和筛选特异性抗ＨＣＣ噬菌体ＳｃＦｖ库。 １．材料与方法：（１）抗ＨＣＣ噬菌体ＳｃＦｖ库的构建：应用ＨＣＣ细胞常规免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,从其脾脏提取ｔＲＮＡ并纯化ｍＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡ,ＰＣＲ扩增抗体轻链和重链可变区,应用ｌｉｎｋｅｒ－（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３装配ＳｃＦＶ基因,在其５’端和３’端分别引入内切酶ＳｆｉＩ和ＮｏｔＩ酶切位点,连接…     

噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎表面抗原单链抗体库

[目的]应用噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)单链抗体(ScFv)库。[方法]提取经免疫具有乙肝表面抗体的正常人淋巴细胞总RNA,采用反转录、触减PCR扩增人免疫球蛋白G(IgG)重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),用Linker连接肽经重叠PCR将VH和VL基因连接成VH-Linker-VL形式的ScFv基因。将ScFv与pCANTAB-5E载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌TG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成全套人源性抗HBsAg ScFv库。[结果]成功构建了人源性抗HBsAg噬菌体ScFv库。[结论]人源性HBsAg噬菌体ScFv库的构建,为进一步筛选特异性高,具有治疗作用的乙肝抗体奠定基础。     

从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体

目的从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAgFab噬菌体抗体。方法用固相化HBsAg对所构建的噬菌体抗体库进行三轮淘筛,从中筛选人抗HBsAgFab噬菌体抗体。结果第三轮淘筛后洗脱下来的噬菌体,较第一轮增加80倍,含有抗体轻链基因和重链基因的克隆,也由淘筛前的17%增至100%,经ELISA证实,筛选到的抗HBsAg噬菌体抗体对HBsAg具有良好的结合活性,而与牛血清白蛋白和HAVAg等无关抗原均不反应。结论HBsAg对抗体库的淘筛,富集了表面呈现抗HBsAg的单克隆抗体的噬菌体。     

从人源免疫抗体库筛选抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体

目的 获得高亲和力的全人源化抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体。 方法 以健康供血者的外周血淋巴细胞为来源,以PreS1肽体外致敏后,借助噬菌体展示技术构建人源免疫单链抗体库,库容量7×10 8。 结果 以PreS1肽进行3轮固相筛选。获得了亲和力10 7～10 8mol/L的抗PreS1单链抗体。结论 通过体外致敏的方法构建人源免疫抗体库,可以快速获得高亲和力基因工程抗体。     

噬菌体抗体库技术研究进展

噬菌体展示技术（PDT）在模拟表位的筛选、筛选特定靶分子的配体、蛋白与蛋白间相互作用、细胞信号转导等基础研究，疾病的治疗和致病机理研究以及疫苗的制备、基因工程抗体的研发等领域均有广泛应用。噬菌体抗体库技术是通过PCR将全套人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经过筛选后获得特异性抗体的技术。该技术融合了丝状噬菌体展示与抗体组合文库技术，得到的抗体称为噬菌体抗体。     

从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体

目的从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体。方法运用噬菌体表面呈现技术,用纯化的H5N1禽流感血凝素蛋白HA（A/Anhui/1/2005）对人源大容量天然抗体库进行富集筛选,对获得的阳性克隆进行序列分析,并将其克隆入携带人源Fc段的表达载体,实现scFv-Fc融合抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,共获得了82株特异性结合H5N1禽流感病毒HA的人源scFv单链抗体,分别属于5个不同的抗体序列,ELISA、IFA表明从抗体库筛选获得的5株人源单抗与禽流感病毒H5N1及其HA具有较好的特异性,而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应。结论从人源大容量天然抗体库中利用高通量的筛选策略在短时间内获得抗禽流感病毒H5N1人源单抗,对于禽流感的紧急预防和治疗具有重要意义。     

人源性阿尔茨海默病噬菌体单链抗体库的构建

目的构建人源性阿尔茨海默病(AD)噬菌体单链抗体(scFv)库,为筛选β淀粉样蛋白(Aβ1-42)的人源性特异性抗体奠定基础。方法采集18例AD患者的外周血40ml,提取总RNA,应用RT-PCR法得到人抗体可变区重链(VH)和可变区轻链(VL)基因。将VH和VL由连接肽连接得到scFv片段,将所得片段双酶切后,克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,大肠埃希菌TG1感受态细胞经电击转化,辅助噬菌体M13K07拯救后构建scFv型噬菌体抗体库。结果总RNA经逆转录PCR扩增VH和VL可变区基因的凝胶电泳显示,PCR产物长度分别为360bp和300bp,其连接形成的scFv片段长度为750bp,最终构建了库容为2.4×109的scFv库。BstNⅠ酶切鉴定构建的scFv库,经凝胶电泳可见,酶切片段长度差异性大,显示scFv库具有良好的多样性。结论成功构建人源性AD噬菌体scFv库,为进一步筛选Aβ特异性抗体,继而为AD的治疗研究奠定基础。     

单项抗-HBe阳性患者中的隐匿性乙型肝炎病毒感染

目的 研究抗-HBe单项阳性患者中隐匿性HBV的感染情况及发生的可能原因.方法 收集HBV血清学标志物检测结果中抗HBe单项强阳性[吸光度(A)值≤0.1]的新鲜血清标本61份,采用实时定量PCR进行HBV DNA含量检测.对于HBV DNA定量阳性的标本,采用雅培试剂复测HBV血清学标志物,采用PCR扩增,并进行克隆测序.结果 61份标本中,2份HBVDNA定量阳性,HBsAg血清学漏检率为3.3％.其中l份标本经雅培试剂复测为抗-HBc单项阳性,其前S区缺失突变和前S2区起始密码子突变,并存在不同突变株混合感染;另1份标本经雅培试剂复测发现,除抗HBe强阳性外,HBsAg和抗- HBc为极弱阳性,未发现前S/S区突变.结论 抗HBe单项阳性患者中存在隐匿性HBV感染和HBsAg血清学漏检情况,后者不仅与前S/S区突变有关,而且与外周血中HBsAg低水平也有一定关系.     

人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库的构建

目的 构建人源抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,为结核特异性单链抗体的筛选奠定基础. 方法 从抗结核分枝杆菌抗体阳性患者淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA,PCR扩增获得抗体的重、轻链可变区基因,然后拼接装配成单链抗体基因,重组于噬菌粒载体pCANTAB5S,转化大肠埃希菌E.coli TG1,以辅助噬菌体拯救后,构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库. 结果 成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体文库,库容量达107. 结论 以结核患者淋巴细胞免疫球蛋白可变区基因片段和噬菌粒展示载体pCANTAB5S为基础,成功构建人源性抗结核分枝杆菌噬菌体展示单链抗体库,并达到建库标准,可进一步从中筛选获得结核特异性单链抗体.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3人源单链抗体的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非结构蛋白（ＮＳ）３的人单链抗体（ＳｃＦｖ）,以解决鼠单抗蝗免疫原性问题,为ＨＣＶ的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组的ＨＣＶＮＳ３为包被抗原,从噬菌体单链楞变区抗体库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得抗原结合活性较强的ＨＣＶＮＳ３人单链抗体（ＳｃＦｖ片段）阳性克隆,并对其进行免疫体及序列测定。结果 筛选出来的ＳｃＦｖ片段     

Study of a humanized inhibitory anti-platelet glycoprotein VI phage antibody from a phage antibody library

Objective: The aims of the study were to study the effect of anti-platelet glycoprotein (GP) VI auto-antibodies on platelet aggregation and use phage surface display technology to produce anti-platelet GPVI phage antibody fragment, which may be developed to inhibit platelet aggregation in the treatment of cardiovascular disease.

Methods: Plasma samples from patients with immune thrombocytopenia (ITP) were screened by monoclonal antibody immobilization of the platelet antigen assay and the platelet aggregation test for anti-platelet GPVI auto-antibody with an inhibitory effect. The humanized anti-platelet GPVI phage antibody was produced by phage surface display technology. The function of the phage antibody fragment against platelet aggregation was examined by the platelet aggregation test.

Results: Of 726 ITP patients, 2 (0.27%) patients’ plasma significantly inhibited platelet aggregation induced by collagen-1. After five rounds of selection, enrichment, and purification, a soluble phage antibody fragment was produced, which can inhibit platelet aggregation induced by collagen-1. The results demonstrate that only a few of the screened anti-platelet GPVI auto-antibodies showed an inhibitory effect on platelet aggregation.

Discussion: A completely humanized anti-GPVI soluble phage antibody can be produced by phage surface display technology. The antibody was able to specifically block collagen-induced platelet aggregation without influencing the aggregation responses to other agonists.

Conclusions: Results of the present study suggest that very few anti-platelet GPVI auto-antibodies inhibit the aggregation function of platelet. The humanized anti-platelet GPVI produced by phage surface display technology is promising to be used to inhibit platelet aggregation in the treatment of cardiovascular disease.     

Isolation of human scFv antibody fragments against ABO blood group antigens from a phage display library

BACKGROUND AND OBJECTIVES: Phage display has proven very useful for the isolation of antibodies against a number of antigens. We used this technology to isolate scFv antibody fragments against A and B red blood cell antigens. MATERIALS AND METHODS: Phages from a phage display library were selected using unmodified red blood cells as a source of antigen. Bound phages were absorbed onto cells lacking the antigen of interest and used to infect Escherichia coli cells. Phages were rescued and assayed for specificity by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: After several rounds of panning and subtraction on red blood cells, one anti-A and one anti-B human scFv antibody fragments were isolated. CONCLUSION: Isolation of anti-A and anti-B scFv antibody fragments on whole cells is an alternative method of obtaining antibodies against native cell-surface antigens.     

乙型肝炎病毒表面抗原人源单链可变区抗体基因的克隆与鉴定

目的 筛选,鉴定抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的编码基因,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗ＨＢＶ的基因治疗研究奠定基础。方法 采用噬菌体表面展示技术,以氯化铯超速离心法纯化的ＨＢｓＡｇ蛋白为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过５轮“吸附－洗脱－扩增”淘洗过程,获得抗原结合活性较强的ＨＢｓＡｇ人源单链可变区抗体阳性克隆,并对其进行免疫     

母亲血清乙型肝炎病毒载量及新生儿外周血游离母亲DNA与新生儿乙型肝炎病毒感染的关系

目的 探讨慢性HBV感染母亲血清HBV DNA载量及新生儿外周血中游离母亲DNA与新生儿HBV感染的关系.方法 等位基因特异性PCR及半套式PCR技术检测慢性HBV感染母亲及其新生儿外周血中游离母亲DNA.荧光定量PCR对母亲外周血血清中HBV DNA定量检测.数据采用阳性率、X2检验、Fisher精确概率等进行统计学分析.结果 筛选出36对母儿信息病例对,有26个新生儿外周血中检测到游离母亲DNA,占72.2%.母-胎DNA转移与新生儿HBsAg、HBV DNA阳性均无关(Fisher精确概率分别为0.278、1.000,均P>0.05),而与新生儿外周血单个核细胞(PBMC)HBV感染有关(Fisher精确概率＝0.026,P<0.05).母-胎DNA转移与母亲血清HBV DNA载量无关(X2=2.097,P>0.05),随着母亲血清HBV DNA载量的增加,其发生新生儿血清HBV DNA阳性的危险性呈增高趋势(总X2=62.21,P<0.05;趋势X2=58.46,P<0.05),而母亲血清HBV DNA载量与新生儿PBMC HBV DNA阳性无关(总X2=4.82,P>0.05).结论 母胎DNA转移与新生儿PBMC HBV感染有关,可能是新生儿HBV感染的一个因素.随着母亲HBV DNA载量增高,新生儿血清HBV DNA阳性的危险性越高.     

结肠癌患者淋巴结构建抗结肠癌噬菌体Fab抗体库

目的　构建 2个结肠癌患者自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库。方法　取 2个结肠癌患者转移淋巴结 ,提取淋巴结总RNA ,逆转录PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA。依次将PCR产物插入载体 pComb3的相应部位 ,噬菌体VCSM13辅助感染。以点印迹检测噬菌体表面Fab的表达。 结果　所选 2种Ig亚类的重链Fd片段、2种κ轻链cDNA得到扩增。Fd片段和κ轻链均插入 pComb3的重组率为 40 %,Fab噬菌体表达库容量达 1.48× 10 6。噬菌体悬液的点印迹免疫染色显示有Fab表达。结论　构建了 2个结肠癌患者自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库 ,为筛选结肠癌相关抗体奠定了基础。