荧光定量反转录PCR检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平

目的 运用荧光定量反转录PCR技术，检测新生儿脐血ζ珠蛋白mRNA的转录水平。方法 以基因型为（αα/αα）的新生儿作为正常对照组，基因型为（――/αα）的新生儿为病例组。选择β肌动蛋白基因为校正基因，ζ珠蛋白基因为目的基因。运用双标准曲线法检测两组新生儿脐血的ζ珠蛋白mRNA的转录水平。结果 病例组的ζ珠蛋白mRNA的平均转录水平明显增高。结论 通过荧光定量反转录PCR技术能够检测出基因型为（――SEA/αα）的新生儿的ζ珠蛋白mRNA转录水平的增高，具有较好的诊断价值。     

实时RT-PCR检测人端粒酶逆转录酶mRNA用于乳腺癌鉴别诊断及与c-Myc基因的相关性

目的 探讨定量检测人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA在乳腺癌鉴别诊断中的价值，并观察原癌基因c-Myc与hTERTmRNA表达的关系。方法 收集癌旁正常乳腺组织、乳腺普通型导管增生、不典型导管增生、导管原位癌、浸润性导管癌病例，采用实时荧光定量RT-PCR技术（Real-timeRT-PCR）定量检测hTERT和e-Myc基因的转录水平。结果 以NhTERT=10为临界值，所有正常组织和良性病变NhTERT值均小于临界值，而hTERT基因转录升高的导管原位癌及浸润性导管癌其NkTERT值均大于此临界值。显示hTERT和e-Myc基因转录水平呈正相关（y=0．7395，P〈0．01）。结论 实时荧光定量PCR技术检测hTERT基因表达具有高敏感性和特异性。能为常规病理学诊断提供客观的参考指标。从而提高乳腺不典型导管增生与导管原位癌鉴别诊断的准确性。原癌基因e-Myc转录水平上调可能与乳腺癌hTERT基因转录激活有关。     

实时荧光定量PCR方法检测急性髓系白血病FLT3基因mRNA的表达

[摘　要]　目的 构建检测急性髓细胞白血病FLT3基因mRNA表达的标准品重组质粒和荧光定量PCR方法，为进一步研究FLT3基因表达与急性髓细胞白血病的关系奠定基础。方法 利用引物设计软件设计出扩增FLT3基因的引物和特异性荧光探针。提取K562细胞株总RNA，经RT-PCR 扩增，产物纯化后与pUCm-T Vector连接，转化到大肠杆菌DH5α，筛选得到标准品的质粒FLT3P。 建立荧光定量PCR 检测 FLT3基因技术方法，建立标准曲线并检测15例初治AML患者。结果 重组质粒进行荧光定量PCR 扩增出现强烈的荧光值增长，表明FLT3 cDNA已成功克隆。以109～105copies/μl不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR 扩增, 所获得的Ct 值与标准品浓度的对数存在良好线性关系, 标准曲线回归系数为0.9998 。AML病例 FLT3表达水平显著高于正常对照组（p=0.017）， 且不同病例的表达水平存在较大差异。结论 成功构建用于定量检测FLT3 mRNA表达得荧光定量PCR的标准品和技术方法; AML病例 FLT3表达水平显著增高。     

血管紧张素转化酶基因多态性与子痫前期

目的探讨孕妇和新生儿血管紧张素转化酶（ACE）基因变异是否与子痫前期有关联。方法应用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）,对四川地区43例汉族子痫前期患者和44例健康对照孕妇及其两组新生儿血管紧张素转化酶基因多态性进行检测;同时用紫外分光光度法检测孕妇和新生儿脐血血管紧张素转化酶活性水平。结果子痫前期组和正常孕妇组ACE基因D等位基因频率两组比较无统计学差异（37.2%vs 29.5%,P〉0.05）;早发型子痫前期组和晚发型子痫前期组ACE基因D等位基因频率比较无统计学差异（32.4%vs 40.4%,P〉0.05）;子痫前期新生儿组和正常新生儿组ACE基因D等位基因频率比较无统计学差异（47.1%vs 32.5%,P〉0.05）。子痫前期组DD基因型携带者较II基因型携带者ACE活性水平显著增高（44.01±12.41 vs 29.96±11.26,P〈0.05）。结论本研究未发现孕妇及新生儿ACE基因变异与子痫前期有关,但子痫前期组DD基因型携带者ACE活性水平显著增高。     

荧光实时定量PCR检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体基因mRNA表达

目的建立荧光实时定量PCR法检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体（AR）基因mRNA表达。方法随机选择ASAⅠ-Ⅱ级老年患者30例,分离外周静脉血淋巴细胞,采用荧光实时定量PCR法检测β1和β2-AR基因mRNA表达,并与半定量PCR检测结果进行比较。结果30例患者外周血淋巴细胞荧光实时定量PCR均检出β1和β2-ARmRNA表达,不同性别组同-基因表达量无显著差异（P〉0.05）;荧光实时定量PCR检测β2-AR mRNA表达量显著高于β1—AR mRNA（P〈0．001）,而半定量PCR随着循环次数增加,β1和β2-ARmRNA表达差异减小。结论所建立的荧光实时定量PCR成功检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2-AR基因mRNA表达,有较高的灵敏性及特异性;半定量PCR扩增平台期影响试验结果判断。     

IL-2及IL-2Rα 基因多态性与汉族儿童支气管哮喘的关联

目的探讨IL-2（rs6822844）及IL-2Rα （rs2104286）基因多态性和汉族儿童支气管哮喘发生的关联。方法随机选取144 例支气管哮喘患儿为病例组,228 例健康儿童为对照组。用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）直接测序鉴定各位点基因型;同时采用qRT-PCR检测对照组IL-2Rα 各基因型外周血IL-2Rα信使核糖核酸（mRNA）相对表达量,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各基因型血浆sIL-2Rα水平。结果IL-2Rα （rs2104286）位点等位基因 A 在病例组分布频率（86.8%）高于对照组（79.4%）（oR=1.708,95%CI：1.113,2.629,p =0.010）,病例组中AA 基因型分布频率（75.0%）高于对照组（62.3%）（ OR=1.745,95%CI：1.058,2.884,p=0.021）;未发现IL-2Rα（rs6822844）位点有多态性分布。对照组中IL-2Rα （rs2104286）位点基因型个体外周血IL-2Rα mRNA相对表达量以及血浆sIL-2Rα水平均高于基因型（Z =-2.029和-2.361,=0.043 和0.018）。结论IL-2Rα （rs2104286）基因多态性可能与汉族儿童支气管哮喘发生相关,而且该位点基因型可影响其转录及表达。     

荧光定量PCR法对糖尿病大鼠肾脏BAX基因表达的检测

目的:对单肾切除糖尿病大鼠肾脏中BAX基因mRNA的拷贝数进行精确定量,以探讨糖尿病肾病的发病机制。方法:以SYBRGreenI作为定量检测中荧光染料,采用实时荧光定量PCR法,对单肾切除糖尿病模型组和单肾切除对照组大鼠肾脏中BAX基因的转录水平进行检测。结果:糖尿病模型组中BAX转录拷贝数明显高于对照组。结论:糖尿病大鼠肾脏中存在BAX基因的转录异常,细胞凋亡亢进可能参与糖尿病肾病的发生发展。     

氢醌对 K562细胞着色性干皮病基因 D转录及表达的影响

目的：探讨苯代谢物氢醌（ HQ）对人白血病细胞株K562细胞中着色性干皮病基因D（ XPD）mRNA转录及蛋白表达的影响。方法：分别用终浓度为0、15、30、60μmol/L HQ溶液处理K562细胞48 h后,单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤效应,Taqman探针实时荧光定量PCR法检测XPD基因mRNA转录水平,蛋白印迹法分析XPD基因蛋白表达水平,观察荧光显微镜下细胞的尾矩,计算mRNA及蛋白的相对表达量。结果：不同浓度HQ处理后,各组细胞尾矩与0μmol/L HQ组比较,差异有统计学意义（ P＜0.05）;不同浓度HQ处理后, K562细胞中XPD基因mRNA和蛋白相对表达量与0μmol/L HQ组比较,差异无统计学意义（ P＞0.05）。结论：HQ处理K562细胞48 h后,细胞中DNA有明显的损伤效应,但XPD基因mRNA及蛋白无变化。     

实时荧光定量PCR法检测EG-1在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其临床意义

目的：通过实时荧光定量PCR法检测内皮衍生基因-1(EG-1)的基因在甲状腺癌组织中的表达,探讨EG-1与甲状腺癌发生、发展的关系。 方法：选取38例甲状腺乳头状癌患者（病例组）和15例良性甲状腺疾病患者的甲状腺组织(对照组）,采用实时荧光定量PCR法检测甲状腺组织中EG-1基因的表达,同时应用免疫组化学法检测EG-1的表达水平。结果：免疫组织化学结果显示, EG-1主要定位于癌细胞的细胞质,甲状腺乳头状癌组织中EG-1 mRNA和蛋白表达水平明显高于良性甲状腺疾病患者 (P<0.05)。EG-1 mRNA表达与组织学分级有关(P<0.05),与性别、年龄无明显关联性(
P>0.05)。结论：EG-1基因在甲状腺乳头状癌组织中表达明显增高,EG-1基因可能在甲状腺癌的发生、发展中起重要作用。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD_(58)基因的表达

目的:应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法:提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMCCD58基因的表达水平,同时检测血清ALT、AST水平。结果:乙型肝炎各组患者PBMCCD58mRNA表达水平较正常对照组明显增高,差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMCCD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论:实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达;乙型肝炎患者PBMCCD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

急性髓细胞性白血病病人TCRζ链基因表达特点

目的建立实时定量PCR方法检测TCRξ链表达水平的方法，了解急性髓细胞性白血病病人外周血TCRξ链基因表达水平。方法采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测31例急性髓细胞性白血病患者（M1型6例，M2型15例，M3型10例）和30例正常人外周血的单个核细胞的TCRξ链表达情况，以β2微球蛋白基因（β2M）作为内参，根据相对定量公式2^-△△α计算急性髓细胞性白血病患者与正常人TCRξ链表达差异倍数。结果与正常人相比，急性髓细胞性白血病患者TCRξ链表达特点可以分为表达缺失（16％）、表达下降（26％）和表达上升（58％）三种情况。而三种不同亚型急性髓细胞性白血病之间的TCRξ链表达模式相似。结论本研究成功建立了SYBR Green Ⅰ荧光实时定量PCR和相关定量分析TCRξ链表达水平技术，并首先报道了急性髓细胞性自血病病人TCRξ链表达水平的变化。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD58基因的表达

目的：应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法：提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMC CD58基因的表达水平，同时检测血清ALT、AST水平。结果：乙型肝炎各组患者PBMC CD58 mRNA表达水平较正常对照组明显增高，差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMC CD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论：实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达；乙型肝炎患者PBMC CD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

1例由脐血血红蛋白电泳追溯到的罕见型新生儿β珠蛋白生成障碍性贫血基因家系分析

目的 对1例新生儿脐血血红蛋白电泳HbA为0,表型与基因型不符的患儿及其家系成员进行基因分析,以研究先证者及家系成员是否携带有未知突变基因,为其以后的优生遗传咨询提供依据.方法 通过采集先证者家系成员外周血进行血细胞分析及血红蛋白毛细管电泳分析,采用PCR+导流杂交法检测常见型珠蛋白生成障碍性贫血基因,对表型和常见珠蛋白生成障碍性贫血基因型不相符者行基因测序.结果 该家系中先证者及其母亲和姐姐检出罕见型β珠蛋白生成障碍性贫血基因CD52(GAT＞ GTT)位点杂合突变,先证者及其姐姐的基因型为β41-42/β52,母亲的基因型为β17/β52,父亲的基因型为β41-42/βN.结论 血液学表型与基因型不符时,应进一步做罕见型基因检测,避免漏诊或误诊.该基因突变的发现,丰富了β珠蛋白生成障碍性贫血基因数据库.     

1例由脐血血红蛋白电泳追溯到的罕见型新生儿β珠蛋白生成障碍性贫血基因家系分析

目的 对1例新生儿脐血血红蛋白电泳HbA为0,表型与基因型不符的患儿及其家系成员进行基因分析,以研究先证者及家系成员是否携带有未知突变基因,为其以后的优生遗传咨询提供依据.方法 通过采集先证者家系成员外周血进行血细胞分析及血红蛋白毛细管电泳分析,采用PCR+导流杂交法检测常见型珠蛋白生成障碍性贫血基因,对表型和常见珠蛋白生成障碍性贫血基因型不相符者行基因测序.结果 该家系中先证者及其母亲和姐姐检出罕见型β珠蛋白生成障碍性贫血基因CD52(GAT＞ GTT)位点杂合突变,先证者及其姐姐的基因型为β41-42/β52,母亲的基因型为β17/β52,父亲的基因型为β41-42/βN.结论 血液学表型与基因型不符时,应进一步做罕见型基因检测,避免漏诊或误诊.该基因突变的发现,丰富了β珠蛋白生成障碍性贫血基因数据库.     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。     

荧光定量RT-PCR技术分析人地中海贫血β654珠蛋白基因转基因小鼠mRNA的表达

目的 采用荧光定量RT-PCR技术检测所制作的人地中海贫血β^654珠蛋白基因转基因小鼠模型mRNA的表达情况,评价该技术应用于小鼠mRNA分析的价值.方法 根据GenBank小鼠mRNA序列,设计用于扩增小鼠mRNA的引物和反向探针,构建荧光定量RT-PCR技术.实验分两组,分别对转基因小鼠和正常小鼠中mRNA进行检测.采用SPSS统计软件,分析和比较两组动物中mRNA的表达量及表达的稳定性.结果 所检测的11只转基因阳性小鼠中检测出人β^654珠蛋白基因mRNA和小鼠内源性mRNA;而在33只正常小鼠中只检测到小鼠内源性mRNA.荧光定量RT-PCR技术可检测到105拷贝数的人β^654珠蛋白基因mRNA和115拷贝数的小鼠内源性mRNA.荧光定量RT-PCR技术分别在F1代和F2转基因阳性小鼠中稳定地检测到,表明转基因小鼠mRNA获得稳定表达.结论 所构建的荧光定量RT-PCR技术分析转基因小鼠mRNA表达具有检测定量、敏感、高效快捷的特点,该方法在鉴定和评估转基因小鼠mRNA的表达中稳定性好、定量准确,具有非常重要的应用价值.     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究 Ⅰ.具有复制能力野生型反转录病毒检测

目的：检测反转录病毒介导的脑肿瘤基因治疗过程中具有复制能力野生型反转录病毒（RCR）。方法：RCR检测主要方法有：DNA聚合酶链式反应（PCR），反转录PCR（RT／PCR），Southern杂交以及neo基因和lacZ基因的补救分析。结果：建立了RCR的检测系统，从DNA水平、RNA水平和病毒活体水平对产HSV－TK病毒包装细胞（TK／VPC），C6转TK基因细胞和实验动物血液可能存在的RCR野生型病毒进行检测，结果均没有检测到野生型反转录病毒。结论：采用的反转录病毒基因转移系统没有产生野生型病毒，为临床试验的安全进行提供了保证。     

CFL2基因半定量多重RT-PCR检测方法的建立

目的在CFL2基因功能的研究中,建立一种能检测CFL2基因mRNA表达水平的半定量多重RT-PCR体系。方法细胞总RNA经反转录合成cDNA,以GAPDH为内参与CFL2进行同管扩增,以常规PCR体系为参照对退火温度、Mg-（2＋）、dNTP和循环数等参数进行优化并与常规组比较,建立了检测C2C12细胞CFL2基因半定量多重RT—PCR体系。结果CFL2和GAPDH的cDNA同时PCR扩增后电泳条带清晰,与预期产物大小一致,两对引物间无明显竞争,其扩增效率和特异性与单一基因的RT—PCR体系相同。结论成功建立CFL2基因半定量多重RT—PCR方法,有利于半定量检测CFL2 mRNA表达变化。     

荧光定量RT PCR法检测OATP B和OATP D mRNA表达

目的建立荧光定量RT—PCR检测肺癌及正常肺组织中人类有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptide, OATP) OATP B、OATP D mRNA表达的方法,了解肺癌和正常肺组织中OATP B、OATP D mRNA的表达水平。 方法利用RT PCR方法从肺癌及正常肺组织中扩增出目的基因片段,用TA克隆的方法将基因片段插入到PGEM T质粒载体中,在Line Gene荧光定量检测系统上建立检测OATP B、OATP D mRNA表达的标准曲线,并通过40例肺癌及正常肺组织标本进行验证。结果成功构建了OATP基因的质粒重组子,建立了在mRNA水平定量检测OATP B、OATP D基因的标准曲线,相关系数为0.998。以荧光定量RT—PCR法检测, OATP B、OATP D 的mRNA在肺癌及正常肺组织中均有表达,且肺癌中OATP B、OATP D mRNA的表达水平高于正常肺组织（P＜0．05）。 结论成功建立了荧光定量RT PCR检测OATP B、OATP D mRNA表达的方法,检测结果用绝对拷贝数表示,定量准确可靠,敏感性高。