格列吡嗪和格列奇特对MIN6细胞的影响

目的:研究不同磺脲类药物对胰岛素分泌细胞的影响及机制。方法:不同浓度格列吡嗪和格列奇特干预MIN6细胞一定时间后,MTT法检测细胞活力变化,运用ROS捕获剂双氢溴乙啶(HE)、双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)和双氢罗丹明123(DHR123)孵育细胞,用荧光显微镜观察细胞内荧光、流式细胞仪检测MIN6细胞的平均荧光强度(MFI)而测得细胞内ROS水平。用Annexin-vFITC和PI双标记细胞凋亡检测法通过流式细胞仪测定细胞凋亡情况。结果:格列吡嗪干预MIN6细胞后,细胞活力明显被抑制(P<0.05);细胞内的MFI明显增加;细胞凋亡率明显增加;而且,细胞活力下降、MFI和细胞凋亡率与药物作用浓度和时间呈正相关。而格列奇特干预MIN6细胞后,细胞活力无明显抑制(P>0.05);细胞内的MFI无明显增加;细胞凋亡率亦无明显增加。结论:格列吡嗪可诱导MIN6细胞发生氧化应激,诱导MIN6细胞凋亡,说明临床上磺脲类药物治疗糖尿病出现失效可能与磺脲类药物诱发胰岛细胞衰竭相关,然而,格列奇特不诱导MIN6细胞损害,说明并非所有磺脲类药物对β细胞都有损害作用。     

高浓度葡萄糖在内皮细胞氧化应激中的作用

目的 探讨高糖对猪髂动脉内皮细胞(PIECs)氧化应激的影响.方法 不同浓度高糖干预PIECs一定时间后,应用活性氧(ROS)捕获剂dihydroethidium(DHE)、双氢罗丹明123(DHR123)孵育细胞,通过荧光显微镜观察细胞内DHE染色,流式细胞仪检测细胞内罗丹明123(rh123)的平均荧光强度(MFI)而测得细胞内ROS水平;以二甲基吖啶硝酸盐为化学发光试剂,通过化学发光仪检测加入NADPH后发光值的变化,以反映高糖对PIECs中NADPH氧化酶(NOX)活性的影响.设立正常组和甘露醇组作为对照.结果 随着高浓度葡萄糖作用浓度和时间的增加,荧光显微镜下高糖组细胞内DHE荧光增强;流式细胞仪检测显示,高糖组细胞内rh123的MFI较对照组明显升高;化学发光仪检测表明,高糖组细胞NOX活性升高显著.结论 高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多、ROS蓄积有关,该效应可能由NOX介导.     

高浓度葡萄糖在内皮细胞氧化应激中的作用

目的探讨高糖对猪髂动脉内皮细胞(PIECs)氧化应激的影响。方法不同浓度高糖干预PIECs一定时间后,应用活性氧(ROS)捕获剂dihydroethidium(DHE)、双氢罗丹明123(DHR123)孵育细胞,通过荧光显微镜观察细胞内DHE染色,流式细胞仪检测细胞内罗丹明123(rh123)的平均荧光强度(MFI)而测得细胞内ROS水平;以二甲基吖啶硝酸盐为化学发光试剂,通过化学发光仪检测加入NADPH后发光值的变化,以反映高糖对PIECs中NADPH氧化酶(NOX)活性的影响。设立正常组和甘露醇组作为对照。结果随着高浓度葡萄糖作用浓度和时间的增加,荧光显微镜下高糖组细胞内DHE荧光增强;流式细胞仪检测显示,高糖组细胞内rh123的MFI较对照组明显升高;化学发光仪检测表明,高糖组细胞NOX活性升高显著。结论高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多、ROS蓄积有关,该效应可能由NOX介导。     

流式细胞术检测细胞内活性氧的方法

目的流式细胞术检测NB4和U937细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平。方法双氢罗丹明123(DHR)以不同的时间孵育细胞(1、6、24h),DHR可被细胞内ROS氧化为罗丹明123,通过流式细胞仪来检测细胞内罗丹明123的荧光,同时设立阴性及阳性对照。结果 1μmol/L DHR孵育细胞,1～24h NB4和U937细胞内的平均荧光强度分别从19.20增加到384.38和12.31增加到97.15。结论适当延长DHR孵育时间可检测不同细胞系ROS基准水平的差异。     

糖化终末产物对内皮细胞氧化应激的影响

目的研究糖化终末产物(AGEs)对猪髂动脉内皮细胞(PIEC)氧化应激的影响。方法不同浓度AGEs干预PIEC一定时间后,MTT比色法检测细胞活力变化。运用活性氧(ROS)捕获剂双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)孵育细胞,通过流式细胞仪检测细胞内二氯荧光黄(DCF)的荧光强度而测得细胞内ROS水平。结果随着AGEs浓度的增加和作用时间的延长,PIEC活力明显下降(P<0.05);细胞活力下降与作用浓度及时间呈显著正相关(r=0.927,P<0.01)。经DCFH-DA孵育后流式细胞仪检测显示,AGEs处理组细胞内DCF平均荧光强度较空白对照组明显升高。结论AGEs抑制内皮细胞活力,使细胞内ROS生成明显增加,直接诱导内皮细胞的氧化应激。     

糖化终末产物对内皮细胞氧化应激的影响

目的 研究糖化终末产物(AGEs)对猪髂动脉内皮细胞(PIEC)氧化应激的影响.方法 不同浓度AGEs干预PIEC一定时间后,MTT比色法检测细胞活力变化.运用活性氧(ROS)捕获剂双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)孵育细胞,通过流式细胞仪检测细胞内二氯荧光黄(DCF)的荧光强度而测得细胞内ROS水平.结果 随着AGEs浓度的增加和作用时间的延长,PIEC活力明显下降(P＜0.05);细胞活力下降与作用浓度及时间呈显著正相关(r=0.927,P＜0.01).经DCFH-DA孵育后流式细胞仪检测显示,AGEs处理组细胞内DCF平均荧光强度较空白对照组明显升高.结论 AGEs抑制内皮细胞活力,使细胞内ROS生成明显增加,直接诱导内皮细胞的氧化应激.     

流式细胞术检测细胞内活性氧的方法

目的：流式细胞术检测NB4和U937细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS)的水平。方法双氢罗丹明123（DHR）以不同的时间孵育细胞（1、6、24h）,DHR可被细胞内ROS氧化为罗丹明123,通过流式细胞仪来检测细胞内罗丹明123的荧光,同时设立阴性及阳性对照。结果1μmol/L DHR孵育细胞,1－24h NB4和U937细胞内的平均荧光强度分别从19．20增加到384．38和12．31增加到97．15。结论适当延长DHR孵育时间可检测不同细胞系ROS基准水平的差异。     

高糖对人腹膜间皮细胞氧化应激的影响

目的 研究不同浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)氧化应激的影响.方法 HPMC体外培养并行免疫组化鉴定,取第2代细胞用于实验.将不同浓度葡萄糖干预HPMC一定时间后,MTT比色法检测细胞活力;采用活性氧捕获剂双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)孵育细胞,通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度而测得细胞内活性氧(ROS)水平.分析不同浓度葡萄糖及不同作用时间对HPMC细胞活力及ROS水平的影响.结果 高糖明显抑制HPMC细胞活力(P＜0.05),随着葡萄糖浓度增加及作用时间的延长,抑制率呈上升趋势.高糖干预HPMC后,细胞内的平均荧光强度明显升高.结论 高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多及ROS蓄积有关.     

高糖对人腹膜间皮细胞氧化应激的影响

目的研究不同浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)氧化应激的影响。方法HPMC体外培养并行免疫组化鉴定,取第2代细胞用于实验。将不同浓度葡萄糖干预HPMC一定时间后,MTT比色法检测细胞活力;采用活性氧捕获剂双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)孵育细胞,通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度而测得细胞内活性氧(ROS)水平。分析不同浓度葡萄糖及不同作用时间对HPMC细胞活力及ROS水平的影响。结果高糖明显抑制HPMC细胞活力(P<0.05),随着葡萄糖浓度增加及作用时间的延长,抑制率呈上升趋势。高糖干预HPMC后,细胞内的平均荧光强度明显升高。结论高糖导致细胞发生氧化应激,其对细胞的损伤作用可能与氧自由基生成过多及ROS蓄积有关。     

胰高血糖素样肽-1抑制软脂酸诱导的MIN6细胞凋亡

目的探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对软脂酸(PA)诱导的MIN6细胞凋亡及分泌胰岛素功能的影响。方法传代培养处于对数生长期的胰岛β细胞MIN6细胞株分为三组。PA组:加入0.5 mmol/L PA孵育36 h;GLP-1 PA组:加入10 nmol/LGLP-1,12 h后再加入0.5 mmol/L PA继续孵育36 h,期间每12 h加1次相同浓度的GLP-1;对照组:未加GLP-1或PA,其他培养条件相同。MTT比色法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡百分率;放射免疫分析法测定MIN6细胞胰岛素分泌量。结果PA组MIN6细胞凋亡率为(39.41±10.16)%,细胞活力较对照组减少25.8%(P<0.05);GLP-1 PA组MIN6细胞凋亡率为(32.80±8.06)%,细胞活力较PA组增强13.88%(P<0.05),其高糖和低糖状态下胰岛素分泌均明显高于PA组(P<0.05)。结论GLP-1可以抑制PA诱导的MIN6细胞凋亡,同时改善细胞胰岛素分泌功能。     

虫草菌丝对IL-1β诱导MIN6细胞凋亡的保护作用与机制的实验研究

目的:观察虫草菌丝(cordyceps sinensis,CS)对IL-1β诱导的小鼠胰岛β细胞瘤MIN6细胞凋亡的影响以及与活性氧和UCP-2的关系,探讨其对胰岛细胞的保护作用及机制。方法:实验分为正常对照组,IL-1β组,IL-1β+CS低浓度组,IL-1β+CS高浓度组。CCK8检测细胞活性,Elisa方法检测MIN6细胞基础胰岛素和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量,Hochest染色以及流式细胞术检测细胞凋亡,化学荧光法检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)活性,Western Blot检测胰岛细胞解偶联蛋白2(uncoupling protein 2,UCP-2)的表达。结果:与正常对照组相比,IL-1β组细胞活性降低,基础和葡萄糖刺激胰岛素分泌量显著减少,细胞凋亡明显增加,同时测得ROS活性增加,UCP-2的表达降低;给予低浓度和高浓度CS作用后,与IL-1β组相比,细胞活性明显提高,基础和葡萄糖刺激胰岛素分泌量增加,细胞凋亡率显著减少,ROS活性降低,同时UCP-2的表达增加。结论:CS可显著提高细胞活性和胰岛素分泌功能,降低IL-1β诱导的MIN6细胞凋亡,其机制可能与增加胰岛细胞UCP-2表达,降低ROS活性有关。     

醛固酮诱导MIN6细胞凋亡及作用机制研究

目的 探讨醛固酮对小鼠胰岛B细胞株MIN6细胞凋亡的影响及可能的作用机制.方法 体外培养的小鼠胰岛B细胞株MIN6分为对照组(加入无血清的DMEM培养基)、醛固酮组(加入10、100、1 000 nmol/L醛同酮进行干预)和醛固酮+拮抗剂组(以100 nmol/L醛固酮和100 nmol/L醛固酮拮抗剂螺内酯共同干预).采用MTT法检测细胞活性;放射免疫分析法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS);流式细胞术结合FITC-Annexin V/PI荧光染色检测细胞凋亡;ELISA法检测细胞培养上清液中Caspas-3活性;Western blotting法检测凋亡相关蛋白细胞色素C(Cyt-C)、Bcl-2、Bax和磷酸化蛋白激酶C(p-Akt)的表达.结果 MIN6细胞增殖活性随醛固酮干预浓度的升高而下降,呈现浓度依赖性.在生理糖浓度(5.6 mmol/L)和高葡萄糖浓度(28 mmol/L)环境中,醛固酮组的GSIS均显著低于与对照组(P＜0.01),而醛固酮+拮抗剂组GSIS显著高于醛固酮组(P＜0.01).醛固酮组细胞凋亡率显著高于对照组(P＜0.01),而醛固酮+拮抗剂组细胞凋亡率显著低于醛固酮组(P＜0.01).与对照组比较,醛固酮组Caspase-3活性明显升高,Cyt-C表达上调,Bcl-2/Bax下降,p-Akt表达下调(均P＜0.01);而醛固酮+拮抗剂组对醛固酮组的Caspase-3活性升高及相关蛋白表达异常具有明显抑制作用.结论 醛固酮具有促进MIN6细胞凋亡的作用,其作用机制可能与Cyt-C、Bcl-2、Bax和Akt介导的线粒体信号途径有关.     

Liraglutide prevents high glucose level induced insulinoma cells apoptosis by targeting autophagy

Background  The pathophysiology of type 2 diabetes is progressive pancreatic beta cell failure with consequential reduced insulin secretion. Glucotoxicity results in the reduction of beta cell mass in type 2 diabetes by inducing apoptosis. Autophagy is essential for the maintenance of normal islet architecture and plays a crucial role in maintaining the intracellular insulin content by accelerating the insulin degradation rate in beta cells. Recently more attention has been paid to the effect of autophagy in type 2 diabetes. The regulatory pathway of autophagy in controlling pancreatic beta cells is still not clear. The aim of our study was to evaluate whether liraglutide can inhibit apoptosis and modulate autophagy in vitro in insulinoma cells (INS-1 cells).

Methods  INS-1 cells were incubated for 24 hours in the presence or absence of high levels of glucose, liraglutide (a long-acting human glucagon-like peptide-1 analogue), or 3-methyadenine (3-MA). Cell viability was measured using the Cell Counting Kit-8 (CCK8) viability assay. Autophagy of INS-1 cells was tested by monodansylcadaverine (MDC) staining, an autophagy fluorescent compound used for the labeling of autophagic vacuoles, and by Western blotting of microtubule-associated protein I light chain 3 (LC3), a biochemical markers of autophagic initiation.

Results  The viability of INS-1 cells was reduced after treatment with high levels of glucose. The viability of INS-1 cells was reduced and apoptosis was increased when autophagy was inhibited. The viability of INS-1 cells was significantly increased by adding liraglutide to supplement high glucose level medium compared with the cells treated with high glucose levels alone. 

Conclusions  Apoptosis and autophagy were increased in rat INS-1 cells when treated with high level of glucose, and the viability of INS-1 cells was significantly reduced by inhibiting autophagy. Liraglutide protected INS-1 cells from high glucose level-induced apoptosis that is accompanied by a significant increase of autophagy, suggesting that liraglutide plays a role in beta cell apoptosis by targeting autophagy. Thus, autophagy may be a new target for the prevention or treatment of diabetes.

     

Visfatin通过线粒体途径抑制胰岛β细胞凋亡

目的 探讨内脏脂肪素（visfatin）对棕榈酸诱导胰岛β细胞凋亡的影响。 方法 小鼠胰岛β细胞株MIN6体外传代培养,进入对数生长期后进行实验。MTT法检测不同浓度visfatin（0~10-7 mol/L）作用24~72 h后MIN6细胞活力变化。流式细胞术检测0.5 mmol/L棕榈酸和(或)10-8 mol/L visfatin处理24 h后MIN6细胞凋亡率的变化;Western blotting检测MIN6抗凋亡蛋白bcl-2、bax、激活型caspase-3和胞质细胞色素C表达的变化。 结果 Visfatin作用24~48 h,MIN6细胞活力呈剂量依赖性增加（P<0.05）。流式细胞仪检测发现,10-8 mol/L visfatin处理24 h可明显降低棕榈酸诱导的细胞凋亡率（P<0.05）;Western blotting结果表明,10-8 mol/L visfatin可显著抑制棕榈酸引起的细胞内源性bcl-2表达的下调及激活型caspase-3和胞质细胞色素C表达的上调（P<0.05）。 结论 Visfatin可促进胰岛β细胞增殖,并通过细胞内线粒体途径抑制由棕榈酸诱导的胰岛β细胞凋亡。     

活性氧介导紫花牡荆素诱导卵巢癌HO-8910细胞调亡

目的:探讨紫花牡荆素(Casticin,CAS)诱导人卵巢癌HO-8910细胞凋亡是否涉及活性氧生成和线粒体膜去极化。方法:体外培养HO-8910细胞。AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率;H2DCFH-DA探针FCM检测细胞活性氧生成;Rh123探针FCM分析细胞线粒体跨膜电位。结果:CAS诱导HO-8910细胞凋亡率增高,呈剂量依赖性。CAS以浓度依赖方式增高HO-8910细胞内活性氧水平。CAS处理细胞的Rh123平均荧光强度显著降低,表明CAS具有诱导细胞线粒体膜去极化作用。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)部分拮抗CAS诱导细胞凋亡,并能减弱CAS诱导活性氧生成和线粒体膜去极化作用。结论:CAS诱导卵巢癌HO-8910细胞凋亡作用机制可能与促进细胞活性氧生成介导的线粒体膜去极化相关。     

隐丹参酮对谷氨酸诱导的皮层神经元凋亡的保护作用

目的:观察隐丹参酮(Cryptotanshinone,CTN)对谷氨酸(Glutamate,Glu)损伤体外原代培养大鼠皮层神经细胞的保护作用并探讨可能的机制.方法:体外培养大鼠大脑皮层神经细胞,建立Glu损伤模型,采用MTT法检测细胞存活率,DCFH-DA染色法检测细胞氧自由基水平,Hoechst荧光染色检测细胞凋亡...     

GLP-1受体激动剂Exendin4对胰岛β细胞胰岛素和IAPP分泌模式的影响

目的：探讨GLP-1受体激动剂（GLP-1RA）Exendin4作用下胰岛β细胞的胰岛素及胰淀粉样多肽（IAPP）的分泌模式。方法：观察小鼠胰岛瘤细胞系MIN6细胞在不同浓度Exendin4作用不同时间后的细胞形态的变化;利用MTT实验检测MIN6细胞在不同干预后的细胞活性的变化;采用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,检测MIN6细胞在不同干预后培养液上清中的胰岛素和IAPP分泌量的变化;采用荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组MIN6细胞的胰岛素和IAPP mRNA表达水平的变化。结果：与正常对照组比较,Exendin4组的细胞数量增加,贴壁牢固,形态正常;细胞活性随Exendin4作用浓度以及作用时间的增加而显著增加,具有一定的浓度及时间依赖性;胰岛素和IAPP的分泌水平随Exendin4作用浓度以及作用时间的增加而显著增加,具有一定的浓度及时间依赖性,而IAPP/胰岛素的比值随作用浓度以及作用时间的增加而减小;胰岛素和IAPP mRNA水平均随Exendin4作用浓度以及作用时间的增加而上调,具有一定的浓度及时间依赖性,IAPP/胰岛素mRNA比值随作用浓度以及作用时间的增加而减小。结论：Exendin4作用于MIN6细胞可增加细胞数量和细胞活性,改善细胞状态,保护胰岛细胞功能;并且可引起胰岛素以及IAPP分泌水平增加,胰岛素和IAPP mRNA表达水平增加,而IAPP/胰岛素比值下降。     

凋亡信号调节激酶1在紫花牡荆素诱导结肠癌细胞凋亡中的作用

目的:研究紫花牡荆素诱导人结肠癌细胞凋亡作用及其作用机制。方法:体外培养人结肠癌HT-29细胞。碘化丙啶(P)I染色流式细胞术(FCM)和细胞凋亡ELISA试剂盒检测细胞凋亡。荧光探针二氯荧光素(DCFH-DA)标记FCM测定细胞内活性氧的含量。Western blot和小干扰RNA转染用于探索其分子机制。结果:紫花牡荆素以浓度依赖性的方式诱导结肠癌HT-29细胞系细胞凋亡。紫花牡荆素引起活性氧(ROS)的产生,并激活HT-29细胞的凋亡信号调节激酶1(ASK1)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理HT-29细胞有效地抑制ASK1活性,减弱紫花牡荆素处理引起的细胞凋亡。ASK1特异小干扰RNA能显著减弱紫花牡荆素诱导HT-29细胞凋亡作用。结论:紫花牡荆素通过刺激活性氧形成活化ASK1诱导结肠癌HT-29细胞凋亡。     

齐墩果酸诱导人肺腺癌细胞A549凋亡及其与细胞内钙离子的关系

目的通过检测齐墩果酸（oleanolic acid,OA）干预后的A549细胞的凋亡和其内钙离子浓度,探索OA对A549细胞的作用及其可能的机制。方法体外培养人肺腺癌细胞系A549。设0、10、20、40μg/ml的OA浓度干预组。选择对数生长期的细胞,在不同浓度OA干预24 h,采用Annexin V/PI流式细胞术（flowcytometry,FCM）检测各实验组细胞的凋亡情况,测定细胞的荧光强度值并计算出细胞内钙离子浓度;以曲线拟合描述细胞凋亡率与钙离子荧光强度之间的相关性。结果FCM检测显示10、20、40μg/ml OA可诱导A549细胞凋亡,凋亡率呈现浓度-效应关系;20、40μg/ml OA干预24 h,A549细胞凋亡率明显增加,与0μg/ml组比较,差异有显著性（P〈0.01）;10、20、40μg/mlOA组干预24 h,各药物干预组A549细胞内钙离子荧光强度均明显高于0μg/ml组,荧光强度随OA浓度的提高呈现增加趋势,差异有显著统计学意义（P〈0.01）;曲线拟合显示细胞凋亡率和细胞内钙离子浓度之间有明显相关性（R=0.981,P〈0.01）。结论OA具有浓度依赖地诱导人肺腺癌细胞凋亡的作用;OA诱导细胞凋亡可能与其导致细胞内钙超载有关。