芹菜素通过下调MDR-1/P-gp表达逆转结肠癌耐药细胞HCT-8/5FU多药耐药性的作用及机制

目的探讨芹菜素逆转结肠癌耐药细胞HCT-8/5FU多药耐药性作用及其机制。方法运用免疫细胞化学技术和逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)测定耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)及耐药基因MDR-1mRNA的表达情况。CCK-8法测定芹菜素对耐药细胞耐药逆转作用;荧光显微镜观察芹菜素、5-FU及二者联合作用时耐药细胞凋亡情况。结果芹菜素能够降低耐药蛋白P-gp糖蛋白及耐药基因MDR-1 mRNA的表达,同时能够逆转耐药细胞的多药耐药性,诱导更多细胞凋亡。结论菜素能够通过下调MDR-1/P-gp表达逆转HCT-8/5FU多药耐药性,从而有可能成为临床多药耐药逆转剂。     

健脾解毒方逆转大肠癌多药耐药基因的研究

目的 从分子生物学的角度探讨健脾解毒方逆转大肠癌多药耐药基因的作用机制,为中医健脾解毒法治疗大肠癌提供理论依据.方法 应用健脾解毒方药对SD大鼠进行灌胃,采集动脉血制备健脾解毒方药物血清,在体外培养人结肠直肠腺癌耐长春新碱细胞HCT-8/V,分别加入培养液配制的5％、10％、15％、20％健脾解毒方药物血清,采用MTT方法检测各组HCT-8/V细胞生长抑制率.结果 健脾解毒方药物血清对HCT-8/V细胞有抑制作用,随浓度升高、时间延长,其抑制作用增强,呈剂量和时间效应关系.20％的药物血清和VCR在24、48、72 h对肿瘤细胞的生长抑制率均有统计学差异(P＜0.01),随作用时间延长,对肿瘤细胞的杀伤作用明显增强.结论 健脾解毒方可逆转大肠癌多药耐药基因,并伴随相关基因的调控.     

姜黄素对人肝癌耐药细胞株Bel7402/5-FU多药耐药性的逆转作用

目的:探讨姜黄素对人肝癌耐药细胞株Bel7402/5-FU多药耐药性的逆转作用及可能的作用机制.方法:采用氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)药物浓度梯度递增法诱导建立肝癌耐药细胞亚系Bel7402/5-FU;MTT法检测人肝癌细胞株Bel7402及其耐药细胞株Bel7402/5-FU对6种化疗药物以及姜黄素的敏感性;Western blot法检测Bel7402细胞、Bel7402/5-FU细胞及经过0、5、10、20mg/L姜黄素作用后的Bel7402/5FU细胞中多药耐药相关蛋白1(MRP1)、肺耐药相关蛋白(LRP)、P-糖蛋白(P-gp)、程序化死亡因子5(PDCD5)蛋白的表达水平.结果:Bel7402/5-FU细胞对6种化疗药物表现出交叉耐药性,其中对5-FU耐药指数最高;与Bel7402细胞相比,Bel7402/5-FU细胞中的MRP1、LRP、P-gp蛋白表达升高,PDCD5蛋白表达降低;随姜黄素浓度的升高,Bel7402/5FU细胞中MRP1、LRP、P-gp蛋白表达逐渐降低,PDCD5蛋白表达逐渐增高.结论:姜黄素具有逆转肝癌细胞多药耐药性的作用,可能与下调多药耐药相关蛋白MRP1、LRP、P-gp,上调凋亡相关蛋白PDCD5表达有关.     

至真方调控Hedgehog信号通路对HCT-8/VCR多药耐药的影响

[目的]探讨至真方含药血清对人大肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/VCR多药耐药性的逆转作用,及对Hedgehog信号通路中Smo、Gli1表达的影响。[方法]CCK-8法测定细胞多药耐药性及存活率;Real-time PCR及Western blot分别从基因及蛋白水平检测P-gp和Hedgehog信号通路中Smo、Gli1的表达。[结果]至真方含药血清作用24h、48h后,HCT-8/VCR生存率明显降低;至真方含药血清作用24h后,HCT-8/VCR细胞P-gp(P-Glycoprotein)、Smo、Gli1基因及蛋白表达均降低,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P0.05),与阳性对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。[结论]至真方对HCT-8/VCR的逆转作用可能与其抑制Hedgehog信号通路,下调该通路相关蛋白表达进而下调P-gp表达,增加HCT-8/VCR对化疗药物的敏感性有关。     

从Akt/COX-2/P-gp信号通路研究丹参酚酸B逆转HCT-8/VCR细胞多药耐药的作用及机制

[目的]探讨丹参酚酸B(Sal-B)对人大肠癌多药耐药细胞HCT-8/VCR耐药的逆转作用,并从Akt/COX-2/P-gp信号通路探讨Sal-B逆转HCT-8/VCR细胞多药耐药的可能有效机制。[方法]1 MTT法鉴定HCT-8/VCR细胞的多药耐药性并检测Sal-B对HCT-8/VCR细胞的耐药逆转作用;2RT-PCR检测细胞中Akt、COX-2、MDR1基因表达情况;3Western blot检测细胞中Akt、p-Akt、COX-2、P-gp蛋白表达情况。[结果]HCT-8/VCR细胞有明显多药耐药性;Sal-B干预HCT-8/VCR细胞48h后,能增加其对不同化疗药物VCR、5-Fu、CDDP、TAXOL的敏感性,各化疗药物的半数抑制浓度IC50均明显下降(P0.05);Sal-B干预HCT-8/VCR细胞48h后,使pAkt、COX-2、P-gp蛋白相对表达量均明显下调(P0.05),而对Akt蛋白表达无影响;Sal-B组COX-2、P-gp基因相对表达量均明显减少(P0.05),而对Akt基因表达无影响。[结论]Sal-B能有效改善HCT-8/VCR细胞的多药耐药性,其机制可能是通过抑制Akt磷酸化,下调COX-2的表达,进而减少MDR1/P-gp的表达。     

从NF-κB信号通路研究至真方对HCT-8/VCR细胞多药耐药的影响及机制

[目的]观察至真方含药血清对人大肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/VCR多药耐药的影响,并从NF-κB信号通路探讨其作用机制。[方法]用8%、16%、32%体积分数的至真方含药血清干预人大肠癌敏感细胞株HCT-8与耐长春新碱细胞株HCT-8/VCR,CCK8法检测细胞多药耐药性及存活率;ELISA法检测NF-κB活性;AnnexinV/PI流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测NF-κB/p65、IκB-α和Caspase-3蛋白的表达。[结果]体积分数8%时,高、中、低剂量含药血清组对HCT-8/VCR细胞的抑制率与空白血清组比较差异均有统计学意义(P0.01),且呈浓度递增趋势;8%、16%、32%体积分数的中剂量组至真方含药血清作用于HCT-8/VCR细胞24h后,NF-κB活性较HCT-8/VCR阴性对照组明显降低(P0.01);至真方含药血清可促进HCT-8/VCR细胞凋亡,且在一定范围内细胞凋亡率呈浓度依赖性;经至真方含药血清处理后,HCT-8/VCR细胞NF-κB/p65蛋白表达较用药前明显下降(P0.05),IκB-α蛋白表达明显上调(P0.05),Caspase-3蛋白表达明显上调(P0.05)。[结论]至真方含药血清可降低HCT-8/VCR细胞NF-κB的活性,一定程度上逆转了大肠癌细胞的多药耐药,其机制可能与抑制该通路分子开关IκB-α的磷酸化,下调NF-κB/p65蛋白的表达,从而上调通路下游的Caspase-3蛋白的表达,诱导HCT-8/VCR细胞凋亡有关。     

ERK信号通路参与至真方逆转人大肠癌多药耐药细胞HCT-8/VCR耐药作用机制的研究

[目的]探讨至真方是否通过影响ERK通路活性,下调P-gp蛋白及ERK、MDR1mRNA表达,逆转人大肠癌多药耐药细胞HCT-8/VCR多药耐药。[方法]细胞增殖-毒性检验CCK-8(cell counting kit-8)法鉴定HCT-8/VCR细胞株的多药耐药性及存活率;流式细胞仪测定细胞内罗丹明123(Rh123)的平均荧光强度;Real-time PCR及Western blot检测ERK、p-ERK、P-gp的基因和蛋白的表达。[结果]HCT-8/VCR为多药耐药细胞;至真方含药血清可明显抑制HCT-8/VCR细胞生长;HCT-8/VCR细胞经8%、16%、32%至真方含药血清干预48h后,细胞内Rho123外排减少,波峰右移,细胞内荧光强度明显增强(P0.01);HCT-8/VCR细胞ERK、MDR1mRNA的表达水平均有所下降,且呈浓度依赖性;p-ERK表达较用药前(0.764±0.001)明显下降(P0.01),分别为(0.513±0.002)、(0.498±0.001)、(0.471±0.12);ERK表达较用药前(0.771±0.204)分别下降至(0.437±0.004)、(0.413±0.002)、(0.398±0.001),(P0.01)。P-gp表达较用药前(0.94±0.014)下降至(0.701±0.01)、(0.663±0.01)、(0.508±0.02),(P0.01)。[结论]至真方可逆转人大肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR的耐药作用,其机制与降低P-gp外排功能、降低ERK通路活性、下调P-gp蛋白及基因表达有关。     

人大肠癌HCT-8/5-FU耐药细胞株的建立及P-gp测定

目的：建立人大肠癌多药耐药细胞株HCT-8/5- FU及并对其耐药机制进行探讨．方法：先采用较大剂量间歇诱导法进行筛选,再采用浓度梯度递增法作用,历时7mo,至HCT8细胞可长期在5-FU浓度为2．0mg/L的细胞培养液中稳定生长．电镜、HE染色观察2种细胞形态结构差异．体外细胞毒性实验观察他对5-FU ADM,DDP的耐药性．绘制亲本细胞和耐药细胞的体外生长曲线．罗丹明染色法检测其两种细胞P-gp功能表达．结果：HCT-8细胞株经7mo诱导,可在5-FU 2．0 g/L的培养液中稳定增殖,具有多药耐药性,命名为HCT-8/5-FU,该细胞株对5-FU的耐药指数为16．6,并对ADM,DDP有交叉耐药性．该细胞株体外群体倍增时间与亲本细胞差别不显著．HE染色观察耐药细胞胞体较亲本细胞大,细胞核不规则,可见双核、多形核,细胞形态不规则,呈多角形、细长形改变,可见巨核细胞．透射电镜下耐药细胞胞质内线粒体、内质网、溶酶体增多．流式细胞仪罗丹明染色法观察荧光强度曲线左移,提示耐药细胞有过度P-gp表达．结论：成功建立HCT-8/5-FU多药耐药细胞株．先采用较大剂量间歇诱导进行筛选,再采用浓度梯度递增法作用是诱导大肠癌耐药细胞株的较好方式．HCT-8/5-FU细胞株的耐药机制与P-糖蛋白表达有关．     

至真方对人大肠癌多药耐药细胞株HCT-8/VCR中核因子-κB及P糖蛋白表达的影响

[目的]从核因子-κB（NF-κB）途径研究至真方对大肠癌多药耐药（MDR）细胞株———人大肠癌细胞株及长春新碱细胞株（HCT-8/VCR）的逆转作用及P糖蛋白（P-gp）表达的影响。[方法]CCK-8法测定HCT-8/VCR的MDR性及至真方含药血清对HCT-8/VCR细胞株的逆转作用;Real-time PCR及Western blot检测NF-κB/p65、MDR1mRNA,NF-κB/p65、P-gp蛋白的表达。[结果]至真方含药血清可明显抑制HCT-8/VCR细胞生长。不同浓度至真方含药血清作用24h后,HCT-8/VCR细胞NF-κB/p65、MDR1mRNA及NF-κB/p65、P-gp蛋白表达均降低,且呈浓度依赖性,与阴性对照组相比差异均有统计学意义（P〈0.05）。[结论]至真方对人大肠癌MDR细胞株HCT-8/VCR的逆转作用可能与其下调NF-κB、P-gp的表达相关。     

姜黄素通过活化PI3K/Akt信号通路逆转肝癌耐药细胞株Bel7402/ADR的耐药性

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的活化在姜黄素逆转肝癌耐药细胞株Bel7402/ADR耐药中的作用。方法采用阿霉素药物浓度递增法诱导建立肝癌耐药细胞株Bel7402/ADR;MTT法检测Bel7402/ADR细胞对阿霉素的敏感性,姜黄素对Bel7402/ADR细胞活性的影响及姜黄素对Bel7402/ADR细胞耐药逆转的作用;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western印迹法检测Bel7402和Bel7402/ADR细胞株中PI3K/AKT蛋白的表达水平;构建Bel7402/ADR皮下瘤模型,考察姜黄素对肿瘤生长的影响,最后通过检测小鼠体重及观察小鼠主要脏器的病理切片分析药物的在体毒性。结果 Bel7402/ADR细胞对阿霉素的半数抑制浓度(IC50)值为(1514.6±12.6)μg/ml,耐药倍数为24.3;姜黄素对Bel7402和Bel7402/ADR细胞活性均具有一定的抑制作用,IC50值分别为:(95.8±3.9)μg/ml和(101.4±3.1)μg/ml;5、10μg/ml姜黄素为Bel7402/ADR细胞无毒剂量,对Bel7402/ADR细胞的耐药逆转倍数分别为:1.97和3.51倍,并诱导细胞凋亡。姜黄素可以诱导细胞中PI3K/Akt蛋白表达水平的降低,并随着姜黄素的浓度升高而降低;姜黄素联合阿霉素可以有效抑制肿瘤生长,并表现很低的在体毒性。结论姜黄素在体和离体上可以显著逆转Bel7402/ADR的耐药性,并表现出很好的抗肿瘤效果,姜黄素的耐药逆转机制可能是抑制PI3K/Akt信号通路活化,下调PI3K/Akt蛋白表达,降低细胞对阿霉素的耐受性。     

Modulation of multidrug resistance by andrographolid in a HCT‐8/5‐FU multidrug‐resistant colorectal cancer cell line

OBJECTIVE To develop an HCT‐8/5‐FU multidrug‐resistant colorectal cancer cell line and to elucidate the effect of Andrographolid (AG), an extract from Andrographis paniculate, a medicinal herb on the HCT‐8/5‐FU multidrug‐resistant colorectal cancer cell line. METHODS An HCT‐8 colorectal cancer cell line was used and a high concentration of 5‐Fluorouracid (5‐FU) was introduced at the beginning to induce drug resistance, then the concentration of 5‐FU was increased in gradients. Approximately 7 months later, the cells grew stably in 2.0 µg/mL of 5‐FU, and the cell line was named HCT‐8/5‐FU multidrug‐resistant colorectal cancer cell line. The resistant index of HCT‐8/5‐FU cells to 5‐FU, adriamycin (ADM), cisplatin (DDP) was checked by MTT test, and a growth curve was drawn. The morphological changes were observed by both light and electron microscope. The function of P‐170 was detected by rhodamine staining. After the application of AG and co‐administration of 5‐FU, ADM and DDP, the growth curves and inhibition rate as well as apoptosis rate of HCT‐8/5‐FU at different concentrations of AG were evaluated by MTT and flow cytometry. Rhodamine staining was used to investigate the possible mechanism involved by AG. RESULTS The resistance index of HCT‐8/5‐FU to 5‐FU was 16.6, and a cross‐resistance to ADM and DDP was noticed. Compared with parental cells, HCT‐8/5‐FU cell's growth rate did not change significantly but the cell's morphology was remarkably changed as compared with parental cells. Overexpression of P‐170 by HCT‐8/5‐FU cell was indicated through rhodamine staining. AG at a low concentration showed weak inhibitory effect on HCT‐8/5‐FU. However, a remarkable inhibitory and apoptosis rate was shown when AG was co‐administered with 5‐FU, ADM and DDP, respectively. Interestingly AG alone could not induce apoptosis and change the cell cycles. AG might affect the expression of P‐170, which was indicated by rhodamine staining. CONCLUSIONS The HCT‐8/5‐FU multidrug‐resistant colorectal cancer cell line has been successfully developed and because it has cross‐resistance to 5‐FU, ADM and DDP, it might serve as an ideal multidrug resistance (MDR) model for colorectal cancer research. The mechanism of HCT‐8/5‐FU resistance to chemotherapeutic agents might be related to the overexpression of P‐170. Low concentrations of AG alone have no significant inhibition on HCT‐8/5‐FU and fail to induce apoptosis and to change cell cycles. AG might act as a chemosensitizer when co‐administered with 5‐FU, ADM and DDP, and the mechanism of reversal modulation of multidrug resistance by AG in the HCT‐8/5‐FU resistant cell line might be related to its downregulation of overexpression of P‐170.     

洛贝林逆转胃癌细胞SGC7901/VCR多药耐药的作用

目的:探讨哌啶类生物碱洛贝林(Lobeline)能否逆转人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR的多药耐药,并进一步探讨洛贝林逆转其多药耐药的机制,评估其有效性.方法:以人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR为研究对象,用四氮唑蓝(MTT)法分别测定在无和有洛贝林(细胞无毒浓度10 mol/L)作用下多药耐药细胞株SGC7901/VCR对VCR及5-Fu的半数生长抑制率,并由此求其耐药逆转的倍数;RT-PCR分别检测在无和不同终浓度洛贝林(5、10、20、50、100 mol/L)作用下多药耐药细胞株SGC7901/VCR的多药耐药基因MDR1 mRNA表达情况;Western blot分别检测在无和不同终浓度洛贝林(5、10、20、50、100 mol/L)作用下多药耐药细胞株SGC7901/VCR的P-gp蛋白表达.结果:在洛贝林无毒作用浓度(10 mol/L)作用下,多药耐药细胞株SGC7901/VCR对化疗药的敏感性增加,VCR对耐药细胞株的IC50由原来的16.55 g/L±0.13 g/L变成7.27g/L±0.65 g/L,逆转指数约为2.28;5-Fu对耐药细胞株的IC50由原来的11.01 g/L±0.43 g/L变成9.53 g/L±0.79 g/L,逆转指数约为1.16;RT-PCR检测示多药耐药细胞株SGC7901/VCR呈现MDR1 mRNA高度表达,随洛贝林终作用浓度的增大,MDR1 mRNA表达逐渐下降,各组间差距有统计学意义(P<0.05);Western blot检测表明多药耐药细胞株SGC7901/VCR高度表达P-gp蛋白,随洛贝林作用终浓度依次增加P-gp蛋白表达依次减弱,组间呈浓度依赖性,差别有统计学意义(P<0.05).结论:无细胞毒作用浓度的洛贝林可以逆转胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR的多药耐药,增强VCR和5-Fu的化疗敏感性.洛贝林对SGC7901/VCR细胞多药耐药的逆转可能机制为抑制P-gp蛋白的表达.     

结肠癌耐药细胞株LoVo/5-FU的建立及其差异表达基因的筛选

目的:建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关基因.方法:采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线:用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用基因芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中的差异表达基因,从中筛选出可能的耐药相关基因;用半定量RT-PCR方法对筛选出的部分耐药相关基因在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证.结果:LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大.LoVo/5-FU对5-FU、ADM、MMC耐药,而对CDDP无耐药性(RI:7.69,2.78,1.43和0.96).通过基因芯片筛选出差异表达基因425个,可能的耐药相关基因包括CYP1B1,NAT2,RNF20,SNAI2,MAP3K2,其中CYP1B1在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异(Cy5/Cv3=5.877).结论:LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,耐药机制可能与CYP1B1,NAT2等耐药相关基因有关.     

维拉帕米逆转胃癌细胞系SGC7901/VCR多药耐药性的研究

目的研究维拉帕米对人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR多药耐药性的逆转效应.方法利用RT-PCR、免疫组化以及MTT等方法,观察维拉帕米对体外培养SGC7901/VCR细胞系耐药性的逆转作用.结果RT-PCR、免疫组化和MTT结果表明维拉帕米可以使SGC7901/VCR的MDRl基因表达水平和P-gP糖蛋白表达降低,细胞对丝裂霉素、替加氟等药物的敏感性明显增加.结论维拉帕米在体外有逆转SGC7901/VCR胞多药耐药的效应.     

Bax基因对人胃癌耐药细胞多药耐药性的逆转作用

目的 研究凋亡相关基因Ｂax对胃癌多药耐药细胞的多药耐药性的逆转作用。方法 构建含有人Ｂax cＤＮＡ全长的真核表达载体pＢＫ－Ｂax,经脂质体导入缺乏Ｂax蛋白表达的人 胃癌多药耐药细胞系ＳＧＣ７９０１/ＶＣＲ中。Ｗestern印迹观察Ｂax基因在转导细胞中的表达,ＭＴＴ法检测Ｂax转导细胞与空载体转导细胞对化疗药物的敏感性。结果 成功构建了Ｂax的真核表达载体,Ｂav转导细胞能稳定表达Ｂax蛋白,与空载体转导细胞相比。Ｂ     

反义核酸逆转人白血病多药耐药细胞株耐药性的实验研究

目的 采用一段人工合成的互补于多药耐药基因的反义硫代磷酸寡核苷酸转染白血病多药耐药细胞株Ｋ５６２／ＡＤＭ,来逆转白血病细胞的多药耐药。方法 四唑蓝快速比色法检测Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞对阿霉素的半数抑制量,流式细胞仪分析细胞内的柔红霉素含量,免疫细胞化学染色方法确定Ｐ１７０的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测ｍｄｒ１－ｍＲＮＡ的相对水平。