大鼠心脏移植后心肌细胞凋亡的研究

目的观察大鼠同种异体心脏移植后心肌细胞凋亡的情况。方法SD大鼠80只,建立同种腹腔异位心脏移植模型,术后1、3、7、10 d取移植心脏组织,进行苏木素-伊红(HE)染色,光镜下进行Stanford病例诊断分级,原位末端标记(TUNEL)技术检测凋亡细胞,免疫组织化学测定心肌bcl-2、bax蛋白的表达,观察移植后不同时期心肌细胞病理变化与细胞凋亡情况。结果移植后各期均出现心肌细胞凋亡现象,术后7 d达到高峰,凋亡指数随病变程度的严重而升高,同时bax蛋白表达上调,而bcl-2蛋白表达上调时,凋亡指数较低。结论心脏移植后心肌细胞凋亡是心肌损伤的主要机制之一,凋亡指数可作为判断移植后损伤程度的指标。     

脾切除对心脏移植大鼠外周血淋巴细胞凋亡及调节性T淋巴细胞的影响

目的 探讨脾切除对同种异体心脏移植大鼠外周血淋巴细胞凋亡及调节性T淋巴细胞的影响.方法 以Wistar大鼠为供者、SD大鼠为受者,进行腹部异位心脏移植,同时切除受者的脾脏(心脏移植切脾组),并以不切脾者为对照(心脏移植对照组),另设不行任何处理的对照组和单纯切脾的单纯切脾组.术后第1、3、5、7天.取各组受者的移植心脏和外周血,观察移植心脏的组织学变化和细胞超微结构改变情况,以流式细胞仪检测外周血淋巴细胞的凋亡率及CD4+ CD25+ T淋巴细胞的变化,逆转录聚合酶链反应检测CD4+ CD25+ T淋巴细胞上Foxp3 mRNA的表达情况,记录移植心脏的存活时间.结果 心脏移植对照组移植心脏存活时间为(7.47±2.24)d,心脏移植切脾组移植心脏存活时间为(17.63±4.54)d,二者间的差异有统计学意义(P<0.05).心脏移植对照组的移植心脏肿胀,质硬,色暗,间质水肿、出血,弥漫性炎症细胞浸润,大量心肌细胞坏死、溶解,横纹不清;心脏移植切脾组的移植心脏质软,色红,局部灰白,外膜下以及细胞间局灶性水肿,炎症细胞浸润,心肌细胞结构完整,横纹清晰;心脏移植切脾组的细胞超微结构改变轻于心脏移植对照组.心脏移植切脾组术后第5天和第7天的淋巴细胞凋亡率分别为(7.62±2.15)%和(9.41±3.82)%,明显高于心脏移植对照组(P<0.05,P<0.05).心脏移植切脾组术后第3、5、7天时的CD4+ CD25+ T淋巴细胞明显多于心脏移植对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.01),其Foxp3 mRNA的表达也较心脏移植对照组明显上调.结论 脾切除使心脏移植大鼠外周血淋巴细胞凋亡率增加,调节性T淋巴细胞增多,其Foxp3 mRNA表达上调,这些变化与移植心脏病理改变呈负相关.     

大鼠心脏移植与动脉硬化

目的 探讨移植心脏的冠状动脉硬化的发生和发展。方法 以供体脾细胞（SPC）和环磷酰胺（CP）预处理移植受体,诱导受体对移植物的免疫耐受。在移植术后的不同时间,取出移植心脏,行Van Gieson染色,对移植心脏的冠状动脉硬化进行分析。结果 SPC和CP预处理后,移植心脏的存活时间明显延长,冠状动脉硬化明显减轻。结论 胶原纤维在血管壁内的广泛当浸润,是引起冠状动脉向心性狭窄的主要原因之一;SPC和CP预处理,可以预防和减缓移植心脏动脉硬化的发生和发展。     

FK506对大鼠心脏移植细胞凋亡的作用

目的　观察大鼠心脏移植急性排斥反应中的细胞凋亡现象及FK5 0 6对它的影响。方法　进行 48次SD→Wistar的大鼠颈部心脏移植 ,用苏木素 伊红 (HE)染色和原位末端标记(TUNEL)技术检测移植心切片 ,进行排斥反应的病理分级并计算凋亡指数 (AI)。结果　移植心的细胞凋亡主要发生于心肌细胞 ;FK5 0 6能明显减少心肌细胞的凋亡 ,减轻移植心的组织损伤。移植后第 3、5、7天AI对照组分别为 3.73± 2 .32、8.30± 2 .97、10 .2 2± 5 .5 2 ;FK5 0 6治疗组为 1.2 7± 1.2 0、2 .89± 2 .18、3.11± 1.6 8;两组比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。结论　细胞凋亡是心脏移植急性排斥中组织损伤的重要机制 ;FK5 0 6能明显抑制心肌细胞凋亡 ,这可能是FK5 0 6发挥免疫抑制作用的重要方面。     

CD4+CD25+T细胞对同种异体小鼠心脏移植的免疫调节作用

目的 观察CD4+CD25+T细胞(Treg)对小鼠同种异体心脏移植的免疫调节作用.方法 流式细胞仪检测正常小鼠和胸腺切除+PC61小鼠淋巴结、脾脏和外周血的Treg的比例.将供体鼠BALB/C心脏移植到受体鼠B6腹腔内,观察对照组(n=6)、胸腺切除组(THY,n=8)、hCTLA4Ig组(n=8)、DST+hCTLA4Ig组(n=8)和THY+PC61+DST+hCTLA4Ig组(n=6)小鼠心脏移植后生存时间和移植心脏病理学检查.结果 正常B6小鼠淋巴结、脾脏和外周血的Treg的比例分别为5.1%、4.5%和1. 7%,明显高于胸腺切除+PC61处理组(1. 8%、1.7%、0.7%).移植心脏平均存活时间在对照组和胸腺切除组分别为(8.2±2.9)d和(7.6±3.0)d,两组间差异无统计学意义(P＞0.05);而在hCTLA4Ig组和DST+hCTLA4Ig组分别为(43.0±11.8)d和(135.0±29.7)d,均较对照组或胸腺切除组明显延长(P＜0.01);THY+PC61+DST+hCTLA4Ig组移植心脏平均存活时间(25.8±8.9)d,也明显较对照组明显延长,但短于hCTLA4Ig组和DST+hCTLA4Ig组(P＜0.01).DST+hCTLA4Ig组移植的心脏存活时间(135.0±29.7)d明显高于其他各组(P＜0.01),其病理组织学表现为间质内有较多的淋巴细胞浸润,伴毛细血管增生,管壁增厚,间质纤维化.结论 CD4+CD25+T细胞水平对同种异体心脏移植的免疫耐受具有免疫调节作用.

Abstract：

Objective To investigate the immunoregulation effects of CD4 + CD25 + T cells in mice heart allograft transplantation. Methods Flow cytometry was used to analyze the contents of CD4 + CD25 +T regulatory cells (Tregs) of the lymph nodes, spleen and blood in the normal mice group and the thymusectomy (THY) + PC61 group. BALB/C mice served as the donors and C57BL/6 (B6) mice as the recipients. Five groups were established, including control group ( n = 6 ), THY group ( n = 8 ), hCTLA4Ig group ( n = 8 ), DST ( donor-specific T-depleted spleen cells) + hCTLA4Ig group ( n = 8) and THY + PC61+ DST + hCTLA4Ig group (n = 6). The survival time after heart allograft transplantation was observed and pathological examination was done in different groups. Results In control group, the rate of Tregs in lymph nodes, spleen and blood was 5. 1%, 4. 5% and 1.7% respectively, which was significantly higher than in THY + PC61 group ( 1. 8% , 1. 7% and 0. 7% respectively). The average survival time of control and THY groups was 8. 2 ± 2.9 and 7.6 ± 3. 0 days respectively ( P ＞ 0. 05 ). The average survival time of hCTLA4Ig and DST + hCTLA4Ig groups was 43.0 ± 11.8 and 135.0 ± 29. 7 days respectively, which was significantly longer than in control group or THY group ( P ＜0. 01 ). The average survival time of THY +PC61 + DST + hCTLA4Ig group was 25.8 ± 8.9 days, which was significantly longer than in control group,but shorter than in hCTLA4Ig group or DST + hCTLA4Ig group ( P ＜ 0. 01 ). The survival time in DST +hCTLA4Ig group was 135.0 ± 29. 7 days, which was significantly longer than other groups ( P ＜ 0. 01 ).The pathological examination revealed that there were more lymphocytes infiltration and capillary vessel proliferation in the desmohemoblast in the transplanted heart of DST + hCTLA4Ig group. Conclusion CD4 +CD25 +T cells regulate the immune tolerance in the allograft transplantation.     

供体抗原特异性T细胞疫苗诱导大鼠移植心存活延长

采用大鼠异位(腹腔)心脏移植模型,使T细胞疫苗的提供者和接受者成为同一个体,探讨供体抗原致敏的T细胞疫苗接种对移植物存活期的影响,为其应用于临床防治排斥反应提供可行性依据。结果显示,T细胞疫苗可明显延长同种移植物的存活。注射T细胞疫苗后,虽然也使第三供体的移植心存活期明显延长(21.57±8.02天),但与特异供体移植心的存活期(40.75±25.15天)相比,有明显差异,证明其作用具有供体抗原特异性。本实验结果也表明使疫苗的提供者和接受者成为同一个体是可行的。     

大鼠异位心脏移植模型的建立及应用

大鼠异位心脏移植模型在移植免疫、基因治疗、心肌缺血再灌注等领域得到了广泛的应用。本文就大鼠异位心脏移植模型的实验动物选择、主要术式的改进及应用现状等进行综述。     

改进后的大鼠颈部心脏移植模型

成功的大鼠同种异位心脏移植模型要求操作简便、手术创伤小、受者长期存活率高。因此，我们对传统的Heron大鼠颈部心脏移植模型进行改进，现将改进后的术式、操作体会及优点报告如下。     

细胞凋亡与心脏移植

本文概述了细胞凋亡与心脏移植的关系。从抗凋亡途径保护供心 ,将为心脏移植提供新的研究方向。     

大鼠心脏移植与心肌细胞坏死

目的 探讨心肌细胞坏死在心脏移植中的发生和发展情况，为心脏移植的抗排斥反应治疗和预防提供依据。方法 用供体脾细胞（ＳＰＣ）和环磷酰胺（ＣＰ）预处理移植受体，ＨＥ染色对移植心脏的炎细胞浸润和心肌细胞坏死进行分析。结果 经ＳＰＣ和ＣＰ预处理后，移植心脏的存活时间明显延长，炎细胞浸润和心肌细胞变性坏死明显减轻。结论（１）急性排斥反应时，移植心脏内大量的炎细胞浸润和心肌细胞坏死。（２）大鼠心脏移植的急性排     

环孢菌素A抑制大鼠同种心脏移植急性排斥反应中趋化因子受体CCR5表达的研究

目的观察大鼠同种心脏移植急性排斥反应中趋化因子受体CCID的表达及环孢菌素A（CsA）的抑制作用。方法分两组建立同种大鼠颈部心脏移植模型：对照组（n=25）和新山地明组（CsA组，n=25），各5例观察移植心脏存活时间。于移植术后第1、5、7、14天分别取移植心组织各5例，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测移植心组织内趋化因子受体CCR5mRNA不同时间点的表达水平，免疫组织化学方法检测移植心组织内趋化因子受体CCR5分子的表达差异。结果对照组移植心存活时间为（11．6±1．5）d，CsA组移植心存活时间为（22．4±5．1）d，两组问移植心存活时间差异有统计学意义（P〈0．01）。急性排斥组和CsA处理组大鼠移植心脏在术后第5、7、14天都可检测到趋化因子受体CCR5mRNA阳性表达，但CsA处理组趋化因子受体CCRSmRNA的表达明显弱于急性排斥组。同样急性排斥组和CsA处理组大鼠移植心脏在术后第5、7、14天都可检测到趋化因子受体CCR5分子的表达，CsA处理组趋化因子受体CCR5分子的表达相对较弱。结论趋化因子受体CCR5在早期移植免疫事件中具有重要的作用，CsA能部分抑制趋化因子受体CCR5的表达，并与移植物存活时间延长有一定的关系。     

西罗莫司促进小鼠心脏移植模型中调节性T细胞的分化和增殖

目的  探讨西罗莫司(SRL)对小鼠异位心脏移植模型的移植物存活时间以及脾脏中调节性T细胞(Treg)分化和增殖的影响。方法  应用Cuff法建立雄性BALB/c→C57BL/6小鼠颈部异位心脏移植模型。术后随机分为3组各10只受体:对照组术后不予特殊药物治疗, SRL组术后1~14 d予SRL 10 mg/(kg·d)灌胃, 环孢素(CsA)组术后1~14 d予CsA 30 mg/(kg·d)灌胃。记录移植心脏存活时间, 于移植心停搏或术后14 d取脾, 分离单个核细胞, 上流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺Treg占CD4⁺T细胞比例(CD4⁺CD25⁺Treg%), 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法半定量检测Foxp3信使核糖核酸(mRNA)表达水平。结果  与对照组比较, CsA组和SRL组均明显延长小鼠移植心的生存时间(均为P < 0.01), 而两者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较, CsA组脾脏中CD4⁺CD25⁺Treg%明显降低, 而SRL组则明显升高(均为P < 0.01), 后两组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。SRL组脾脏T细胞的Foxp3 mRNA表达明显高于对照组和CsA组, 其中对照组亦明显高于CsA组(均为P < 0.01)。结论  在小鼠心脏移植模型中, SRL明显延长移植物的存活期, 促进CD4⁺CD25⁺Treg的增殖与生长, 有利于免疫耐受的形成。     

嵌合T细胞受体的构建及其在T淋巴细胞表面的表达和体外抗肿瘤功能的检测

目的利用基因工程技术构建表达嵌合T细胞受体(ch-TCR)分子的逆转录病毒载体(由抗 erbB2的单链抗体和信号传导链CD3ζ组成),感染预先刺激的小鼠T细胞,使得T细胞能以MHC非限制性的方式在体外识别并杀伤肿瘤细胞,为肿瘤的过继性免疫治疗提供新思路。方法将抗erbB2的单链抗体、CD8分子绞链区、CD3ζ链的跨膜区和胞内段依次克隆入逆转录病毒载体pCMMP中,与另外两个辅助载体pHDM．G和pMD．MLVgag．pol共同转染293T细胞,包装获得病毒颗粒,感染NIH3T3细胞检测病毒滴度。取适量病毒液感染预先刺激的小鼠CD3+T细胞,流式细胞仪检测嵌合受体在细胞表面的表达,非放射性的细胞杀伤试剂盒和ELISA检测试剂盒分别检测T细胞的抗原特异性杀伤和细胞因子分泌的功能。结果成功构建抗erbB2嵌合T细胞受体基因的逆转录病毒载体,检测病毒滴度为(2．1±1．1)×108IP／ml。体外感染T淋巴细胞的效率为(45±5)％。体外能杀伤erbB2+的肿瘤细胞SK-BR-3、D2F2／E2,而对erbB2-的肿瘤细胞 MCF-7、D2F2无杀伤功能,并能分泌Th1型细胞因子GM-CSF和IFN-γ。结论表达抗erbB2嵌合T细胞受体的T淋巴细胞体外具有MHC非限制性的、erbB2抗原特异性的杀伤肿瘤细胞和分泌 Th1型细胞因子的功能,为下一步的体内实验打下基础。     

落新妇甙诱导小鼠心脏移植体外排斥反应中活化T细胞凋亡

众多研究结果显示,T淋巴细胞在器官移植急性排斥反应中起核心作用。T淋巴细胞必须在其达到活化状态后才能发挥免疫效应,因此目前许多免疫抑制剂都是通过阻止T淋巴细胞活化而发挥抗急性排斥效应的。最近有文献报道,中药落新妇甙能使经植物血凝素激活的T淋巴细胞发生凋亡[1] ,并且能使肝炎动物肝脏周围浸润的活化T细胞发生凋亡,从而保护肝脏免受损害[2 ] 。落新妇甙是否对移植排斥反应中活化T淋巴细胞也有此作用?能否抑制移植排斥反应?本研究旨在通过小鼠心脏移植急性排斥反应体外模型[3 ] ,探讨落新妇甙对小鼠心脏移植体外排斥反应的影响…     

协同信号途径阻断和供体脾细胞输注诱导预存同种记忆性T淋巴细胞大鼠心脏移植物的耐受

目的 联合阻断OX40/OX40L和CD28/B7双协同信号途径和供体特异性脾细胞输注,诱导预存同种反应性记忆T淋巴细胞大鼠对同种心脏移植物的耐受.方法 建立大鼠预存同种反应性记忆T淋巴细胞的移植模型,采用免疫磁珠法分选CD8+CD44-记忆性T细胞;对过继转移供体特异性CD8+记忆性T细胞3 d的Lewis大鼠分别/合并输注AdCTLA4Ig、AdOX40Ig、供体脾细胞(DST),同时移植来至DA大鼠的心脏;48 h后取出心脏进行组织学分析、细胞因子表达分析,同时观察不同处理移植心脏存活时间.结果 AdCTLA4Ig+AdOX40Ig+DST组分别与AdCT-LA4Ig,AdOX40Ig和DST比较,心脏组织病理级别较低,白细胞介素(IL)-2及干扰素(IFN)-γ的表达水平也明显比其他组低很多,而心脏存活时间显著延长.结论 联合阻断OX40/OX40L和CD28/B7和供体特异性脾细胞输注能较好地诱导大鼠心脏移植物耐受.     

T细胞疫苗诱导免疫耐受与外周血T细胞凋亡的关系探讨

目的　探讨T细胞疫苗诱导特异性免疫耐受与外周血T细胞凋亡的关系。方法　制备针对Wistar大鼠的SD大鼠T细胞疫苗 ,然后用该疫苗免疫健康SD大鼠 ,每周 1次 ,连续 3周 ,作为实验组 (n =6)。对照组 (n =6)用RPMI 164 0培养液替代T细胞疫苗。以被免疫的SD大鼠的脾细胞作为反应细胞 ,以Wistar大鼠的脾细胞作为刺激细胞 (经丝裂霉素处理 ) ,于接种前和每次接种后第 5天进行单向混合淋巴细胞反应 (3 H TDR掺入法 ) ,测定其cpm值 ;用流式细胞仪对外周血T细胞凋亡情况进行检测。结果　混合淋巴细胞反应结果显示 ,实验组SD大鼠脾细胞免疫应答能力于接种后受到显著抑制 ,其cpm值较接种前显著降低 (P<0 .0 1) ;对照组接种前后各时点比较 ,其差异无显著性(P>0 .0 5 ) ;接种后相同时点的cpm值组间比较 ,实验组显著低于对照组 (P <0 .0 1) ;与接种前比较 ,接种后实验组外周血T细胞凋亡率显著增高 (P<0 .0 1) ,且随着疫苗接种次数的增加而升高 ,而对照组接种后各时点T细胞凋亡率与接种前比较差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论　T细胞疫苗可以诱导同种特异性免疫耐受 ,其机理可能是通过诱导外周血T细胞凋亡 ,清除抗原特异性反应性T细胞克隆来实现的。     

细胞凋亡与心脏移植

本文概述了细胞凋亡与心脏移植的关系。从抗凋亡途径保护供心，将为心脏移植提供新的研究方向。     

协同信号途径阻断和供体脾细胞输注诱导预存同种记忆性T淋巴细胞大鼠心脏移植物的耐受

Objective To induce the tolerance to cardiac allograft by combined blockade of OX40/OX40L and CD28/B7 co-stimulatory signaling and donor specific spleen cell transfusion in rat mod-els of pre-existent allogenic reactive memory T lymphocytes. Methods Lewis rats that underwent 3 days of adoptive transfer of donor specific CD8+ memory T cells, separated by immunomagnetic bead separation kit, received either separate or combined transfusion of AdCTLA4Ig, AdOX40Ig, donor spleen cells (DST) and transplantations of hearts of DA rats at the same time. Cardiac allografts were taken out 48 h after transplantation for histological analysis and cytokines expression ,and survival time of cardiac allografts with different treatments was observed. Results Compared with AdCTLA4Ig, AdOX40Ig and DST groups, AdCTLA4Ig + AdOX4OIg + DST group showed lower cardiac pathological grade with much lower expression level of IL-2 and IFN-γ,and much longer heart survival time. Conclusion Combined blockade of OX40/ OX40L and CD28/B7 and donor specific spleen cell transfusion could induce rat cardiac graft tolerance.     

协同信号途径阻断和供体脾细胞输注诱导预存同种记忆性T淋巴细胞大鼠心脏移植物的耐受

Objective To induce the tolerance to cardiac allograft by combined blockade of OX40/OX40L and CD28/B7 co-stimulatory signaling and donor specific spleen cell transfusion in rat mod-els of pre-existent allogenic reactive memory T lymphocytes. Methods Lewis rats that underwent 3 days of adoptive transfer of donor specific CD8+ memory T cells, separated by immunomagnetic bead separation kit, received either separate or combined transfusion of AdCTLA4Ig, AdOX40Ig, donor spleen cells (DST) and transplantations of hearts of DA rats at the same time. Cardiac allografts were taken out 48 h after transplantation for histological analysis and cytokines expression ,and survival time of cardiac allografts with different treatments was observed. Results Compared with AdCTLA4Ig, AdOX40Ig and DST groups, AdCTLA4Ig + AdOX4OIg + DST group showed lower cardiac pathological grade with much lower expression level of IL-2 and IFN-γ,and much longer heart survival time. Conclusion Combined blockade of OX40/ OX40L and CD28/B7 and donor specific spleen cell transfusion could induce rat cardiac graft tolerance.