红花ERF1转录因子的克隆及植物表达载体的构建

目的克隆1条红花AP2/ERF家族转录因子编码区序列,并构建植物表达载体。方法在红花转录组测序基础上,利用RT-PCR方法克隆1条红花AP2/ERF家族转录因子编码区序列(Ct ERF1)并进行生物信息学分析,利用ClustalW 1.83软件构建系统进化树,在Ct ERF1基因序列两端引入SpeI和XbaI酶切位点,构建含有35S启动子的植物超表达载体p BASTA-Ct ERF1。结果 CtERF1基因编码297个氨基酸,且具有典型的AP2/ERF基因的功能结构域,含有1个AP2区域,为ERF亚族蛋白,亚细胞定位分析推测其定位在细胞质和细胞核上。系统进化分析表明,Ct ERF1基因编码氨基酸与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与杨树和人参的亲缘关系最近。通过分子生物学方法,成功构建p BASTA-CtERF1植物表达载体。结论成功克隆了1条红花AP2/ERF家族转录因子编码区基因Ct ERF1,并构建了植物表达载体p BASTA-Ct ERF1。     

红花单功能反馈抑制敏感型CtAK1基因克隆、序列分析及表达载体构建

目的分离红花天冬氨酸代谢途径关键酶天冬氨酸激酶(AK)基因的全长cDNA序列,进行植物超表达载体构建。方法根据红花种了转录组文库注释和qRT-PCR鉴定的AK基因核心片段及表达分析数据,采用RACE技术获得红花AK(CtAK)基因的全长cDNA,利用DNA重组技术构建植物超表达载体。结果生物信息学分析表明,CtAK基因全长1 703bp,ORF区为1 626 bp,编码541个氨基酸残基,功能结构域分析推测,该基因可能为单功能反馈抑制敏感植物AK1。通过DNA重组技术成功构建以35 S为启动子和Bar抗性基因并含有叶绿体转运肽的pCAMBIA3301-CTP-AK1植物超表达载体。结论获得CtAK1基因的编码序列并构建植物超表达载体,为进一步研究其生物学功能及其在红花氨基酸代谢调控中的作用机制奠定基础。     

白及苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、序列特征及激素响应表达分析

目的苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物次生代谢与抗逆反应的关键酶类之一,研究PAL基因的序列信息与逆境胁迫响应模式,揭示其蛋白结构与功能及抗逆信号网络。方法采用RT-PCR、RACE技术获得白及PAL基因c DNA全长;Protparam、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析其编码蛋白的理化特性、结构域等特征;DNAMAN、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对与系统进化分析;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术进行PAL基因时空表达特异性与外源激素胁迫下响应检测。结果克隆得到的Bs PAL基因c DNA全长为2 708 bp,编码1条797个氨基酸组成的多肽,预测蛋白质相对分子质量为86 216.94,等电点6.24,具有植物PAL酶的典型结构域和活性中心,不具有跨膜结构域,与铁皮石斛、蝴蝶兰的PAL基因亲缘关系最近。q RT-PCR结果表明白及根中PAL表达量显著高于叶与茎。在Me JA处理下,PAL表达量呈逐渐上升再下降的趋势;SA处理下,则是先下降再上升的趋势。结论白及PAL基因的克隆与序列特征分析、表达检测及响应Me JA和SA胁迫后的表达变化为阐明白及苯丙烷代谢途径与激素信号通路研究提供实验基础。     

金荞麦苯丙氨酸解氨酶基因FdPAL 的克隆及原核表达

目的:克隆金荞麦苯丙氨酸解氨酶(FdPAL)基因DNA和全长cDNA序列,对该基因进行序列分析,原核表达及其活性相关研究.方法:采用同源克隆和RT-PCR技术扩增苯丙氨酸解氨酶基因的DNA序列和全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析;构建PAL原核表达载体pET30b(+)-FdPAL,在大肠杆菌Escherich coli BL21( DE3)中进行诱导表达,使用分光光度计法定量测定其酶活,使用薄层色谱法鉴定其催化活性.结果:金养麦PAL基因DNA序列全长2 583 bp,由2个外显子,1个内含子构成(命名为FdPAL,GenBank登录号为HM628904);cDNA序列包含1个2 169 bp的开放阅读框(ORF),编码722个氨基酸,理论相对标准分子质量78.31 kDa,等电点5.94.SDS-PAGE分析表明,诱导后的新生蛋白质相对标准分子质量为75.37 kDa;诱导4h后,表达产物的苯丙氨酸解氨酶比活力最高,达到4 386 nmol·g-1·min-;薄层色谱结果表明,诱导表达产物具有催化苯丙氨酸转化为肉桂酸的活性.结论:首次从金荞麦中克隆到PAL基因,该基因具有植物PAL同源基因的典型特征;重组的金荞麦PAL基因表达载体[pET30b(+)-FdPAL]能有效地在大肠杆菌Ecoli BL21 (DE3)中表达,并形成具有一定催化功能的酶.     

灰毡毛忍冬LmPAL1基因的克隆及表达分析

目的克隆灰毡毛忍冬苯丙氨酸解氨酶(LmPAL1)基因全长序列,并进行生物信息学和表达模式分析。方法提取灰毡毛忍冬花总RNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和RACE技术克隆LmPAL1基因的全长cDNA序列;运用相关软件对该基因序列进行生物信息学分析;利用qRT-PCR测定灰毡毛忍冬茎、叶和不同花期花中该基因的相对表达量。结果克隆的LmPAL1基因开放阅读框(ORF)长度为2 145 bp,编码714个氨基酸,生物信息学分析预测为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,包含PAL shielding结构域(527～641 aa),并且含有PAL/HAL活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG(196～212aa),与其他LmPAL1具有较高的相似度;LmPAL1基因q RT-PCR结果显示,7个花期材料以金黄色开花期相对表达量较高;与茎、叶比,白色花蕾期花的相对表达量最高,叶的最低。结论成功克隆了LmPAL1基因,为进一步研究该基因的功能以及遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定基础,同时为探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据。     

红花2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶基因的克隆及表达分析

目的克隆红花维生素E合成相关关键酶2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)基因,并进行生物信息学及表达分析,为红花维生素E生物合成及调控机制研究奠定基础。方法根据红花种子转录组数据库中得到的中间序列,采用RT-PCR和RACE方法从红花种子中克隆MPBQ MT基因序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建MPBQ MT与相关物种MPBQ MT的系统进化树,利用RT-PCR方法分析在红花种子不同发育时期MPBQ MT基因的表达量。结果MPBQ MT基因全长1 392 bp,命名为Ct MPBQ MT,具有完整的开放阅读框(ORF),共1 038 bp,编码345个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白理论相对分子质量约为38 900。保守结构域预测表明,该基因编码的蛋白具有典型的SAM蛋白功能结构域。结合其他物种的MPBQ MT基因构建系统树表明,红花MPBQ MT基因与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与向日葵和生菜同源性高达89%和86%。实时荧光定量PCR分析表明,MPBQ MT基因在红花开花后50 d的种子中表达量最高。结论成功地对MPBQ MT基因进行克隆及表达分析,为红花维生素E合成及调控机制研究奠定基础。     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的对膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因进行克隆及序列分析。方法应用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法,以膜荚黄芪根总RNA为模板克隆PAL基因。结果所克隆的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因命名为AmPAL,Genbank登录号为EF567076。序列分析表明,AmPAL全长为2650bp,含有一个完整的2154bp开放读码框。AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,相对分子质量为7.805×104,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且相似性都大于80%。结论首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,为有效利用该基因调控药用植物苯丙烷代谢途径奠定了基础。     

大花红景天尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因组DNA的克隆及分析

目的 克隆大花红景天Rhodiola crenulata尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因组DNA,并利用生物信息学对其编码区与启动子进行分析.方法 以大花红景天为样品,采用优化的CTAB法提取大花红景天基因组DNA,并利用hiTAIR-PCR 技术经过3次步移获得大花红景天UDPGT (RcUDPGT)基因DNA序列,并利用生物信息学对其进行分析.结果 克隆得到RcUDPGT基因的DNA序列2 977 bp,其中包含1 499 bp的编码区域(包括82 bp的内含子序列)和1500 bp的编码区5,上游侧翼域序列(包括启动子区域).生物信息学分析证明该序列为UDPGT基因且与其他植物UDPGT同源,具有亲水性且定位于细胞质中,三级结构预测表明该基因编码的蛋白具有UDPGT功能结合位点.启动子分析表明其存在光响应、厌氧响应、热响应、低温响应、压力与防御响应和花色素苷合成响应元件等.结论 克隆的RcUDPGT基因结构完整,具有典型的功能结合位点,为红景天分子生物学与代谢工程研究提供参考.     

管花肉苁蓉花中查耳酮合酶的基因克隆、功能鉴定与表达分析

目的 研究管花肉苁蓉Cistanche tubulosa花中查耳酮合酶（chalcone synthase）Ct CHS蛋白的功能和Ct CHS基因在白、红、紫3种颜色花中的表达模式。方法 利用RT-PCR克隆Ct CHS基因并进行生物信息学分析。将p ET-28a-CtCHS质粒转入大肠杆菌通过IPTG诱导蛋白表达。将Ct CHS重组蛋白与底物4-香豆酰辅酶A、丙二酰辅酶A孵育并利用HPLC和MS检测产物。将p CAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS质粒转入拟南芥原生质体观察CtCHS蛋白亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Ct CHS基因在3种颜色管花肉苁蓉花中的表达模式。结果 克隆出1条Ct CHS基因，开放阅读框（open reading frame,ORF）长度为1173 bp，编码390个氨基酸，蛋白相对分子质量为42 800，具有查耳酮合酶保守的催化残基Cys164、His303、Asn336。利用大肠杆菌外源表达Ct CHS蛋白并纯化获得重组蛋白。Ct CHS蛋白能够催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A生成柚皮素查耳酮。Ct CHS蛋白主要定位于细胞质。Ct C...     

参环毛蚓MT-2基因及启动子的克隆研究

目的揭示参环毛蚓MT-2基因的转录调控机制,为今后采用基因工程技术改良参环毛蚓重金属富集性状奠定基础。方法根据已知的MT-2c DNA序列,设计特异引物,通过PCR扩增参环毛蚓MT-2基因的编码区基因组序列,扩增产物经测序后自行比对分析。基于该序列设计3条特异引物,采用基因步移技术克隆其上游的启动子序列,同时运用Promoter Prediction在线软件分析预测其顺式元件。结果经PCR扩增、测序后获得2 826 bp MT-2基因编码区序列,将该序列与已知MT-2 c DNA序列(登录号为KC787373.1)进行比对,发现MT-2编码区由4个外显子和4个内含子组成。基因步移技术克隆得到1 534 bp的启动子序列,经Promoter Prediction在线软件分析,结果显示该序列不仅含有TATA-box、CAAT-box等核心启动子软件,还具有3个特异响应重金属参与调控MT-2表达的MRE元件。结论参环毛蚓的MT-2基因能被重金属诱导表达,MT-2基因转录水平的金属调控是通过MT-2基因启动子区的金属调控元件MRE来实现的。     

华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析

目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析。方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的c DNA全长,并通过DNAMAN软件和Ex PASy在线分析等对其进行了生物信息学分析。结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的c DNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80%以上。结论:获得了AsPAL c DNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础。     

黑三棱苯丙氨酸解氨酶基因克隆与序列分析

目的 对连接黑三棱初生代谢及次生代谢途径的关键酶苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase,PAL）进行基因全长的克隆和生物学信息分析。方法 以黑三棱总RNA为模板,采用同源克隆法和RACE技术克隆黑三棱PAL基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件和ExPASy在线分析等方法对其生物信息学进行分析。结果 获得黑三棱PAL基因全长cDNA,GenBank注册号为KF633470,序列分析表明,所克隆的cDNA全长为2 413 bp,包含一个2 151 bp的开放阅读框架,编码716个氨基酸的蛋白。预测该蛋白的相对分子质量为1.98×10⁵,等电点为4.84,无信号肽,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG。结论 首次克隆并获得黑三棱PAL基因全长cDNA,为黑三棱药效成分生源合成途径的阐明和改善中药材品质提供科学依据。     

当归-红花药对活血功效相互作用研究

目的应用响应曲面分析法阐明当归-红花药对活血效应相互作用的范围、性质与程度。方法采用冰水浴与注射盐酸肾上腺素复制大鼠急性血瘀模型,给予不同配比(1∶0、4∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶4、0∶1)不同剂量当归-红花药对后,观察其对血液流变学各指标的影响,采用多指标综合指数法对各指标进行整合,然后运用响应曲面分析法对整合效应结果进行分析,应用非线性回归的方法确定量效曲线的各个参数,建立三维响应曲面模型,应用Matlab软件构建响应曲面的三维图形。结果发现当归-红花药对配比在0.8∶1～1.1∶1以及在当归剂量为0～5 g,红花8～11 g这个区域之间表现为协同作用(相互作用值:-0.2～-0.8);在当归剂量为0～0.2 g,红花为0.2～1 g表现为拮抗作用,但拮抗作用不明显,相互作用值为0.2左右,而其他比例并未表现出明显的协同或拮抗作用。结论采用响应曲面分析法可定量研究中药配伍药物相互作用,为药对相关研究提供了思路与方法的参考。     

基于生物信息学的乳腺癌细胞焦亡相关基因多组学分析及相关中药筛选预测

目的 基于生物信息学探究细胞焦亡相关基因在乳腺癌中的作用及临床意义，并筛选可对细胞焦亡起调控作用的中药。方法 从TCGA、GEO数据库中获取乳腺癌相关数据集；使用R、Perl语言对细胞焦亡相关基因在乳腺癌细胞中的表达、变异进行评估；对数据集分别进行细胞焦亡基因分型及预后差异基因分型，并对各分型进行多组学分析；构建预后模型、进行风险评分，按照风险评分分组进行亚组多组学分析并检验对生存的预测能力；以细胞焦亡基因为靶点，利用TCMSP数据库及Cytoscape软件构建“细胞焦亡靶点-成分-中药”网络并进行拓扑学分析，进而得出核心中药及其相关属性。结果 大多数细胞焦亡基因在乳腺癌中表达异常并具有拷贝数变异，细胞肿瘤抗原（cellular tumor antigen p53，TP53）等11个基因发生了体细胞突变；细胞焦亡分型中A亚型预后好、细胞焦亡基因及免疫相关通路高表达、免疫细胞含量高；B型与之相反，且A、B两亚型差异明显，其分型差异基因有1223个。将不同的焦亡基因重新聚类，得到3个基因型，乳腺癌细胞焦亡预后差异基因分型中I组预后最好，II组最差，I组主要为基因及细胞焦亡基因高表达，II组主要呈现低表达。预后模型风险评分将患者分为高、低风险组，低风险组细胞焦亡基因高表达、预后好，高风险组相反，通过列线图可对患者不同临床特征进行预后评估；免疫细胞与风险评分相关性大多呈负相关；肿瘤微环境中基质细胞、免疫细胞及总评分均为高风险组更低，肿瘤突变负荷则高风险组更高；干细胞与风险得分呈正相关。“细胞焦亡靶点-成分-中药”网络得出木蝴蝶、红花等17味中药为核心药物，其性味主要为苦寒，次以辛温，辅以甘平之品，主要调节肝、肺、脾、胃等脏腑。结论 细胞焦亡基因在乳腺癌的免疫中发挥重要作用，与乳腺癌患者预后具有明显相关性，调控细胞焦亡基因的中药主要有木蝴蝶、红花等17味药物，可为乳腺癌的诊疗及中药干预研究提供思路与参考。     

细辛甲基丁香酚合成相关酶基因的克隆与序列分析

目的基于细辛转录组测序结果,克隆甲基丁香酚合成相关酶基因,了解相应的序列信息。方法以细辛叶片为材料,通过RT-PCR扩增得到苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-羟基肉桂酰辅酶A连接酶(4CL)、肉桂醇脱氢酶(CAD)等基因的c DNA全长,并进行生物信息学分析。结果 AhPAL、AhC4H、Ah4CL和AhCAD基因的ORF长度分别为2 157、1 278、1 623、1 071 bp,编码718、425、540、356个氨基酸。4种蛋白均具有各自的保守结构域。除Ah C4H外,AhPAL、Ah4CL和AhCAD与已报道的其它物种相应酶的氨基酸序列相似性都较高。结论对细辛甲基丁香酚合成相关酶基因进行克隆和生物信息学分析,为后续基因功能分析及甲基丁香酚生物合成调控机制的解析奠定基础。     

荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆及生物信息学分析

目的克隆荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,StDXS)基因,并进行生物信息学分析。方法根据荆芥转录组数据获得的StDXS基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得StDXS基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析。结果荆芥StDXS基因全长2177 bp,包含一个长度为2157 bp的开放阅读框,编码718个氨基酸,其理论相对分子质量为77240,等电点为6.32,定位于叶绿体,不存在跨膜区及信号肽,为非分泌蛋白。同源系统进化树分析表明,该序列与同科植物鼠尾草的DXS基因进化关系较近,均属于DXS1亚家族。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有28个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论成功克隆荆芥StDXS基因并进行生物信息学分析,为从分子水平调控荆芥的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础。     

当归MADS-box生物信息学及SOC1克隆与表达分析

目的 对当归Angelica sinensis MADS-box基因家族进行筛选与生物信息学分析,并对SOC1-4基因进行克隆与表达验证。方法 基于当归全长转录组筛选MADS-box基因家族,利用在线工具进行生物信息学分析,并利用q RT-PCR检测SOC1-4基因在不同材料中的表达水平。结果 当归全长转录组中含有29个MADS-box基因家族成员,可分为10个亚家族,共含有6个保守基序,蛋白质序列长度为49～422 aa,相对分子质量为5 697.56～49 624.90,等电点为5.06～11.00,亚细胞结果显示当归MADS-box基因家族成员分别定位于叶绿体、细胞核、细胞质和线粒体,二级结构预测及3D建模显示同一亚家族结构相似;SOC1-4基因克隆片段与全长转录组测序结果一致;SOC1-4基因随种苗春化作用和植株发育时期延长呈现高表达,在抽薹植株、茎和叶中高表达,而在冷冻规避春化作用种苗中呈现低表达。结论 当归含有29个MADS-box成员,各成员理化性质和结构存在一定的差异,SOC1-4基因表达水平与当归抽薹开花生理调控一致,为当归MADS-box基因家族调控抽薹开花相关研究...     

马蓝色氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

目的 克隆马蓝Baphicacanthus cusia吲哚类生物碱合成途径的色氨酸合成酶（tryptophan synthase,TSB）基因,命名为BcTSB（GenBank登录号AYM45644.1）,对其生物信息学和表达进行分析。方法 基于前期马蓝转录组数据库,获得BcTSB基因开放阅读框（ORF）,运用生物信息学手段对基因功能做出初步预测,构建pET32a-BcTSB原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测马蓝不同组织（根、茎、叶）中TSB表达水平。结果 克隆的BcTSB基因ORF长度为1 452 bp,编码483个氨基酸,生物信息学预测为亲水性蛋白,定位于叶绿体,该蛋白相对分子质量为51 665.89,pET-32a载体包含18 000的标签。SDS-PAGE分析在70 000处出现目的蛋白条带,与理论预期值大小一致。qRT-PCR分析显示BcTSB基因在马蓝不同组织中均有表达,且在茎中的表达量最高。结论 通过对BcTSB基因的克隆及表达分析,为进一步研究该基因功能及调控奠定了实验基础。     

基于指纹图谱对金银花与山银花的区分及各品种金银花质量评价

目的 建立金银花和山银花指纹图谱,对河南封丘金银花与湖南不同基原山银花进行区别比较,并对封丘不同品种金银花进行质量评价。方法 利用HPLC法构建金银花和山银花药材的指纹图谱;利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行相似度评价、以“SIMCA13.0”软件进行主成分分析（principal component analysis,PCA）分析;通过HPLC法测定河南封丘不同品种金银花成分含量。结果 河南封丘产金银花相似度均在0.95以上,湖南各基原山银花相似度在0.97以上,金银花和山银花相似度在0.57～0.79,豫金二号与金银花及山银花药材相似度均在0.6以下,共有多成分PCA分析也能显著区分金银花和山银花。金银花各品种中北花1号酚酸类以绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C之和为5.1%,比其他品种高约15%;木犀草苷豫金1号含0.062%、北花1号0.064%,比四季花高约25%、比羊角花高约50%。结论 该化学指纹图谱方法能显著区分金银花和山银花,二者间的化学成分差异亦能为金银花指标性成分的选择提供参考。金银花不同栽培品种成分含量差异明显,豫金1号和北花1号药材质量较优,是具有进一步开发利用的潜在优质种质资源。