内皮细胞生长因子的分离和纯化

参照 Lobb 和 Fett 方法,用肝素亲和层析法从牛脑组织中提取出纯度较高的内皮细胞生长因子,后者能明显促进体外人脐静脉内皮细胞增殖。     

重组人酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化

采用肝素-sepharose亲和层析和SephadexG-100凝胶过滤层析法,从含haFGF基因重组体的大肠杆菌菌体中分离纯化得到人酸性成纤维细胞生长因子（rhaFGF)。SDS-PAGE,IEF电泳检测均为单一谱带。HPLC层析显示单一蛋白峰,SDS-PAGE测定rhaFGF分子质量为16.67ku,IEF测定等电点pI为4.8,并用Edman降解法测定了N-末端氨基酸序列,Balb/c3T3细胞培养法测定纯化的rhaFGF生物活性ED50为6μg/L,表明其对细胞分裂有明显促进作用。     

人脐带静脉内皮细胞的分离及长期培养

人脐带静脉内皮细胞的分离及长期培养中山医科大学微生物学教研室（５１００８９）周少元，郭辉至血管ＥＣ作为血管内膜的主要结构，直接接触血液系统，在组织和血液系统之间筑起一道屏障，这一独特的解剖学结构，无疑赋予血管ＥＣ广泛和独特的生物学功能。为了研究ＥＣ在...     

酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化及活性鉴定

目的：从牛脑中分离纯化酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)并鉴定生物活性，方法：根据DenisGOSPODAROW-ICZ的方法，新鲜牛脑匀浆，三步硫酸铵盐析。最后沉淀物溶解透析后予离子交换层析及琼脂糖胶亲和层析，促3T3细胞DNA合成率鉴定生物活性。结果：用1.0mol/LNaCl的缓冲液洗脱得到分子量为13600的多肽，得率为610μg/kg牛脑，氨基酸组成分析与已知的aFGF相同，促3T3细胞DNA合成的最低浓度为0.5ng/ml，最大效应浓度50ng/ml，ED50值为8ng/ml。结论：aFGF具有强烈的促细胞增殖作用。     

ECGF生物活性与肝素的相关性研究

观察肝素与内皮细胞生长因子（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ。ＥＣＧＦ）的分离、生物活性及促创伤愈合作用的相关性。结果表明：用肝素亲和层析分离ＥＣＧＦ纯度高、产量多；肝素可使ＥＣＧＦ生物活性增加；另外，在动物实验中，肝素与ＥＣＧＦ合用可使创伤提前愈合。     

血管内皮细胞生长因子的制备和生物活性测定

报道从牛脑制血内皮细胞生工因子的方法，鲜牛脑经匀浆，硫酸铵盐析，透析后，上Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＣ－５０离子交换柱，并用氯化钠梯度洗脱。利用ＥＣＧＦ对人脐静脉内细胞地增殖刺激效应测定其活性。当所得ＥＣＧＦ制品在含１０％新生牛血清或胎牛血清的培养液中含量为２５ｍｌ／Ｌ时，其最大刺激活性比对照组增加５５０％。     

内皮细胞表达血管内皮细胞生长因子的研究

目的 观察体外培养的内皮细胞表达和分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)的情况。方法 以脐静脉内皮细胞系ECV-304为研究对象，采用RT-PCR、流式细胞仪、ELISA法分别观察佛波脂(PMA)对ECV-304合成与分泌VEGF的作用。结果 100ng／ml PMA能明显上调VEGF mRNA的表达、VEGF蛋白的合成及分泌。其对VEGF mRNA表达及细胞内VEGF合成的作用在12h最为明显；而分泌至上清液中的VEGF量则在18h达到高峰。PMA的上述作用能够被放线菌素D所抑制。结论 PMA能够诱导内皮细胞ECV-304表达、合成及分泌VEGF，该作用呈剂量和时间依赖性。其对VEGF mRNA的作用涉及核苷酸的从头合成途径。     

重组人胰岛素样生长因子-1纯化及其鉴定的研究

目的：利川亲和层析法将家蚕幼虫中高效表达的重组人胰岛素样生长因子(recombinant human insulin—like growth factor-1．rhIGF-1)纯化并鉴定，以得到具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF-1生物制品。方法：蚕血淋巴中rhIGF—1初步提纯去除杂质。采用亲和层析法纯化rhIGF-1。以EUSA法测定纯化产物中rhIGF-1含量。用SDS-PAGE和Western—blot分析鉴定rhIGF-1纯度及免疫学活性．4-甲基偶氮唑蓝(tetrazolium salt，MTT)法观察其对MCF-7细胞增殖的影响。结果：纯化后rhIGF-1纯度约为40％，Western blot分析发现，主要纯化产物相对分子质量为7．5ku的成熟hIGF-1．所含非目的产物与hIGF-1无免疫交叉反应。细胞活性刺激实验显示，rhIGF-1纯品对MCF-7细胞有较好的刺激活性．促增殖能力优于来源于大肠杆菌的rhIGF-1产品。结论：蚕血淋巴中的rhIGF-1经亲和层析后初步得到纯化，并显示良好的免疫学活性和生物学活性。     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF121)工程菌的高密度发酵工艺.方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化.结果采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF121的表达量达菌体蛋白总量的23%.结论该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF121的表达水平.     

胃癌细胞产生的一种新型内皮细胞生长因子的分离

人胃癌细胞株 NUGC 2的培养上清液对内皮细胞及纤维细胞有生长刺激作用.收集 NUGC 2的培养上清液,然后经硫酸铵盐析。等电聚焦(IEF)、Mono Q 阴离子交换层析柱、凝胶过滤层析柱(TSK Gel G3000 SW)等方法分离蛋白,得到一种只对内皮细胞有生长刺激作用,对纤维细胞没有生长刺激作用化学不均一的内皮细胞生长因子,其等电点(PI)为2.07～2.90,分子量在45 000～66 000范围,盐洗脱浓度为0.1～0.25M NaCl.它不同于酸性纤维细胞生长因子,也不同于碱性纤维细胞生长因子.     

人表皮生长因子对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察表皮生长因子(EGF)对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用体外培养的牛角膜内皮细胞,在培养液中分别添加不同浓度的人表皮生长因子(hEGF),加药后第3、7天采用MTT法,在酶标仪492nm波长处测定吸光度值观测细胞增殖,并记录细胞形态变化。将体外培养的牛角膜内皮细胞分为二组,常规DMEM培养液组和含50ng/mLEGF的DMEM培养液组,培养3、7天后,应用流式细胞仪检测细胞周期各阶段G1、S、G2期分布。结果与对照组相比,不同浓度EGF组对牛角膜内皮细胞增殖有促进作用且与浓度相关,其中10ng/mL和100ng/mL组作用强于1ng/mL组。EGF加入后3d,对照组S期细胞24.5%,G2-M期细胞0.08%,加药组S期细胞24.6%,G2-M期细胞0.06%。与对照组相比较,各期细胞分布大致相等,无显著差异。加入7d后对照组S期细胞20.8%,G2-M期细胞0.41%,加药组S期细胞18.2%,G2-M期细胞1.55%,细胞分布发生明显变化。结论EGF促进体外培养的牛角膜内皮细胞增殖,并使体外培养的牛角膜内皮细胞的细胞周期发生变化,S期细胞比例下降。     

前列腺癌中PD-ECGF的表达与血管生成间的相关性研究

目的探讨前列腺癌中血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF)的表达与新生血管形成的关系。方法用免疫组化技术和Western blot方法检测22例前列腺癌组织中PD-ECGF蛋白的表达和微血管计数(MVD)。结果前列腺癌中PD-ECGF阳性表达率为54.5%(12/22),表达位于肿瘤组织的基质细胞中,肿瘤细胞中均未见表达。在22例前列腺癌组织中平均MVD为71.21±31.14/100倍视野,PD-ECGF的表达与MVD间存在显著地相关性(r=0.50,P=0.005)。结论PD-ECGF在前列腺癌组织中呈高表达与前列腺癌的血管生成显著相关,可促进前列腺癌组织中新生血管的形成。     

β-氨基丙腈对VEGF诱导的体外培养HUVEC血管生成的影响

目的通过β-氨基丙腈（beta—aminopropionitrile,BAPN）来研究赖氨酰氧化酶（Lysyl Oxidase,LOX）对体外培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）血管生成的影响,并对其机制进行初步探讨。方法Northern Blot分析人脐静脉内皮细胞中LOX表达,纤维蛋白凝胶体外血管生成检测试剂盒检测血管内皮细胞生长因子和LOX抑制剂BAPN对人脐静脉内皮细胞血管生成的作用,Western Blot检测BAPN处理对MAPK、Akt和PLCγ1的影响。结果人脐静脉内皮细胞中有LOX表达;血管内皮细胞生长因子可促进血管生成,而BAPN可拮抗这种促进作用;BAPN处理后的人脐静脉内皮细胞磷酸化的MAKP表达减少。结论β-氨基丙腈可抑制由血管内皮细胞生长因子诱导的血管生成,提示LOX可能对血管生成有促进作用,其机制是影响信号传导通路中磷酸化的MAKP表达。     

VEGF及PD-ECGF在膀胱癌的表达及与肿瘤血管生成的关系

目的：研究膀胱移行细胞癌中血管内皮生长因子（VEGF），血小板源性内皮细胞生长因子（PD－ECGF）的表达及肿瘤血管形成的情况及意义。方法：采用免疫组化SP法分析68例原发性膀胱移行细胞部的VEGF，PDECGF的表达情况，检测CD34以计算微血管密度（MVD）。结果：膀胱癌中VEGF表达率为61．76％（42／68）；PDECGF表达率为54．41％（37／68）；二者共同阳性表达率为38．24％（26／68）。VEGF，PD－ECGF与膀胱癌的分级，分期和预后相关，并与MVD呈正相关（P＜0．05）。此外二者之间也有相关性（P＜0．05）。结论：VEGF，PD－ECGF能共同调节膀胱癌的血管形成，可用于判断膀胱癌的生物学行为。     

威麦宁对PG细胞与HUVEC黏附作用的影响

目的研究威麦宁体外对人高转移肺癌细胞(PG)与血管内皮细胞(HUVEC)黏附作用的影响,探讨其抗肿瘤转移作用机制。方法MTT法检测威麦宁对PG、HUVEC活力的影响;虎红染色法检测威麦宁对PG细胞与HUVEC黏附作用的影响,检测对肿瘤坏死因子(TNF-α)活化的HU-VEC与PG细胞黏附作用的影响。结果威麦宁(31.25、62.5 mg/L)作用PG、HUVEC 24 h后,对两种细胞的存活率即活力皆没有影响(P>0.05)。威麦宁(31.25、62.5mg/L)作用PG细胞24 h后,对HUVEC的黏附有明显抑制作用(P<0.05,P<0.01);作用HUVEC 6、12 h后,能明显降低TNF-α诱导的HUVEC对PG细胞的黏附作用(P<0.01)。结论威麦宁可能通过对PG细胞和HUVEC双重作用,抑制PG-HUVEC间的黏附,从而抑制肿瘤细胞的血道转移。     

牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞增殖的影响

目的：观察牙龈卟啉单胞菌（Pg)对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）增殖的影响，探讨Pg对牙龈血管内皮细胞的毒性作用。方法：以厌氧袋法培养Pg，原代培养HUVEC，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）观察HUVEC的增殖状态。结果：活的和灭活的Pg都剂量依赖性地抑制HUVEC的增殖，活的Pg作用比灭活的Pg更为强烈，而Pg毒力株W83和非毒力株ATCC33277对HUVEC增殖的影响无显著差异。结论：Pg可能通过损伤牙龈组织的血管内皮细胞加重局部的炎性反应，可能是Pg诱导牙周组织破坏的病理机制之一。     

非小细胞肺癌中血管内皮生长因子的检测及意义

目的:检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血管内皮生长因子(VEGF)水平,以探讨二者之间的关系。方法:酶联免疫吸附法(ELISA)检测80例NSCLC患者和30例健康献血者VEGF含量。结果:NSCLC患者VEGF平均含量为(887.3±130.7)pg/mL,明显高于对照组(250.2±47.5)pg/mL(P<0.01),其水平与性别、年龄、组织学类型、分化程度、原发肿瘤大小无关,而与临床分期、淋巴结转移有关(P<0.01)。结论:VEGF可作为NSCLC早期诊断和预后评价的一个可靠参考指标。