巢蛋白及其功能

巢蛋白 (nestin)是新发现的第Ⅵ类中间丝蛋白 ,其在胚胎前体细胞中成为最先表达的中间丝蛋白先驱。巢蛋白及其它中间丝成员相继表达的时空顺序与前体细胞朝终末分化方向发育为成熟细胞的过程相匹配 ;在正常细胞演变成肿瘤细胞过程中 ,巢蛋白又呈现返祖性表达。巢蛋白的表达受其内在的基因调控元件以及核激素受体 配基复合物、转录因子等调控。巢蛋白的功能与维持前体细胞正常的形态结构有关 ,也可与其它中间丝蛋白共聚组装成中间丝发挥细胞骨架的作用     

神经干细胞有丝分裂过程中nestin表达变化

在哺乳动物胚胎早期发育过程中 ,中枢神经系统的神经干细胞 ( NSCs)首先通过对称分裂进行自身复制 ,然后通过不对称分裂产生神经元和胶质细胞的前体细胞 ,这些细胞都表达一种中间纤维蛋白 ( IF) -神经巢蛋白 ( nestin)。nestin的表达是暂时的 ,一旦前体细胞分化成终末分化细胞如神经元或胶质细胞 ,nestin则被其他中间纤维蛋白所取代。不同中间纤维在体内不同时期表达的原因和执行的功能还不清楚 ,但可以肯定的是 nestin与 NSCs的多潜能性有关。本实验通过缩时显微成像和免疫组织化学技术观察了 NSCs在对称分裂过程中 nestin的表达变化 ,发现 nestin在前、中、后、末四期的荧光强度表达有不同程度的变化 ,分裂前期与分裂间期相同 ,前中期荧光强度有明显增强 ,到中期荧光强度反而有些下降 ,到末期荧光强度达到最大值 ,胞质分裂后荧光强度逐渐下降。这种波动表达现象将有助于揭示 NSCs维持其多潜能性的奥秘     

雌激素受体在大鼠垂体前叶的分布

目的　观察ERα和 β两个亚型在大鼠垂体前叶的表达及两者是否共存。 　方法　用种属特异性抗体 (兔抗大鼠ERα和羊抗大鼠ERβ抗体 )进行免疫组织化学染色。 　结果　ERα免疫反应物质位于细胞核内 ,其阳性细胞主要分布于垂体前叶和后叶 ,中间叶极少。ERβ免疫反应物质位于胞浆和胞膜 ,其阳性细胞主要分布于垂体前叶和中间叶 ,后叶不表达。ERα和ERβ可共存于同一细胞。　结论　ERα和ERβ在大鼠垂体前叶分布不同 ,但部分细胞有共存 ,提示两者在介导雌激素的作用中有不同功能     

雌激素受体在大鼠垂体胶叶的分布

目的 观察ERα和β两个亚型天大鼠垂体前叶的表达及两者是否共存。方法 用种属特异性抗体（兔抗大鼠ERα和羊抗大鼠ERβ抗体）进行免疫组织化学染色。结果 ERα免疫反应物质位于细胞核内，其阳性细胞主要分布于垂体产叶和后叶，中间叶极少，ERβ免疫反应物质位于胞浆和胞膜，其阳性细胞主要分布于垂体前叶和中间叶，后叶不表达。ERα和ERβ可共存于同一细胞。结论 ERα和ERβ在大鼠垂体前叶分布不同，但部分细胞有共存，提示两者在介导雌激素的作用中有不同功能。     

体外培养的神经球中表达神经巢蛋白细胞的流式细胞术检测

采用体外培养不同时间的神经干细胞球 ,间接荧光法标记神经巢蛋白 (nestin) ,以流式细胞术检测神经干细胞球中表达nestin细胞的情况。结果显示 :在培养不同时间的细胞群体中均检出 nestin阳性细胞 ,培养 7d、1月、3月和 6月的细胞群含nestin阳性细胞数百分比分别为 (4 2 .2± 7.6) %、(4 1.7± 7.3 ) %、(3 3 .8± 12 .9) %和 (3 7.1± 5 .0 ) % ,几个时间点的细胞群体所含的 nestin阳性细胞数的百分比之间无显著性差异。提示 ,在体外培养条件下 ,神经干细胞群体可能通过自我更新和分化的调控 ,保持 nestin阳性细胞于一种较为恒定的比例。     

大鼠受损视神经中神经前体细胞的变化及预变性腓总神经的调节

为了研究大鼠受损视神经内神经前体细胞的变化及调节,本研究建立了成年雄性大鼠视神经损伤及自体腓总神经移植模型,分正常组、损伤组和移植组,体外培养视神经的神经前体细胞,在相差显微镜下观测各组神经前体细胞神经球的形态和数目,以免疫荧光细胞化学方法对神经球细胞进行鉴定。结果显示:正常组神经球较小、较少,多数细胞表达nestin、GFAP或半乳糖脑苷脂(GC);视神经损伤后神经球的总数有所增加,但大神经球数明显减少,nestin、GFAP或GC阳性细胞也明显减少;神经移植后增加了各类神经球数,nestin、GFAP或GC阳性细胞也明显增加。本研究提示成年大鼠视神经内神经前体细胞较少,增殖能力较弱;视神经损伤也伤及其神经前体细胞并抑制其增殖;自体神经移植能保护神经前体细胞并促进其增殖。     

大白鼠神经垂体的超微结构及其联系

本文用电子显微镜技术,对大白鼠神经垂体的超微结构进行了研究。结果除证实神经分泌物质在神经末梢内贮存并释放人血液外,还显示在神经分泌末梢之间存在着轴-轴突触样结构;在神经分泌末梢与垂体细胞之间,存在着神经-胶质突触样连接;在垂体细胞之间,存在着中间连接。轴-轴突触和神经-胶质突触样连接的特点是:1.突触前、后膜呈不显著的增厚;2.突触前成分内,有成群的微泡靠近并附着于突触前膜;3.突触间隙为20 nm左右,内含多少不等的电子致密物质。作者认为,以上两种突触样结构和垂体细胞,均与神经分泌物质释放的调节有关。     

脑nestin-ir神经元的发现-形态、化学、投射和功能

<正>巢蛋白(nestin)属于中间丝蛋白家族,由于其主要在胚胎期和成年的神经前体细胞表达的特性,自发现以来,一直被视为神经前体细胞的标志物。然而,本实验室首次观察到,正常成年大鼠和成人一些脑区内的神经元也呈nestin免疫阳性反应。关于这些nestin免疫反应阳性神经元(nestin-ir神经元)的许多特性尚需阐明,如这些nestin-ir神经元的化学属性是什么?是否为投射神经元?投射的靶区何在等。近几年来,本实验室针对这些神经元的分布、形态及其可能的特性和功能进行了一些相关的研究,现将已取得的研究成果作一综述。     

巢蛋白在脑内的表达

巢蛋白是第Ⅵ型中间丝蛋白,常作为神经前体细胞的标志物。但近期的研究发现在成年大鼠及成人的脑内存在广泛的巢蛋白表达,巢蛋白可在具有神经生发功能的区域、神经胶质细胞及成熟的神经元中表达。本文对巢蛋白的结构、功能及巢蛋白在脑内的表达情况进行综述,供脑功能研究者参考。     

小鼠垂体巢蛋白阳性细胞在体外具有集落生长能力

目的 研究小鼠垂体前叶中巢蛋白(Nestin)阳性细胞在体外培养环境中的自我增殖能力. 方法建立小鼠垂体Nestin阳性细胞克隆生长培养条件,观察次代细胞在其中的生长情况.应用野生型细胞和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)细胞混合培养,以及BrdU渗核实验鉴定次代Nestin阳性细胞培养过程中新生细胞群的来源.结果次代Nestin阳性细胞在克隆生长培养基中能够自我增殖.野生型细胞和EGFP细胞混合培养实验表明,新生细胞群由纯野生型细胞或纯EGFP细胞构成.BrdU渗核实验显示,24h内新生细胞群中有13%的细胞由分裂产生(n=20). 结论 部分小鼠垂体前叶Nestin阳性细胞在体外培养环境中具有克隆生长能力.     

人胎儿脑室区神经前体细胞的分离纯化、培养及鉴定

目的建立有效的人胎儿神经前体细胞分离及纯化系统。方法取人自然流产胎儿脑室区(VZ)并制备单细胞悬液,采用免疫磁珠法分离CD133阳性及CD133阴性细胞群,体外培养并比较两者增殖能力。用免疫荧光化学方法检测CD133阳性细胞群中神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达及诱导分化后的多向分化潜能。结果纯化后CD133阳性细胞群体外扩增能力强,在无血清培养体系中能形成神经球并可连续传代,免疫荧光化学法检测表明其nestin抗原阳性,诱导分化后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。而CD133阴性细胞在培养体系中多呈单个分散状态,神经球形成数目与CD133阳性细胞有显著性差异(P<0.05)。结论免疫磁珠法可有效分离人胎儿脑内CD133阳性细胞,且该细胞在体外培养体系中具有神经前体细胞的特征。     

皮质素对神经垂体酸性磷酸酶影响的电镜组织化学观察

本研究给大鼠肌注大剂量醋酸可的松(25 mg/d),取垂体神经部,分别用多聚甲醛-戊二醛混合固定液或粹取、分馏后的戊二醛固定,冰冻切片,硫化铅法作酸性磷酸酶的组织化学反应。Caulfied液重固定,常规电镜包埋和超薄切片,省略枸橼酸铅复杂,电镜观察。正常大白鼠垂体神经部的酸性磷酸酶(AcP)阳性反应仅见于垂体细胞和毛细血管内皮细胞,反应产物沉积于稀少的溶酶体和不发达的高尔基复合体。注射醋酸可的松后,垂体神经部的AcP阳性反应区着色增强,溶酶体增多、体大,除垂体细胞和内皮细胞外,还见AcP阳性细颗粒均匀地分布于暗垂体细胞的质突,神经分泌纤维或末梢内也可见阳性反应沉积物,随着药物用量增加,AcP阳性反应区有扩大的趋势。本文进一步讨论了皮质素对神经分泌的作用和垂体细胞在神经分泌过程中的机能意义。     

巢蛋白在不同发育阶段人胚胎脊髓中的表达变化

目的:研究人胚胎脊髓生长发育过程中巢蛋白(nestin)的变化趋势。方法:采用免疫组织化学方法对不同发育时期(3周～8个月)的人胚胎脊髓中巢蛋白(nestin)的表达及变化进行了研究。结果:Nestin阳性细胞在神经上皮贯穿整个发育过程,5周基板、翼板形成后即可见到阳性物,而边缘层6周出现。中央管、基板、翼板、边缘层内nestin阳性细胞达高峰的时间分别是6周、7周、8周、9周,而表达明显减少的时间分别是8周、9周、10周、11周。随着脊髓的发育成熟,灰、白质内nestin阳性产物逐渐减少,而中央管的阳性细胞数至3月后较为稳定。结论:在脊髓不同部位神经干细胞出现时间和达到高峰的时间均不同,提示在脊髓的不同部位神经干细胞增殖、分化并不同步。     

胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导，为糖尿病患者实施细胞移植治疗建立基础。方法将胚胎干细胞（ESC）在成纤维细胞（MEF）饲养层上扩增后脱离饲养层，让ESC自发分化成拟胚体（EB），再将EB诱导为巢蛋白（nestin）阳性的神经前体细胞（NPC），最后将NPC诱导成胰岛素分泌细胞（IPC）。结果ESC在MEF饲养层上扩增4d后，在悬浮培养状态下自发分化为EB。将EB在NPC选择性培养基中做贴壁培养后，ESC先分化为上皮样细胞，再分化为神经细胞样细胞。经过nestin免疫组化检测，在经过NPC培养基诱导4d的细胞，nestin阳性细胞占86．5％。nestin阳性细胞在IPC选择性培养基中诱导5～6d后，可分化成胰岛素分泌细胞。结论ESC来源的nestin阳性细胞既可以分化为NPC，也可以分化为IPC。     

人脐血来源神经元样细胞的分离与鉴定

目的 探讨人脐血单个核细胞(MNCs)体外培养后的神经元特有分子表达和形态特征。方法 密度梯度离心法分离脐血中单个核细胞,部分接种于培养瓶内,部分细胞接种在6孔培养板内。倒置显微镜下观察培养细胞形态变化。RT-PCR方法检测MNCs培养前后神经细胞标志物nestin、NF-M及MAF2 mRNA的表达,培养14d后行免疫细胞化学鉴定。结果 培养前脐血MNCs胞体小呈圆形,神经干,前体细胞特异性抗体nestin阳性细胞、神经元特异性抗体MAP2和NF-M阳性细胞散在分布,阳性率分别为1．5％、3．4％和2．5％。培养14d后,倒置显微镜下可见一些有多个粗长突起的细胞群,相邻细胞突起连成网状;免疫细胞化学检测MAP2、NF-M染色阳性细胞成片状分布,阳性率分别为27．6％和21．7％。RT-PCR检测脐血单个核细胞nestin、NF-M及MAP2基因表达呈阳性,培养14d后上述基因表达上调。结论 脐血细胞中可能沉寂有神经(干)前体细胞,经体外培养后能分化为具有一定形态的类神经细胞。     

Sertoli细胞诱导大鼠胚胎中脑神经干细胞定向分化的研究

目的研究Sertoli细胞对胚胎中脑神经干细胞的营养及向多巴胺能神经元分化的诱导作用。方法将大鼠Sertoli细胞与胚胎13d大鼠中脑神经前体细胞体外共培养5、7、10、14d后,免疫荧光检测神经干细胞标记物Nestin、神经元前体细胞标记物β-Ⅲ tubulin、多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况。结果随着共培养时间的延长,神经干细胞中nestin阳性细胞数量逐渐减少,β-Ⅲ tubulin阳性细胞数在共培养7d时较多,TH阳性的神经元在共培养10d时数量最多。而且在各时间段TH阳性细胞数均多于单独培养的神经前体细胞。结论Sertoli细胞能够诱导与其共培养的胚胎中脑神经干细胞定向分化为多巴胺能神经元。     

Sertoli细胞对大鼠大脑皮质神经前体细胞的诱导分化作用

目的:研究Sertoli细胞对体外培养大鼠皮质神经前体细胞生长发育的促进作用,及向多巴胺能神经元分化的诱导作用.方法:将大鼠Sertoli细胞与14 d大鼠皮质神经前体细胞体外共培养,免疫细胞化学检测神经干细胞标记物巢蛋白,神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞标记物βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(GalC),及多巴胺能神经元标记物酪氨酸羟化酶(TH)的表达情况.结果:随着共培养时间的延长,神经前体细胞中GFAP阳性细胞数量逐渐减少,而β-Ⅲ tubulin 阳性细胞数增多,并出现TH阳性神经元.结论:Sertoli细胞抑制体外培养的大鼠皮质神经前体细胞的生长,但具有显著促神经元分化作用,并能够诱导与其共培养的大鼠皮质神经前体细胞分化为多巴胺能神经元.     

损毁单侧黑质-纹状体通路的大鼠SVZ、纹状体和黑质神经前体细胞的变化

研究成年大鼠脑室下区 (SVZ)神经前体细胞 (neural precursors)在黑质 -纹状体通路损伤后的反应 ,本研究用 6-羟多巴胺单侧纹状体注射以损毁黑质 -纹状体通路 ,损毁 10 d后腹腔注射 Brd U ,连续 4d,每日两次 ;在 SVZ、纹状体和黑质部位用免疫组化方法检测 Brd U、nestin以及 GFAP阳性细胞。结果显示 :(1) 6-羟多巴胺损毁黑质 -纹状体通路后 ,伤侧 SVZ的 Brd U阳性细胞数明显增多 ,并成簇分布 ;nestin和 GFAP阳性细胞数也增多 ,但以 GF AP阳性细胞增多明显 ;(2 )伤侧纹状体可见大量 Br-d U、GFAP以及少量 nestin阳性细胞分布 ,而健侧只有少量 GFAP阳性细胞 ;(3 )伤侧可见 Brd U阳性细胞在 SVZ和纹状体之间呈条带样分布 ;(4 )伤侧黑质除酪氨酸羟化酶阳性神经元减少外 ,未见 Brd U、GFAP和 nestin阳性细胞表达。上述结果表明 ,6-羟多巴胺损毁黑质 -纹状体通路后 ,SVZ神经前体细胞活动增强 ,有向纹状体迁移的趋势。     

人胚胎期垂体的形态学研究

将各胚胎期垂体分别测量后速入Bouin或Helly液固定,石蜡包埋,将连续切片进行特殊染色,在光镜下观察并记述了腺垂体和神经垂体的早期发生过程及内部构筑。我们将腺垂体的发生过程分为原基变形期、增生期和增生分化期。实验中记录了各种阳性细胞出现时间及百分值,并且將各种数据进行了统计学处理。文末对垂体发生和分化的动力学问题进行了讨论。     

甘丙肽和经典激素在大鼠垂体前叶细胞内的共存研究—免疫组织化学方法

用免疫组织化学方法，证实大鼠垂体前叶中存在相当数量的甘丙肽免疫反应细胞。用相邻切片免疫组化方法，发现甘丙肽免疫阳性细胞同时与所有ＡＣＴＨ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＦＳＨ、ＴＳＨ等５种垂体前叶经典激素在腺细胞内共存，此结果为进一步研究垂体前叶神经活性物质和激素之间的关系。