HIV-Ⅰ慢病毒载体的研究进展与应用

基因治疗是治疗肿瘤、遗传病等难治性疾病的最有效手段之一,但目前的基因转移方法存在一定的局限性,成为基因治疗和广泛应用的障碍.以1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)为基础构建的慢病毒载体(LV)具有感染分裂及非分裂细胞、使目的 基因产物表达稳定、表达时间长、载体自身免疫原性小等优点,尤其是LV能有效诱导免疫应答,抑制肿瘤生长,诱导移植免疫耐受等,是很有发展潜力的体内基因治疗新载体.     

人类白细胞抗原-G5慢病毒表达载体构建与病毒包装

目的:构建人类白细胞抗原G5(HLA-G5)的表达载体,并进行慢病毒包装,为进一步研究HLA-G5功能提供基础工具。方法:人工合成HLA-G5全长序列经测序正确后,定向接入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,转化入大肠杆菌,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。结果:经琼脂糖凝胶电泳鉴定、PCR鉴定及测序,HLA-G5表达质粒质量合格,序列比对与设计序列符合率100%,HLA-G5慢病毒滴度测定为7.06×108。结论:成功地构建了HLA-G5表达载体并完成了慢病毒包装,为今后的研究工作提供了基础工具。     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及表达性能鉴定

为了进一步探讨EB（Epstein Barr）病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的作用机制及其功能，我们构建了EDL2-N-LMP-慢病毒载体，并对所构建的EDL2-N-LMP-慢病毒载体结构及表达进行鉴定。     

Gαs慢病毒载体的构建、鉴定与表达

目的:构建Gαs慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究Gαs功能。方法:设计针对人Gαs DNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的FUW载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质粒,转染293T细胞。用293T细胞制备慢病毒颗粒,感染293T细胞后收集细胞全蛋白,用QPCR、Western blot检测慢病毒系统过表达效果。结果:证实人Gαs正确插入慢病毒载体,人Gαs慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能有效过表达Gαs。结论:人Gαs慢病毒表达系统的成功建立,为应用过表达技术研究人Gαs慢病毒功能打下了基础。     

大鼠微小RNA miR-16的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆微小RNA rno-miR-16,构建其慢病毒表达载体pLV-miR-16并包装成慢病毒颗粒,为进一步研究miR-16的功能奠定了实验基础.方法 从大鼠细胞基因组中用PCR 的方法扩增miR-16 的前体,构建了miR-16的重组表达载体pLV-miR-16,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物(pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV)共转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果 经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR-16基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得108＞ifu/ml.结论 成功构建大鼠慢病毒载体pLV-miR-16,为深入研究rno-miR-16的生物学功能奠定了基础.     

BIRC5 shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,采用PCR扩增和DNA测序鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳阳性克隆得到335 bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含设计合成序列。结论:4对BIRC5 shRNA重组慢病毒表达载体构建成功,为研究靶向BIRC5 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

慢病毒载体构建及结构优化

慢病毒载体目前是基因治疗中研究较多的载体 ,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较 ,它有感染非分裂期细胞及容纳外源性目的基因片段大等优点。对其结构的优化主要集中在提高生物安全性、提高转基因表达、转基因表达的调控及载体靶向性等方面。本文介绍了慢病毒载体构建及结构优化方面的研究进展作一综述     

人microRNA-146a慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建针对has-miR-146a的慢病毒表达载体,并鉴定成熟has-miR-146a在细胞内表达水平。方法PCR扩增pri-miR-146a,克隆于慢病毒载体plenti-GFP中,转染293FT细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,感染Jurkat细胞。结果成功构建了has-miR-146a的慢病毒表达载体,建立了高效转染系统。结论建立了高效稳定表达has-miR-146a的慢病毒转染系统。     

含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测

目的 构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能。方法 使用HindⅢ将HIV-1 Tatl0l蛋白编码基因从pEN质粒中切出，插入到表达质粒IZRSpBMN-Z中，构建成重组反转录病毒表达质粒IZRS-Tat101。采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(φNX)中，嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染φNX细胞中的表达水平。收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清，并分别感染293细胞，Western blot检测Tat在293中表达。与此同时，收集感染293细胞培养上清，加入到HL3T1细胞(HeLa-HIV-1-LTR／CAT报告基因)中，共培养72h后收集细胞，提取蛋白作CAT活性检测。结果 ①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后，Tat在临时转染φNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平；②临时转染病毒感染293细胞，Tat在感染细胞中得到了表达，且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子，使得其下游的CAT基因得到表达。结论 重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白，且表达蛋白具有转录激活功能。     

人幽门螺杆菌外膜蛋白18000 DNA疫苗的构建及表达

目的：构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H-pylori)18000外膜蛋白编码基因的真核重组载体，并在COS-7细胞中表达，为核酸疫苗的开发奠定基础。方法：从原核表达质粒pET32a( )／528中，酶切H-pylori 18000外膜蛋白编码基因片段，将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pcDNA3．1进行连接，而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，以RT-PCR，Western法检测其表达产物。结果：经单、双酶切证实插入的基因片段为H-pylori 18000外膜蛋白编码基因；采用RT-PCR方法，能够从转染的COS-7细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段，Western法等检测显示，该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白，而且具有生物活性。结论：成功地构建了核酸疫苗pcDNA3．1／528，并在COS-7细胞中表达，为H-pylori核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。     

Murine retroviral vector that induces long-term expression of HIV-1 envelope protein

A retroviral vector was constructed that induces long-term expression of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) rev, vpu and env genes. The vector contains the neo gene and a cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter followed by HIV-1 sequence. When HeLa cells were infected with viral stocks derived from this vector, about 25% of the resulting G418-resistant clones expressed HIV-1 envelope protein (Env), easily detectable by Western blot analysis, metabolic labelling, and syncytium formation after co-cultivation with HeLa-CD4 cells. In most cases the level of Env expression was higher than in a T cell line (H9) chronically infected with HIV-1. Env-expressing HeLa cell lines also expressed Rev, detected by transfection with a Rev-dependent CAT gene construct, and Vpu, detected by immunoprecipitation with a Vpu-specific antiserum. The 75% of G418-resistant HeLa cell lines that did not express Env were found to contain proviruses that had undergone deletion of env sequences corresponding to a known intron; presumably these cell lines arose as a result of infection with virions derived from spliced RNAs. This vector should be useful for studying non-transient effects of HIV Env, Rev and Vpu in tissue culture, and for the production of Env- and/or Rev-expressing cell lines.     

HIV-1 Tat基因的融合构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的：在E．coli BL21(DE3)中高效表达Tat蛋白。方法：用PCR方法构建HIV-1 Tat基因全序列，同时将Tat基因进行定点突变(AAG28替换为CAG，AAG50替换为CAG)，以消除天然．Tat蛋白的转录活性。将突变的Tat基因与伴侣10(chap10)基因连接后，共同亚克隆人表达载体pET28a中，并在Ecoli中表达，表达产物用Western blot进行鉴定。结果：分别通过3轮PCR，成功地构建了Tat基因全序列。构建的重组质粒pET28a-chap10-Tat在Ecoli BL21(DE3)中得到高效表达。Western blot分析表明，在相对分子质量(Mr)为24000处有1条特异性的带。结论：chap10基因与HIV-1 Tat全基因的融合构建，使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，为其在爱滋病发病中作用研究奠定了基础。     

Inhibition of HIV-1 expression by HIV-2

HIV-1 and HIV-2 are co-endemic in certain geographic areas. HIV-2 is more weakly pathogenic than HIV-1, and progression to AIDS occurs less frequently and over a longer period of time. Recent epidemiologic studies suggest that individuals infected with HIV-2 have a lower risk of HIV-1 infection. Both immune mechanisms and various modes of viral interference have been proposed to account for these results. Our findings, described in this paper, suggest that HIV-2 inhibits HIV-1 replication. To study the molecular interactions between HIV-1 and HIV-2, proviral clones were transfected alone or in combination into the human T cell line CEM. LTR-CAT indicator constructs were included for the purpose of monitoring viral promoter activity. Viral replication in transfected cells was monitored by p24 antigen capture assay of cell culture supernatants and Western blot analysis of cell extracts. HIV-2 inhibited HIV-1 replication as determined by intracellular and extracellular p24 antigen levels. Similar results were obtained with simultaneous virus infection using HIV-1 and HIV-2, rather than transfections of proviral DNA. Using cotransfection of HIV-1 and HIV-2 LTR indicator gene constructs, the mechanism of inhibition was found to be suppression of the HIV-1 LTR by HIV-2. The inhibitory effect of HIV-2 is not due to Tat-2, but appears to discriminate between the HIV-1 and HIV-2 LTRs based on differences in the Tat activation response element, TAR. These results suggest both a molecular mechanism for HIV-2 interference with HIV-1 replication and a potential molecular approach to therapy.     

中国株HIV-1结构蛋白基因gag与gp120在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

目的：将中国流行株B亚型HIV－1结构蛋白基因gag和gp120的巴斯德毕赤酵母中进行融合表达。方法：以酵母分泌型表达质粒pPIC9为载体，构建含HIV－1 gag和gp120嵌合基因的重组酵母表达质粒pPICGP。用Sac I将pPICGP线性化后，电转化巴斯德毕赤酵母GS115，用PCR的方法鉴定阳性酵母转化子。阳性转化子在巴斯德毕赤酵母中用甲醇进行诱导表达，表达产物以SDS－PAGE和Western blot进行分析，并对阳性菌株的遗传稳定性进行研究。结果：12个酵母转化子中共筛选到了8个阳性酵母转化子，其整合率为66．7％。SDS－PAGE和Western blot分析显示，在相对分子质量（Mr）为57000处有1条特异蛋白带，且能与抗p24单抗（mAb)和抗gp120mAb发生反应。酵母转化子在YPD培养基上传代10次后，其外源基因未丢失。结论：在巴斯德毕赤酵母中成功地表达了HIV－1 gag-gp120嵌合基因，且表达蛋白具有特异性，但其Mr较预计计算的值要小，说明嵌合基因中的gp120基因只有部分进行了表达。     

HIV-1膜蛋白GP120V1/V2区域的真核表达、纯化和鉴定

目的:真核表达北美HIV-1分离株BAL和中国分离株CNE1两种毒株的V1V2,并纯化、鉴定其生物活性,为血清学分析鉴别HIV-1感染病人抗体反应及性质提供实验基础。方法:本研究将HIV-1北美分离株BAL和中国分离株CNE1两种毒株的V1V2基因序列定向克隆到多系统表达载体pTriEx-3 Hygro vector(Merck&Co.,Inc.)中,构建了表达质粒,并将表达质粒瞬时转染293T细胞,144小时后收获上清液,经浓缩、纯化后,SDS-PAGE电泳,Western blot检测蛋白的表达,ELISA检测其与HIV-1阳性病人血清的反应性。结果:经SDS-PAGE电泳、Western blot、ELISA方法证实确实得到了有免疫反应活性的V1V2蛋白,从表观分子量判断,表达的V1V2蛋白被糖基化修饰。使用V1V2蛋白作为抗原,分析发现中国HIV-1阳性病人体内比较广泛的存在着V1V2的抗体,为血清学的分析奠定了实验基础。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

赖型钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL41基因真核表达质粒的构建及表达

目的：构建赖型钩端螺旋体LipL41基因的真核重组表达质粒、并对其表达进行检测。方法： 以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板PCR扩增目的基因，克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1上。测序分析后酶切，并连接至真核表达质粒pcDNA3上，构建真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3。利用脂质体介导转染COS7细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR检测其表达。结果： PCR扩增出1 011 bp大小的目的片段，序列分析显示它与Leptospira kirschneri的LipL41基因成熟肽序列同源性高达98%。酶切鉴定证实真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3构建成功，RT-PCR检测显示，LipL41-pCDNA3转染组在大约1kb处出现特异的扩增带，而空质粒组无此条带。结论：LipL41的真核重组表达质粒构建成功，并可在哺乳动物细胞中表达。     

人MAdCAM-1真核表达载体的构建及其表达细胞株的建立

目的:建立表达人MAdCAM-1的细胞模型。方法:从pUC21/hMAdCAM-1质粒酶切下hMAdCAM-1全长cDNA片段,将其克隆于巨细胞病毒载体pCIneo中,构建出由CMV启动子控制的重组真核表达载体pCIneo-hMAd,经脂质体介导转染至CHO细胞,以G418筛选抗性克隆。结果:筛选出的阳性克隆细胞以免疫荧光和免疫酶标染色法检测,表明有人MAdCAM-1分子表达;其细胞裂解物经免疫印迹分析,证实约63 kD的新增蛋白带与抗 hMAdCAM-1抗体有特异性结合反应;淋巴细胞粘附实验结果提示表达产物具有一定的功能活性。结论:成功地获得了表达人MAdCAM-1分子的细胞株,为进一步研究其生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

Selective elimination of HIV-1-infected cells by Env-directed, HIV-1-based virus-like particles

We recently showed that both replicating and resting cells cultivated with ganciclovir (GCV) were killed when challenged with vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped HIV-1-based virus-like particles (VLPs) carrying the Nef7 (i.e., an HIV-1 Nef mutant incorporating in virions at high levels)/herpes simplex virus-1 thymidine kinase (HSV-TK) fusion product. On this basis, a novel anti-HIV therapeutic approach based on Nef7/TK VLPs expressing X4 or R5 HIV cell receptor complexes has been attempted. We here report that (CD4-CXCR4) and (CD4-CCR5) Nef7-based VLPs efficiently enter cells infected by X4- or R5-tropic HIV-1 strains, respectively. Importantly, the delivery of the VLP-associated Nef7/TK led to cell death upon GCV treatment. Of interest, VLPs were effective also against non-replicating, HIV-1-infected primary human monocyte-derived macrophages. HIV-targeted VLPs represent a promising candidate for the treatment of persistently HIV-1-infected cells that are part of virus reservoirs resistant to HAART therapies.