空肠弯曲菌PEB1 DNA和PEB1蛋白联合免疫小鼠的效果评价

目的初步检测抗空肠弯曲菌感染外膜黏附蛋白(PEB1)核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫诱导小鼠免疫应答水平。方法通过灌胃免疫的方法,将制备的核酸疫苗pcDNA3.1(-)-PEB1及蛋白疫苗PEB1采用核酸初次免疫-蛋白加强免疫及分别单独免疫的方法免疫雌性BALB/c小鼠,以PBS及空质粒pcDNA3.1(-)对照,检测各组小鼠体液免疫应答及细胞免疫应答水平。末次免疫后第28天,对各组小鼠灌胃攻击空肠弯曲菌,评价疫苗保护率。结果免疫后第56天,核酸蛋白联合免疫组小鼠脾淋巴细胞刺激指数(SI)为2.625±0.275,脾细胞培养上清中IFN-γ含量为(258.92±13.472)pg/mL。血清IgG抗体滴度为(2.507±0.124)μg/mL,胃和小肠黏膜冲洗液sIgA抗体滴度为(80.351±5.769)ng/mL,脾细胞培养上清中IL-4(377.47±14.560)pg/mL水平均明显高于各对照组(P0.05)。小鼠攻击试验显示:核酸蛋白免疫组的疫苗保护率为91.53%。结论PEB1核酸蛋白联合免疫组诱导的免疫应答水平和疫苗保护率高于单独核酸疫苗免疫组和单独蛋白疫苗免疫组。     

脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的免疫效果

目的研究原核重组表达的B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白0315(rNMB0315)在诱导小鼠产生特异性免疫应答中的作用、免疫血清抗体体外杀菌活性和重组蛋白的免疫保护效果,初步评价rNMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的潜力。方法将构建的原核表达载体p ET30a-NMB0315转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白,纯化鉴定后的重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,检测体液免疫和细胞免疫水平;测定血清抗体在补体介导下的体外杀菌活性,观察rNMB0315蛋白疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果 rNMB0315具有良好的免疫原性,能诱导产生较高水平的体液免疫应答:包括血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG3、IgG2b和生殖道黏膜特异性分泌型IgA(s IgA),免疫后第6周抗体效价分别为1∶150 000、1∶85 000、1∶60 000、1∶35 000、1∶30 000和1∶30 000;也能激发较高水平的细胞免疫应答,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的刺激指数(SI)值明显高于PBS、Freund佐剂对照组。在免疫的2、4、6周,血清IgG2a/IgG1比值均小于1,提示rNMB0315疫苗以诱导Th2细胞性体液免疫应答为主。rNMB0315疫苗免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价为1∶128;72 h内,对实验小鼠的免疫保护率为90%。结论原核表达的rNMB0315具有良好的免疫活性和免疫保护效果,NMB0315外膜蛋白具有作为预防B群流脑蛋白疫苗候选抗原的潜力。     

含E型沙眼衣原体MOMP基因的重组腺病毒和DNA疫苗联合免疫效果的研究

目的探讨E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）DNA疫苗和重组腺病毒联合免疫小鼠诱导的免疫效应。方法构建、纯化重组腺病毒Ad-MOMP及重组真核表达质粒pVAX1-MOMP。设计4种免疫方案,分别为DNA免疫（ DNA组）、重组腺病毒免疫（ Ad组）、DNA初次免疫-重组腺病毒加强免疫（ DNA/Ad组）、重组腺病毒初次免疫-DNA加强免疫（ Ad/DNA组）。末次免疫后2周检测小鼠血清特异IgG、IgG1、IgG2a、IgA抗体,阴道分泌物SIgA抗体及脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-10水平。结果DNA组诱导较弱免疫应答,未产生SIgA抗体及Th1反应。 Ad组诱导出Th1反应及SIgA抗体,且血清抗体显著高于DNA组。联合免疫均能诱导明显强于单独免疫的黏膜SIgA、血清抗体及Th1反应。 Ad/DNA组的Th1反应强于DNA/Ad组;而DNA/Ad组的血清抗体和黏膜抗体水平强于Ad/DNA组。结论Ad-MOMP能诱导黏膜免疫及Th1细胞免疫应答,DNA/Ad及Ad/DNA联合免疫产生的特异性免疫应答明显强于单独免疫。其中Ad/DNA的Th1反应优势更明显,DNA/Ad的血清抗体和黏膜抗体反应更强。接种顺序会影响联合免疫的强弱及类型,这为Ct疫苗的设计研究提供新的思路和实验依据。     

重组弓形虫棒状体蛋白5诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用

为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应,本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5,并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用。采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段,将该基因片段克隆至pET-28a原核表达载体表达,用重组ROP5蛋白免疫BALB／c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠抗体和细胞因子的变化。以强毒型RH株弓形虫攻击感染免疫小鼠,统计小鼠不同时间存活率,评价重组蛋白产生的免疫保护性。结果表明ROP5重组蛋白疫苗免疫BALB／c小鼠诱导机体产生高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体和IFN—y、IL-2及IL-10细胞因子。与PBS及佐剂对照组相比,重组蛋白免疫组小鼠的存活时间明显延长。本实验证实了ROP5重组蛋白免疫BALB／c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,以及一定的抗弓形虫感染保护作用。     

以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的 构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础.方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd -pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd -pVAX1-BLS-L7/L12).以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价.结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生.通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主.结论 所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主.可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗.     

鼠疫F1-V重组蛋白疫苗滴鼻免疫应答效果的研究

目的 以重组霍乱毒素B亚单位（rCT-B）为鼠疫F1-V重组蛋白的佐剂制备黏膜疫苗,观察小鼠诱导的黏膜免疫和系统免疫应答效果。方法以制备的鼠疫黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠4次免疫后,采用间接ELISA检测血清特异性抗F1-V的IgG和IgA抗体及抗体亚型分类,检测鼻咽喉、肺、小肠及阴道灌洗液中特异性抗F1-V的黏膜分泌型IgA;采用流式细胞术检测鼻相关淋巴组织淋巴细胞、脾淋巴细胞、肠系膜淋巴结及小肠PP结T淋巴细胞表型的变化。结果以rCT-B为佐剂的鼠疫F1-V重组蛋白黏膜疫苗滴鼻免疫后,能够诱导血清中IgG、IgA抗体比正常对照组显著升高（P〈0．01）,同时诱导鼻咽、肺、小肠和阴道内特异性黏膜抗体升高,尤其是肺和生殖道冲冼液内抗体升高极为显著（P〈0．01）。与单纯的F1-V组相比,不同剂量比例疫苗组都能诱导较高、较快的血清IgG、IgA和黏膜sIgA,其中1：2疫苗组能诱导更强的系统免疫和黏膜免疫,但是相比之下,5：1疫苗组是最合适的免疫剂量。结论rCT-B佐剂不仅能提高鼠疫F1-V黏膜疫苗的系统全身免疫应答,还能促进诱导呼吸道、消化道和生殖道等局部黏膜sIgA抗体,增强局部免疫应答,提示rCT-B佐剂能显著提高鼠疫感染的免疫应答作用,这为下一步疫苗的免疫保护评价奠定了基础。     

恶性疟原虫AMA1不同类型疫苗组合免疫接种研究

目的 探索应用恶性疟原虫DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种，诱导针对恶性疟原虫红内期抗原AMA1的保护性抗体。方法PCR扩增云南株恶性疟原虫AMA1编码基因，构建和制备DNA免疫质粒VR1020/E（疫苗D）、重组改良安卡拉痘苗病毒rMVME（疫苗V）和重组原核表达AMAl胞外域蛋白E（疫苗P）。用疫苗D单独或与小鼠GM-CSF表达质粒共同对小鼠进行初始免疫，用疫苗V和疫苗P进行单次或先后各一次追加强化。采用疫苗D-V组合方案免疫新西兰白兔。ELISA测定小鼠血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a的水平，用免疫动物血清进行疟原虫裂殖子体外入侵抑制实验。结果在疫苗D初始免疫的基础上，采用疫苗V或疫苗P进行强化免疫可显著提高小鼠针对AMA1的抗体应答，小鼠血清特异性IgG平均增加15至137倍，GM-CSF表达质粒对疫苗D-V组合免疫小鼠的抗体应答有显著促进作用。采用疫苗D-V组合免疫在家兔可诱导明显的抗体应答。小鼠和家兔免疫血清在体外可显著抑制疟原虫裂殖子对RBC的入侵。结论将DNA疫苗、重组改良安卡拉痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种是诱导疟疾红内期保护性抗体的有效方法。     

犬腺病毒DNA疫苗的免疫实验研究

目的研究犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop刺激机体产生免疫应答的效果。方法采用2种不同的免疫途径和免疫方案免疫Balb/c小鼠;免疫后每周断尾采血,分离血清测定血清IgG抗体效价;采用MTT和CCK-8方法检测免疫小鼠的T淋巴细胞增殖活性,EIA试剂盒测定IFN-γ的浓度。结果所有接种DNA疫苗的小鼠均产生了针对抗原病毒的特异性IgG抗体。细胞学试验提示构建的犬腺病毒DNA疫苗也可诱导小鼠产生细胞性免疫应答,重组质粒-蛋白联合的免疫方案在刺激机体细胞免疫应答方面优于单一重组质粒。结论以上结果提示犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop既能诱导小鼠产生特异性的体液免疫应答,也诱导小鼠产生了细胞免疫应答,对于机体具有一定的免疫保护效果。     

空肠弯曲菌重组蛋白微球疫苗制备及其免疫原性的分析

目的为增强多肽蛋白类药物的免疫效果,制备空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合表达的重组PEB1-LTB蛋白聚丙烯酸树脂微球,分析免疫Balb/c小鼠体内体液免疫应答及细胞免疫应答水平。方法乳剂—溶剂挥发法制备微球,测量微球粒径、包封率和体外释放度。雌性Balb/c小鼠随机分为4组,于第0、14、30天各免疫1次,末次免疫14 d后,检测各组血清特异性IgG、IgA、黏膜冲洗液sIgA水平及脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-4含量。结果制备得到平均粒径在(47.6±10.2)μm的聚丙烯酸树脂微球,包封率为79.87%。微球可耐受胃酸的破坏,在模拟肠液中的释放度4 h后达95.27%。免疫后特异性IgG、IgA、sIgA及IFN-γ、IL-4均明显高于对照组(P0.05)。结论本研究制备的重组PEB1-LTB蛋白聚丙烯酸树脂微球通过口服免疫Balb/c小鼠可以有效的提高其免疫应答。     

抗旋毛虫病Ts87 DNA疫苗滴鼻初免—蛋白疫苗加强免疫策略增强免疫保护应答

为优化抗旋毛虫病核酸疫苗免疫策略,本文探讨了Ts87 DNA疫苗滴鼻初免与蛋白疫苗皮下注射加强免疫诱导产生的保护效果及免疫应答特征.分别在第0d以旋毛虫Ts87 DNA疫苗SL7207/pVAX1-Ts87滴鼻初免,第14/28 d以蛋白疫苗rTs87皮下注射加强免疫小鼠,在第35 d攻击感染旋毛虫肌幼虫,第84 d剖杀小鼠,计算减虫率观察免疫保护效果;进行小鼠血清中特异性IgG抗体效价、抗体亚型分析及肠道盥洗液sIgA水平分析,检测脾淋巴细胞增殖反应、脾及颈部淋巴结细胞分泌细胞因子水平.结果显示,DNA疫苗滴鼻初免—重组蛋白加强的联合免疫组的保护作用优于单独DNA疫苗滴鼻及单独重组蛋白免疫组,显著提高了减虫率(46.1％);DNA疫苗滴鼻初免和蛋白疫苗加强免疫方式不仅诱导小鼠产生了粘膜免疫应答,同时也诱导了有效的细胞和体液免疫应答,其免疫应答类型是以Th2型为主的混合型Th1/Th2免疫反应.该研究为新型抗旋毛虫病疫苗接种策略的优化提供了实验依据.     

空肠弯曲菌DNA疫苗构建及其疫苗免疫程序研究

目的:构建空肠弯曲菌peb1A基因真核表达载体,探讨DNA疫苗不同免疫程序的免疫效果。方法:以重组pET28a(+)-peb1A质粒为模板,将空肠弯曲菌peb1A基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染COS-7细胞中表达,Western blot鉴定表达蛋白;昆明小鼠随机分组:设空白对照组、空载体对照组、pcDNA3.1(-)-peb1A实验组,用ELISA法检测免疫后的昆明小鼠血清IgG和IgM抗体水平。结果:重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经双酶切和PCR鉴定,构建正确。peb1A基因测序结果与GenBank中peb1A基因序列一致。重组质粒成功转染COS-7细胞,并能正确表达重组蛋白。裸DNA组IgG水平均高于两对照组,有显著性差异(P<0.05)。同一剂量短时间(0、10、20天)免疫程序优于长时间(0、15、25、35天)免疫程序(P<0.05)。结论:成功构建空肠弯曲菌真核表达重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A,其经肌肉注射免疫小鼠,具有较好的免疫原性,短时间免疫程序免疫效果好。     

人偏肺病毒DNA疫苗的构建和小鼠免疫反应的研究

目的 构建人偏肺病毒(hMPV)DNA疫苗,小鼠免疫后评价其细胞和体液免疫水平.方法 利用PCR方法,从hMPV的cDNA中扩增融合蛋白FATM(缺失跨膜区)基因和基质蛋白M基因,构建DNA疫苗pcDNA3.1His-FATM和pcDNA3.1His-M,瞬时转染后用Western Blot和间接免疫荧光方法检测F、M蛋白表达.疫苗肌内注射免疫小鼠,ELISA和ELISPOT方法分别检测血清IgG抗体和小鼠脾细胞CTL水平.结果 Western Blot和间接免疫荧光(IFA)方法证明构建的疫苗可表达FATM和M蛋白.peDNA3.1His-FATM单独免疫小鼠,血清抗体滴度为1:44;与pcDNA3.1His-M联合免疫后,血清抗体滴度为1:64.ELISPOT检测证明,联合免疫组小鼠脾细胞产生IFN-γ的效应CD8+T细胞数为42±8.9,高于单独免疫组32±7.4的水平.结论 DNA疫苗peDNA3.1His-F△TM可以诱导产生特异性的体液和细胞免疫,与pcDNA3.1His-M联合免疫,可以提高免疫水平.     

CVB3-VP1基因免疫诱导特异性抗病毒免疫应答及保护作用

目的 :构建表达柯萨奇病毒B3(CVB3)主要包膜蛋白VP1的基因疫苗 ,并研究该疫苗诱导CVB3特异性免疫应答及免疫保护的作用。方法 :抽提CVB3RNA ,以RT PCR扩增VP1基因 ,克隆于真核表达载体 pcDNA3中 ,构建质粒pcDNA3 VP1。将该质粒转染Hela细胞 ,观察其表达情况 ;以 5 0 μgpcDNA3 VP1质粒DNA肌注免疫BALB/c小鼠 3次 ,检测CVB3特异性体液和细胞免疫应答。间隔 4wk以 5×LD50 的CVB3攻击小鼠 ,观察攻击后小鼠的存活情况。结果 :构建了重组质粒 pcDNA3 VP1,并在体外获得有效表达。以该质粒肌肉免疫BALB/c小鼠 ,可诱生高水平的IgM和IgG ,VP1多肽特异性淋巴细胞增殖反应及CTL活性均显著高于 pcDNA3免疫的对照组。病毒攻击试验表明 ,pcDNA3 VP1免疫组33.3%小鼠可长期存活 ,其心肌组织未见明显的病理学改变 ;而对照小鼠平均仅存活 6 .7d ,心肌显示大量的局灶性坏死和炎性细胞浸润。结论 :pcDNA3 VP1免疫可诱生CVB3特异性体液及细胞免疫应答 ,保护免疫小鼠抵抗CVB3的致死性攻击     

人乳头瘤病毒18型L1-E6、E7嵌合基因DNA疫苗的体内免疫效应

目的：检测HPV18 L1-E6、E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应。方法：将实验动物BALB/c小鼠54只随机分为9组，按不同免疫方式(肌肉接种或鼻内滴注)分别给予不同的重组质粒(pVAX1-L1-E6M3或pVAX1-L1-E7M3)和免疫佐剂(pLXHDmB7-2或LTB)。用免疫原免疫3次，末次免疫后取眼球后血进行ELISA抗体检测。末次免疫后进行小鼠足垫迟发型超敏反应(DTH)试验。断足进行小鼠足垫HE染色。取小鼠脾脏制成单细胞悬液，进行脾细胞增殖试验，并进行CD4^ /CD8^ T细胞中IFN-γ^ 或IL-4^ 细胞的FACS分析。结果：与对照组相比，各实验组均获得明显的免疫效果。实验组免疫后血清抗体4值均高于相应组别免疫前；肌肉注射组每次免疫后抗体水平较前次明显升高。实验组小鼠注射VLP抗原的左后足垫局部有红肿硬结，镜下观察可见大量单核细胞侵润。肌肉接种组的DTH反应强度、脾细胞增碹刺激指数(SI)和CD8^ IFN-γ^ 细胞数均高于鼻内滴注组；而鼻内滴注组CD4^ IL-4^ 细胞数高于单纯质粒肌肉接种组；加入pLXHDmB7-2的联合免疫组各项指标均高于单纯质粒组。结论-证实了重组pVAX1-HPV18L1/E6、E7嵌和基因DNA疫苗能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫效应：同时，证实B7-2分子能显著提高该质粒在小鼠体内的免疫反应效果.     

口服幽门螺杆菌疫苗后小鼠粘膜免疫应答研究

为观测幽门螺杆菌 (Hp )全菌抗原和粘膜佐剂LT口服免疫Balb/c小鼠后的粘膜免疫应答 ,采用ELISPOT和ELISA法分析免疫小鼠胃粘膜、派伊尔小结 (PP )抗原特异性抗体分泌细胞和小肠粘液唾液sIgA抗体。结果表明抗原免疫组、抗原 +佐剂组胃粘膜、PP抗原特异性sIgA ASC、IgG ASC数量明显增加 ,尤以sIgA ASC为甚 ,并且抗原 +佐剂组明显高于单纯抗原组和对照组 ;小肠粘液唾液特异sIgA水平两免疫组均明显高于对照组 ,提示口服免疫可有效诱导粘膜免疫应答 ,局部特异sIgA在抗Hp感染中具有重要作用     

免疫途径及载体对乙肝病毒DNA疫苗免疫效果影响的研究

目的探讨ＤＮＡ载体结构及接种途径对ＤＮＡ疫苗免疫效果的影响。方法分别构建插入ＨＢＶ表面抗原编码基因的表达载体ｐｃＤＮＡ１．１／ＳＡ（无抗性基因）和ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ／ＳＡ（含氨苄青霉素抗性基因）,肌注小鼠后比较其诱生特异性免疫应答的能力;同时比较不同接种途径（肌内、皮内、皮肤划痕）及ＣｐＧ免疫刺激元件（ＩＳＳ）对ＤＮＡ疫苗诱生免疫效果的影响。结果ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ／ＳＡ的免疫效果优于ｐｃＤＮＡ１．１／ＳＡ。ｐｃＤＮＡ１．１／ＳＡ的免疫效果可被ＩＳＳ增强,而ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ／ＳＡ诱生特异性免疫应答的能力则可被ＩＳＳ抑制;诱生免疫应答的能力以肌内注射最强,皮内注射免疫其次,皮下划痕法较弱。结论不同ＨＢｓＡｇ表达载体诱生免疫应答的能力不尽相同;ＣｐＧ免疫刺激元件在决定ＤＮＡ疫苗免疫原性中起重要作用,可增强不含相应结构ＤＮＡ疫苗的免疫效果;皮内注射可诱发与肌内接种相似的免疫应答,是一种简便、有效的免疫接种途径     

HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫的研究

目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)6b结构蛋白L1和沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)多表位嵌合DNA(HPV6b L1/Ct MOMP)诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫效应,及HPV6b L1对Ct MOMP多表位基因诱导细胞免疫的增强作用.方法 将Ct MOMP多表位基因连接在经真核密码子优化的HPV6b L1羧基端,构建嵌合重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位,经酶切和测序证实后,转染COS-7细胞,间接免疫荧光鉴定其在真核细胞中的表达;将纯化后的嵌合重组质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,并设置pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒、pcD-NA3.1(+)和PBS三组对照.采用0、2、4周免疫程序,DNA剂量为每只150μg/次.于末次免疫后2周,分别用乳酸脱氢酶(LDH)释放法和细胞内细胞因子染色-流式细胞术(ICS-FAGS)检测小鼠脾细胞对Ct MOMP多表位蛋白和HPV6b L1蛋白的特异性CTL活性,胞内细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10产生水平等细胞免疫应答指标.结果免疫后,在效靶比(E∶T)分别为40∶1、20∶1时,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合重组质粒免疫组小鼠产生了针对Ct MOMP多表位蛋白特异性CTL杀伤活性(44.56%±4.02%,35.35%±2.89%)和HPV6b L1蛋白特异性CTL杀伤活性(27.08%±2.04%,21.68%±4.06%),与各对照组比较差异有统计学意义(F=72.87,F=114.55,P＜0.05;F=30.04,F=10.47,P＜0.05),且显著高于pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒组(35.50%±2.68%,30.24%±1.75%;12.27%±3.36%,9.32%±3.07%;P＜0.05);而pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒组小鼠仅显示了Ct MOMP多表位特异性的CTL杀伤活性,与对照组比较差异也有统计学意义(F=58.85,F=120.21;P＜0.05).胞内细胞因子IFN-γ的产生水平,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合质粒组(4.34%±0.06%)高于pcDNA3.1(+)/Ct MOMP多表位质粒组(3.14%±0.18%),与对照组比较差异有统计学意义(F=473.83,P＜0.05),而重组质粒组较空载体组和PBS对照组差异也有统计学意义(F=211.72,P＜0.05);但IL-4和IL-10水平则各组间差异无统计学意义(F=0.97,P＞0.05;F=2.25,P＞0.05).结论 pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA质粒可诱导BALB/c小鼠同时产生针对HPV6b L1蛋白和Ct MOMP多表位蛋白特异性的细胞免疫效应;真核密码子优化的HPV6b L1能显著增强Ct MOMP 多表位基因诱导的小鼠特异性细胞免疫效应.     

壳聚糖介导增强幽门螺杆菌Lpp20 DNA疫苗黏膜免疫效果的研究

目的 探讨壳聚糖包裹DNA疫苗黏膜免疫效果.方法 采用复凝聚法制备载幽门螺杆菌脂蛋白 Lpp20基因的壳聚糖(CS)纳米粒(NPs),并对CS/DNA纳米粒的特质进行研究;用载基因壳聚糖纳米粒黏膜免疫(滴鼻和口服)小鼠,检测免疫小鼠的细胞和体液免疫水平.结果 裸质粒pcDNA3.1(+)/Lpp20与CS/DNA NPs通过黏膜免疫均能诱导小鼠产生有效的免疫应答.CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组诱导的抗体明显升高,与裸质粒组相比有明显差异(P＜0.05),同时CS/DNANPs滴鼻和口服免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数及培养上清中IFN-γ和IL-4含量明显高于裸质粒组、壳聚糖组和PBS组,且滴鼻免疫组高于口服组.结论 壳聚糖纳米粒能增强pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗的黏膜免疫(滴鼻和口服免疫)效果;载Lpp20基因壳聚糖纳米粒滴鼻免疫比口服免疫能诱导更强的细胞和体液免疫应答.

Abstract：

Objective To investigate the immune response of mucosal immunization of new chitosan(CS) nanoparticles coating DNA vaccine. Methods The chitosan nanoparticles containing plasmid DNA encoding H. pylori lipoprotein Lpp20 gene were prepared using a complex coacervation method and then its speciality were analyzed. We then administered the naked plasmid DNA and chitosan-DNA nanoparticles to 6-week-old female BALB/c mice by intranasal or oral mucosal routes to observe the humoral and cellular immune responses. Results Naked plasmid pcDNA3.1 ( + )/Lpp20 and chitosan-pcDNA3. 1 ( + )/Lpp20 nanoparticles both induced effective immune response in mice through mucosal vaccination. Specific IgG and sIgA antibodies of chitosan-pcDNA3. 1 ( + )/Lpp20 nanoparticles groups were higher than that of naked pcDNA3.1 ( + )/Lpp20 group. The concentration of cytokines IFN-γ and IL-4 in cultural supernatant of T lymphocytes from chitosan-pcDNA3. 1 ( + )/Lpp20 nanoparticles immunized mice increased greatly than that of control groups. After stimulated by corresponding antigen, the stimulation index of intranasal or oral delivery of chitosan-pcDNA3. 1 ( + )/Lpp20 nanoparticles group was significantly higher than that of pcDNA3.1( + )/Lpp20 group, CS group and PBS control group. Moreover, systemic and mucosal immune responses in mice induced by intranasal immunization were stronger than that of oral immunization. Conclusion Chitosan nanoparticles enhanced the immune response of pcDNA3.1 ( + )/Lpp20 DNA vaccine by intranasal or oral administration in BALB/c mice. Compared to oral administration, intranasal delivery of chitosan-pcDNA3.1 ( + )/Lpp20 DNA nanoparticles could induce stronger cellular and humoral immune responses in BALB/c mice.     

B 群脑膜炎球菌外膜蛋白0315 不同形式疫苗免疫效果比较

目的:初步探讨和评价NMB0315 核酸疫苗、重组蛋白疫苗及核酸疫苗+重组蛋白疫苗联合免疫诱导小鼠产生的特异性体液/ 细胞免疫应答水平及其免疫保护效果,为进一步探索NMB0315 疫苗有效的免疫方法和途径提供实验依据。方法:大量制备核酸疫苗[pcDNA3.1(+) / NMB0315]和重组蛋白疫苗(pET-30a/ NMB0315),采用核酸初免-蛋白加强的方法联合免疫或分别免疫雌性BALB/ c 小鼠,测定特异性体液/ 细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效价,观察疫苗对感染B 群脑膜炎球菌小鼠的免疫保护效果。结果:NMB0315 核酸疫苗组(pNMB0315-CpG)、蛋白疫苗组(rNMB0315-FA)及联合免疫疫苗组(pNMB0315-CpG+rNMB0315-FA)诱导的血清特异性IgG、IgG1、IgG2a 及生殖道灌洗液中特异性sIgA 水平在第八周达到峰值,A450 值分别为(0.505±0.042、0.513±0.022、0.342±0.017、0.250±0.015)、(0.823±0.061、0.807±0.045、0.596±0.027、0.450±0.028)和(0.694±0.053、0.711±0.032、0.455±0.021、0.386±0.024),明显高于PBS 对照组(P<0.01);其中,蛋白疫苗组的抗体水平明显高于联合免疫疫苗组和核酸疫苗组(P<0.05)。小鼠脾淋巴细胞刺激指数及IFN-γ酌水平,联合免疫疫苗组明显高于蛋白疫苗组和核酸疫苗组(P<0.05);核酸疫苗组、蛋白疫苗组和联合免疫疫苗组免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价分别为1 :64、1 :128 和1 ：128,对实验小鼠的免疫保护率分别为70%、95%和80%。免疫2、4、6、8 周时,核酸疫苗组、重组蛋白疫苗组和联合免疫疫苗组IgG2a/ IgG1 比值均小于1。结论:NMB0315 疫苗诱导的体液免疫(包括黏膜免疫)效果从高到低为:重组蛋白疫苗组、联合免疫疫苗组、核酸疫苗组;诱导细胞免疫的效果从高到低为:联合免疫疫苗组、核酸疫苗组、重组蛋白疫苗组; NMB0315 疫苗对实验小鼠的免疫保护效果从高到低为:重组蛋白疫苗组、联合免疫疫苗组、核酸疫苗组。     

HSV-1 VP22和hIL-18增强HBV DNA微球疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

为了研究HSV-1VP22和hIL-18作为分子佐剂对HBVDNA微球疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响,HSV病毒经Vero细胞培养增殖后,提取病毒DNA,PCR扩增VP22编码基因。从人PBMC中提取总RNA,RT-PCR扩增hIL-18。VP22、hIL-18按不同需要插入pcDNA3.1-S,构建成3种质粒:pcDNA3.1-VP22-S、pcDNA3.1-S-IL-18、pcDNA3.1-VP22-S-IL-18。制备DNA壳聚糖微球疫苗,鼻腔免疫小鼠,同时裸质粒DNA肌注小鼠,ELISA检测小鼠血清IgG、粪便sIgA水平。结果,与pcDNA3.1-S相比,pcDNA3.1-VP22-S、pcDNA3.1-S-IL-18、pcDNA3.1-VP22-S-IL-18均能引起小鼠血清IgG、粪便sIgA水平升高。在鼻腔免疫实验中,pcDNA3.1-VP22-S、pcDNA3.1-S-IL-18、pcDNA3.1-VP22-S-IL-18免疫组的血清IgG水平均在第8周达到最高,并且与pcDNA3.1-S相比,抗体水平有差异(P<0.05)。研究结果表明,VP22和hIL-18能够增强乙肝DNA疫苗的体液免疫应答;制备的DNA微球疫苗经鼻腔免疫后,能够诱导黏膜免疫应答。