人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础。方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染HEK293T细胞包装病毒。荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达。结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400bp插入片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×108pfu/mL;重组病毒感染后,HEK293T细胞中IL-16 mRNA和蛋白质均有表达。结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础。     

大鼠白细胞介素-6重组腺病毒构建及初步鉴定

目的构建携带大鼠白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)基因的重组腺病毒,为研究IL-6在神经损伤中的生物学作用提供技术手段。方法体外扩增大鼠IL-6基因,定向克隆到pAdTrace-TOX腺病毒穿梭质粒中,构建重组pAdTrace-IL-6过表达腺病毒质粒,并与骨架质粒pAd-Easy-1在BJ5183菌中发生同源重组,获得pAd-IL-6腺病毒载体,经PacⅠ酶切后转染HEK293细胞进行包装扩增。通过Ad-IL-6腺病毒感染PC12细胞,Real-time PCR和Western blot检测PC12细胞中IL-6及STAT3的表达。结果 PCR电泳及酶切、测序鉴定均证实目的基因IL-6正确克隆至腺病毒载体中,所构建的腺病毒Ad-IL-6可感染PC12细胞,有效增加IL-6的表达水平,促进IL-6信号通路中关键蛋白磷酸化STAT3的表达。结论成功构建携带IL-6的重组腺病毒载体,该载体可显著增高PC12细胞中IL-6基因和蛋白表达水平,并上调IL-6相关信号通路。     

人重组腺病毒rAd-IL-23R的构建与功能鉴定

目的构建表达白介素23受体的人重组腺病毒(rAd-IL-23R),并探究该病毒对人子宫颈癌(HeLa)细胞系增殖的影响。方法采用AdEasyTM系统,将带有IL-23R的穿梭载体与腺病毒骨架载体进行同源重组,构建pAd-IL-23R,酶切消化鉴定,线性化的病毒质粒在HEK-293A细胞中进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。CCK-8法检测rAd-IL-23R对HeLa细胞增殖的影响,流式细胞计量术分析和Western blot检测rAd-IL-23R对HeLa细胞凋亡的影响。结果pAd-IL-23R经PacⅠ酶切消化为约30 kb和3 kb的核酸片段,可诱导HEK-293A细胞产生细胞病变,并成功表达IL-23R蛋白;用不同滴度的rAd-IL-23R(0、1和2 MOI)感染HeLa细胞后,rAd-IL-23R对细胞增殖的抑制具有明显的剂量效应(P<0.05),随着MOI增加,细胞凋亡率显著增加(P<0.05),同时cleaved-caspase 3的蛋白表达水平增高。结论成功构建rAd-IL-23R,该重组腺病毒可抑制HeLa细胞增殖并促进凋亡发生。     

表达轮状病毒VP7基因重组腺病毒载体的构建及免疫活性研究

目的 包装表达轮状病毒VP7基因的重组腺病毒,并检测其免疫活性.方法 RT-PCR扩增病毒结构蛋白VP7基因,定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV中,在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,并用RT-PCR和Western blot检测.将包装好的腺病毒免疫小鼠,应用间接ELISA检测小鼠血清中特异性轮状病毒IgG抗体.结果 酶切和测序鉴定证实成功构建携带VP7基因的重组腺病毒表达载体,并在293细胞中成功包装病毒;RT-PCR和Western blot 均能特异检测VP7基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后可诱导针对轮状病毒的特异性免疫.结论 重组腺病毒的成功包装,为新型轮状病毒基因疫苗的研制提供了一种可行的途径.     

草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:探索制备免疫不育疫苗的新途径,获得草原兔尾鼠卵透明带3(LZP3)重组腺病毒减毒活疫苗。方法:将LZP3基因亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带LZP3基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装成病毒颗粒。PCR鉴定重组腺病毒,继而用鉴定正确的重组腺病毒感染HeLa细胞,并以RT-PCR、Western blot检测LZP3的转录和表达。结果:成功构建了携带LZP3基因的重组腺病毒pAd-LZP3载体,其转染293细胞后包装出重组病毒,PCR证实LZP3基因已整合至腺病毒基因组中,病毒的滴度可达1.2×1010pfu/L。RT-PCR和Western blot检测表明RAd-LZP3感染的HeLa细胞中LZP3基因能够有效转录和表达。结论:制备的RAd-LZP3可成功表达LZP3基因,为后续开展RAd-LZP3免疫动物的研究奠定了基础。     

小鼠GITRL基因腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建重组腺病毒pAdEasy-GFP-GITRL,并测定病毒滴度。方法:从PIRES-GITRL载体上用BglⅡ和SalⅠ双酶切,回收目的基因GITRL,插入同样用BglⅡ和SalⅠ双酶切的穿梭质粒pAdtrack-CMV中,将线性化穿梭质粒骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183菌,鉴定正确后,将重组腺病毒载体pAdEasy-GFP-GITRL转染HEK293细胞,以包装出完整腺病毒。TCID50法测定重组腺病毒滴度,Western blot法检测GITRL蛋白表达。结果:成功构建小鼠GITRL基因的重组腺病毒载体(pAdEasy-GFP-GITRL),经包装后获得高滴度表达GITRL基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.0×109pfu/mL。Western blot结果显示重组病毒载体能表达GITRL蛋白。结论:重组腺病毒表达载体(pAdEasy-GFP-GITRL)的成功构建及重组腺病毒的获得为GITRL基因干预治疗奠定了基础。     

分泌型重组mPSMA腺病毒的构建及表达

目的 构建分泌型重组小鼠前列腺特异膜抗原腺病毒(Ad-mPSMA),并检测其免疫效果。方法 利用AdEasy重组腺病毒载体系统,通过PCR扩增小鼠PSMA全长序列,并在基因的5′端加上人IL-2的信号肽序列,亚克隆至pAdenoVator CMV5穿梭质粒,与pAdenoVator ΔE1/E3进行同源重组获得pAd-mPSMA重组质粒,经HEK293细胞包装扩增获得重组病毒颗粒。通过RT-PCR及Western blot检测小鼠PSMA基因在HeLa细胞中的转录及表达。以该重组腺病毒免疫小鼠,对mPSMA的特异性抗体进行检测。结果 成功将mPSMA基因克隆至pAdenoVator ΔE1/E3载体上,病毒滴度为1.32×1011IU/ml,RT-PCR证实mPSMA的转录,Western blot证实mPSMA的分泌表达,并在小鼠血清中检测到mPSMA的特异性抗体。结论 成功构建分泌型重组mPSMA腺病毒,为前列腺癌特别是激素难治性前列腺癌的预防和治疗提供了更广阔的前景。     

靶向人白细胞源性精氨酸氨肽酶基因shRNA重组腺病毒的构建

目的:构建靶向人白细胞源性精氨酸氨肽酶(LRAP)基因的shRNA重组腺病毒,有效抑制LRAP基因在人视网膜血管内皮细胞中的表达。方法:设计并合成3对靶向人LRAP基因shRNA的单链寡核苷酸,退火后克隆至腺病毒穿梭载体pRNAT-H1.1/Adeno得到3个重组穿梭质粒。将重组穿梭质粒和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183-AD-1中进行同源重组形成腺病毒表达质粒,并在293a细胞中包装形成重组腺病毒颗粒。重组腺病毒经扩增和滴度测定后感染原代培养的人视网膜血管内皮细胞,应用荧光实时定量PCR测定LRAP mRNA的相对表达量,筛选得到沉默效率最高的LRAP shRNA重组腺病毒,并应用Western blot法验证经RNA干扰后视网膜血管内皮细胞中LRAP的蛋白表达水平。结果:PCR、酶切和DNA测序证实LRAP shR-NA重组穿梭质粒和表达质粒的插入序列正确。收获病毒后的PCR证实重组腺病毒颗粒包装成功。实时荧光定量PCR筛选得到具有最大沉默效率的重组腺病毒,其沉默效率达到约79%。Western blot法证实经RNA干扰后,人视网膜血管内皮细胞中的LRAP蛋白水平显著降低。结论:成功构建了靶向人LRAP基因的shRNA重组腺病毒,可有效抑制人视网膜血管内皮细胞中LRAP基因的表达。     

雄激素受体基因慢病毒干扰载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的：构建敲减人雄激素受体（AR）基因的慢病毒质粒,转染Hep3B细胞使其表达目的蛋白并探索其对PTEN、p-AKT蛋白表达的影响。方法：设计合成3对针对AR基因特异性敲减的寡核苷酸片段,分别连接于重组慢病毒载体pLKO.1,构建3条AR干扰载体。利用验证正确的3个慢病毒载体转染293T细胞得到慢病毒上清液。采用RT-PCR和Western blot在5株肝癌细胞中挑选AR高表达的细胞系进行AR慢病毒上清液感染。RT-PCR和Western blot检测3条AR干扰质粒在Hep3B细胞内的表达及其对PTEN、p-AKT蛋白表达的作用。结果：测序鉴定证实3条AR慢病毒干扰载体构建成功,干扰Hep3B细胞后,RT-PCR和Western blot结果显示其中1条AR干扰后的mRNA和蛋白表达明显降低,细胞内PTEN蛋白表达升高,p-AKT表达降低。结论：成功构建3条AR干扰载体,其中1条干扰效率较高,能在Hep3B细胞中干扰AR的表达,感染细胞后上调抑癌基因PTEN的蛋白表达对p-AKT有抑制作用,提示AR和PTEN/AKT信号通路可能具有相关性。     

大鼠Toll样受体2基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建特异性抑制大鼠TLR2基因的重组腺病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中进行功能鉴定。方法:体外合成3对大鼠siTLR2的双链DNA序列,经退火定向克隆到穿梭质粒pSES-HUS中获得pSES-HUS-siTLR2质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siTLR2质粒,脂质体转染HEK293细胞,包装获得Ad-siTLR2腺病毒颗粒,继而感染PC12细胞,通过Real-time PCR和Western blot方法检测3对siRNA对TLR2基因的抑制效率。结果:PCR凝胶电泳和测序结果均证实目的基因正确克隆到腺病毒载体中;Real-time PCR和Western blot结果显示:携带siTLR2的病毒颗粒能够在mRNA和蛋白水平有效抑制PC12细胞中TLR2的表达。结论:成功构建了Ad-siTLR2重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染PC12细胞后能有效抑制TLR2基因的表达,为进一步研究TLR2在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。     

小鼠p38MAPK重组腺病毒载体的构建及其在成骨细胞系中的表达

目的:利用AdEasyTM system构建携带小鼠p38MAPK基因的重组腺病毒,感染成骨细胞系MC3T3-E1,检测外源p38MAPK在细胞中的表达。方法:用PCR的方法扩增p38MAPK基因,将其克隆到pMD18-T载体中,进行测序。经BglⅡ和HindⅢ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-CMV-p38MAPK。将经PmeI线性化的pShuttle-CMV穿梭载体与pAdEasyTMDNA电穿孔共转化BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒Ad-p38MAPK,再将经PacI线性化的Ad-p38MAPK重组病毒骨架质粒转染AD293包装细胞,包装并扩增病毒。用Ad-p38MAPK感染小鼠MC3T3-E1成骨样细胞,以Western blot法检测p38MAPK在小鼠成骨细胞中的表达。结果:构建并包装表达p38MAPK蛋白的重组腺病毒,该重组腺病毒在体外能有效感染小鼠成骨细胞系MC3T3-E1并高表达p38MAPK蛋白。结论:成功地构建了携带小鼠p38MAPK基因的重组腺病毒,为研究p38MAPK在成骨细胞中的作用奠定了实验基础。     

丙型肝炎病毒核心基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

目的构建HCV C基因重组腺病毒，以期用于HCV C蛋白的功能研究。方法以含有丙肝病毒1b亚型核心基因的质粒pcDNA3.1／HCV-C为模板，PCR扩增HCV C基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组，获得重组腺病毒质粒pAd-C，PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得重组腺病毒Ad-C，继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测HCV C蛋白的表达。结果PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒Ad-C构建成功。结论成功构建了重组腺病毒Ad-C，为进一步研究核心蛋白的生物学功能奠定了基础。     

表达呼吸道合胞病毒F蛋白编码基因的重组腺病毒载体的构建

目的 构建表达呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白编码基因片段的重组腺病毒.方法 以RSV RNA为模板,利用RT-PCR扩增出F基因片段,应用AdEasy腺病毒载体系统,构建含有目的 基因的蕈组穿梭质粒pShuttle-CMV/F,再转化含有骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183-AD-1获得重组腺病毒质粒pAdEasy/F.将该质粒转染293细胞包装产生出重组腺病毒rAd/F.重组腺病毒分别经电子显微镜技术、RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光方法进行鉴定.并对该重组腺病毒的滴度和遗传稳定性进行了初步研究.结果 获得了含有RSV F基因片段的重组腺病毒rAd/F,电子显微镜下可见典型腺病毒颗粒形态,RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光方法分析显示rAd/F中的F基因片段可以在293细胞中有效转录和表达.结论 成功构建出含有RSV F基因片段的苇组腺病毒rAd/F,为进一步研究重组腺病毒载体疫苗奠定了基础.     

重组腺病毒Ad-IL-12感染淋巴细胞对人卵巢癌细胞SKOV3增殖和凋亡的影响

目的 探讨重组腺病毒Ad-IL-12感染人外周血淋巴细胞后对人卵巢癌细胞SKOV3周期、增殖和凋亡的影响.方法 采用重组人IL-12腺病毒(Ad-IL-12)感染人外周血淋巴细胞,感染48 h后与人卵巢癌细胞SKOV3共培养(SKOV3/Ad-IL-12),同时设未感染组(SKOV3)和Ad-GFP空载感染组(SKOV3/Ad-GFP)作为对照.RT-PCR检测IL-12双亚基P35和P40的mRNA表达,ELISA检测细胞培养上清中IL-12 P70蛋白的分泌,CCK8法检测卵巢癌细胞增殖,流式细胞术分析卵巢癌细胞周期和凋亡,RT-PCR和Western blot检测抗凋亡蛋白BCL-2、survivin 的表达.结果 重组腺病毒Ad-IL-12可成功感染人外周血淋巴细胞,分泌较高水平的IL-12 P70蛋白;淋巴细胞过表达IL-12可抑制SKOV3细胞的增殖;与未感染组和空载组相比,SKOV3/Ad-IL-12组G1期细胞显著增加,凋亡率显著升高(P＜0.05),SKOV3细胞中抗凋亡蛋白BCL-2和survivin显著下调(P＜0.05).结论 人IL-12基因重组腺病毒可以成功感染人外周血淋巴细胞,分泌IL-12 P70蛋白,并可以通过阻滞细胞周期进程和促进细胞凋亡抑制人卵巢癌细胞SKOV3的增殖.     

B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株HA基因重组3型腺病毒的构建

目的:构建包含有B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株血凝素(HA)基因的重组3型腺病毒.方法:用PCR方法扩增得到HA基因, 酶切后克隆至3型腺病毒穿梭质粒pSK-CMV, 构建重组穿梭质粒pSK-CMV-HA, 然后在大肠杆菌BJ5183内进行经 Not I和 Eco R V线性化的pSK-CMV-HA和经 Rsr Ⅱ线性化的骨架质粒pBRAdV3△E3的同源重组, AsiS I酶切线性化重组腺病毒质粒pBRAdV3△E3-HA后脂质体法转染HEp-2细胞, 进行病毒包装和增殖后得到重组腺病毒rAdV3△E3-HA, 并且通过病变观察、扫描电镜、 RT-PCR、免疫细胞化学方法对基因组的包装和HA基因的表达进行检测.结果:将HA基因克隆入pSK-CMV获得重组穿梭质粒pSK-CMV-HA, 线性化的pSK-CMV-HA与pBRAdV3△E3同源重组后获得pBRAdV3△E3-HA, 线性化的pBRAdV3△E3-HA转染HEp-2细胞观察到细胞病变和HA基因的表达.结论:成功构建了带有HA基因的重组腺病毒rAdV3△E3-HA, 为B型流感病毒-3型腺病毒二联活苗的研究提供了依据.     

人EPO基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:制备表达人促红细胞生成素基因(hEPO)的重组腺病毒。方法:将hEPO基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带hEPO基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒,氯化铯梯度离心法进行纯化,PCR和电镜负染鉴定重组腺病毒,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的重组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率,以Western blot检测hEPO蛋白的表达。结果:成功构建了携带hEPO基因的重组腺病毒载体pAd-hEPO,PCR、透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度可达1.8×1010pfu/mL。Western blot检测表明RAd-hEPO感染的HeLa细胞中hEPO基因能够有效表达。结论:制备的RAd-hEPO可成功表达hEPO基因,为后续开展RAd-hEPO治疗缺血性心脏病的研究奠定基础。     

重组大鼠脑源性神经营养因子腺病毒的构建及体外表达分析

目的构建含有大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因的重组腺病毒(AD)载体,并分析其体外表达情况。方法将采用RT-PCR技术获取的大鼠BDNF的cDNA基因定向克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV中。通过与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在细菌内同源重组形成重组腺病毒质粒pAd-BDNF,转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Ad-BDNF)。重组病毒感染体外培养的Hela细胞后,用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学检测细胞BDNF基因及蛋白表达情况。结果 pAd-BDNF测序结果和预期一致,同源重组并经293细胞包装后形成重组腺病毒Ad-BDNF,重组病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF。结论成功制备了重组腺病毒Ad-BDNF,感染细胞证实其呈分泌表达,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病治疗的研究打下了基础。     

靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的 观察靶向性反向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(r-caspase-3)重组腺病毒体外诱导肝癌细胞凋亡的效果和特异性.方法 构建甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白(ALB)启动子腺病毒载体(pAdTrack-EAFP-PALB),亚克隆r-caspase-3至载体pAdTrack-EAFP-PALP,Pme Ⅰ线性化pAdTrack-EAFP-PALB/r-caspase-3,电转化至BJ/AdEasy菌,获得重组腺病毒骨架pAdeasy-EAFP-PALB/r-caspase-3.Pac Ⅰ酶切后脂质体转染AD293细胞进行包装、扩增、获得病毒.绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度和感染效率;RT-PCR和Western印迹法检测r-caspase-3在HepG2细胞中的表达;流式细胞术检测其特异性诱导肝癌细胞凋亡的作用.结果 穿梭载体pAdTrack-EAFP-PALB/r-caspase-3酶切、测序正确.穿梭载体、pAdeasy-1载体同源重组后PCR及Pac Ⅰ酶切鉴定结果表明pAdeasy-EAFP-PALB/r-caspase-3重组成功.转染AD293细胞后可观察到GFP的表达.病毒感染HepG2细胞总DNA经RT-PCR和Western印迹均可检测到目的 基因的表达,证实Ad-EAFP-PALB/r-caspase-3病毒颗粒包装成功;靶向性r-caspase-3重组腺病毒感染各组细胞24 h后,各组凋亡指数分别为:HepG细胞48.2%、7721细胞17.7%、L-02细胞7.3%、MDA-MB-231细胞0%.结论 成功构建了靶向性Ad-EAFP-PALB/r-caspase-3重组腺病毒,体外实验表明其具有凋亡诱导靶向性,为进一步研究靶向性r-caspase-3基因治疗肝细胞肝癌及其生物学功能提供了依据.     

携带人MAGE-1基因重组腺病毒的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建人黑色素瘤相关抗原-1(MAGE-1)基因的腺病毒,并研究其感染肝癌细胞系HepG2细胞的效率.方法 采用基因克隆技术,将人MAGE-1基因克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-IRES-hrGFP中,构建pShuttle-MAGE-1-IRES-hrGFP质粒,利用细菌BJ5183将穿梭质粒与pAdEasy-1进行重组,获得重组的腺病毒质粒.线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增.采用CsCl密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化.获得的腺病毒感染肝癌细胞HepG2,观察其感染效率和MAGE-1表达水平.结果 通过酶切鉴定证明腺病毒载体构建成功,包装出携带人MAGE-1基因的腺病毒,滴度达2.1×1010pfu/mL,获得的腺病毒对HepG2细胞的感染效率高于98%以上.结论 成功地利用细菌内同源重组方法构建了携带人MAGE-1基因的腺病毒,并能够在肝癌细胞中高效地表达,为利用MAGE-1进行免疫治疗提供了材料.     

趋化因子受体4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：目前研究发现,基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。 目的：构建小鼠趋化因子受体4基因重组腺病毒载体。 方法：从C57BL/6小鼠中提取总RNA,以RT-PCR方法获得小鼠趋化因子受体4基因全长1 080 bp的完整编码序列,通过穿梭质粒pAdTrack-CMV,将目的片段克隆入AdEasy-1腺病毒DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转染293细胞,经包装扩增后,获得重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4,并感染293细胞,PCR鉴定、Western blot检测蛋白表达。 结果与结论：含趋化因子受体4基因的重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4构建成功,经PCR鉴定鉴定重组病毒中含有趋化因子受体4cDNA全长,经序列测定表明趋化因子受体4cDNA序列正确无丢失和错配现象,病毒滴度高,Western blot检测感染后293细胞趋化因子受体4的蛋白表达较未感染293细胞明显增加。