支架蛋白活化蛋白激酶C受体1在胃癌细胞中的表达及其与胃癌细胞增殖的关系

目的 探讨活化蛋白激酶C受体1C(RACK1, GNB2L1)在胃癌细胞HGC27中的表达及过表达RACK1对HGC27生长增殖的影响。方法 体外培养胃癌未分化细胞HGC27和正常胃黏膜上皮细胞系GES-1,收集细胞48 h后,提取mRNA和蛋白,利用RT-PCR检测RACK1 mRNA在HGC27和GES-1细胞中的表达;利用Western blotting法检测RACK1蛋白在两种细胞中的表达;以人胚肾HEK293细胞cDNA为模板,构建pcDNA3.1A-flag-RACK1重组质粒,利用Lipo2000转染入HGC27细胞中,Western blotting法检测质粒的转染效率,MTT法检测过表达RACK1对HGC27胃癌细胞系生长增殖的影响。 结果 HGC27胃癌细胞中RACK1的mRNA和蛋白水平表达低于GES-1细胞（P<0.01）。双酶切鉴定和测序分析表明,pcDNA3.1A-flag-RACK1重组质粒构建成功。将该质粒转入HGC27细胞后,与未转染组相比,空载转染组RACK1蛋白表达无明显区别（P>0.05）,pcDNA3.1-RACK1转染组RACK1蛋白表达明显升高（P<0.01）;转染pcDNA3.1A-flag-RACK1转染组细胞存活率在72 h和96 h明显少于pcDNA3.1空载对照组（P<0.01）。结论 支架蛋白RACK1的mRNA和蛋白水平在HGC27细胞中低表达,上调RACK1的表达可明显抑制HGC27细胞增殖。     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

摘要 背景：人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。 目的：构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。 方法：以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其 C端 936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。 结果与结论：经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。 关键词：人端粒酶反转录酶C端;重组质粒;人胚肾细胞293T;蛋白表达;免疫印迹 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.11.018     

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2.方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR -XL-TOPO 载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达.结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确.重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录.重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达.Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础.     

大鼠GLUT1真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的：构建大鼠葡萄糖转运体1（GLUT1）的真核表达载体。 方法： 以RT-PCR方法从大鼠脑组织中获取GLUT1全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1，随后用lipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组化的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。 结果： 以构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体1的表达。 结论： 成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Glut1，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因，为进一步研究外源性GLUT1表达对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定了基础。     

SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定

目的 克隆沉默信息调节因子1（SIRTl）基因的全长cDNA,构建含有SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的重组真核表达载体,为进一步研究SIRT1基因功能奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,扩增产物通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到pcDNA3.1 （＋）-SIRT1重组质粒;同时采用定点突变法构建其突变体pcDNA3.1 （＋）-T200I和pcDNA3.1（＋）-E420K表达载体.重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组成功的真核表达载体.结果 成功克隆了SIRT1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1 （＋）-SIRT1及其突变体的真核表达载体;阳性重组质粒酶切后经测序比对鉴定,与预期序列完全相符,转染293T细胞后可以表达带有HIS标签的SIRT1蛋白.结论 此方法可成功构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-SIRT1及其突变体pcDNA3.1（＋）-T200I、pcDNA3.1（＋）-E420K真核表达载体,为SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的生物学功能研究提供了基因材料.     

过表达泛素偶联酶E2C对293T细胞增殖的影响

目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用Western blot技术检测并鉴定UBE2C基因在293T细胞中的表达情况;用MTT法检测UBE2C对293T细胞增殖的影响。结果:Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的UBE2C蛋白表达水平明显高于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。MTT法检测结果显示转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的增殖速度明显快于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。结论:成功建立稳定过表达UBE2C的293T细胞株,过表达UBE2C可促进293T细胞的增殖。     

小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建含有小鼠Fas Ligand(FasL)基因的重组真核表达载体,并检测FasL蛋白在其稳定转染的HEK293细胞中的表达情况,为构建表达小鼠Fas L的树突状细胞(DC)模型,深入研究DC联合T细胞防治移植物抗宿主病(GVHD)的新方法奠定基础。方法从小鼠脾脏中提取RNA并逆转录为cDNA,以该cDNA为模板扩增FasL基因,插入pcDNA3.1(+)载体中构建pcDNA3.1(+)-FasL重组质粒,利用脂质体将其转染HEK293细胞,用G418筛选稳定表达细胞系,Western blot确定重组蛋白的表达。结果通过酶切及测序证实FasL序列正确插入表达载体pcDNA3.1(+),Western blot检测证实转染重组质粒的细胞能正确表达FasL蛋白,G418筛选后能够得到稳定表达FasL的抗性细胞株即FasL-HEK293。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-FasL和稳定表达FasL的HEK 293细胞成功构建,为后续FasL-DC细胞的研究打下了坚实基础。     

野生型和突变型PS1-EGFP真核共表达载体的构建与鉴定

为了构建人野生型和突变型PS1(早老素-1, presenilin-1)-EGPF共表达蛋白的真核表达重组质粒pcDNA3.1 /PS1-EG-FP,本研究应用下述方法:对野生型pcDNA3.1 /PS1(WT)质粒,采用一步法定点突变技术构建pcDNA3.1 /PS1(C407G)突变质粒;合成两对引物,利用PCR技术从pEGFP-C1质粒合成EGFP cDNA片断,在EGFP转录起始密码子ATG之前导入一BamHⅠ酶切位点,利用与pcDNA3.1 /PS1质粒共存的另一EcoRⅠ酶切位点,将合成的EGFP片断通过BamHⅠ和EcoRⅠ两个位点分别克隆入野生型及突变型pcDNA3.1 /PS1质粒的多克隆位点中,从而构建了野生型和突变型PS1与增强绿色荧光蛋白共表达载体。经限制性内切酶双酶切鉴定及DNA测序证实此蛋白共表达载体构建成功。利用此重组质粒瞬时转染SH-SY5Y细胞,72 h后荧光显微镜(激发波长488 nm)观察细胞内有绿色荧光蛋白表达。本研究成功构建了人野生型和突变型PS1-EGFP的真核表达载体,为下一步建立细胞模型,研究突变型PS1的生物学功能以及PS1在AD发病机制中的作用奠定了基础。     

稳定表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原CTLA-4的293T细胞株的建立

目的：构建稳定表达细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4）的293T 细胞株。方法首先从人外周血获取 PBMC 加以 T 细胞活化; PCR 扩增 CTLA-4转录本,连接pUCm-T 质粒引入 HindⅢ和 EcoRⅠ双酶切位点后转入真核细胞表达质粒 pcDNA3．1;重组质粒 pcDNA3．1-CTLA-4经脂质体转染293T 细胞,以抗生素 G418筛选表达 CTLA-4的293T 细胞;定量 PCR、免疫荧光分别检测293T 细胞 CTLA-4表达与细胞定位。结果血样来源 T 细胞经活化后表达 CTLA-4转录本。 HindⅢ和EcoRⅠ双酶切证实重组质粒内 CTLA-4插入序列正确; RT-PCR 及免疫荧光检测证实293T 细胞能够稳定表达目的蛋白 CTLA-4,并定位于细胞膜表面。结论成功构建的 pcDNA3．1-CTLA-4重组真核表达载体,在293T 细胞膜表面实现了稳定表达,为进行相关生物学理论与应用研究打下基础。     

小鼠Lewis肺癌细胞Foxp3的表达对T淋巴细胞增殖的影响及机制

目的:检测小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞中Foxp3基因的表达,研究小鼠LLC细胞中Foxp3过表达对T淋巴细胞的增殖和TGF-β1和IL-10表达的影响,探讨LLC细胞中Foxp3的表达在肿瘤免疫逃逸中的作用及可能机制。方法:分别采用RT-PCR和免疫组化染色法检测LLC细胞中Foxp3的mRNA和蛋白表达。构建pcDNA3.1-Foxp3重组质粒,采用FuGENEHD瞬时转染LLC细胞,实验分3组:LLC组,pcDNA3.1-LLC组及pcDNA3.1-Foxp3-LLC组。RT-PCR和免疫组化方法分别检测转染48小时后Foxp3基因的表达,通过淋巴细胞转化试验检测Foxp3过表达对T淋巴细胞增殖的影响,RT-PCR和ELISA方法分别检测Foxp3过表达对TGF-β1和IL-10的mRNA表达及蛋白分泌的影响。结果:在LLC细胞中检测到Foxp3mRNA及蛋白的表达;瞬时转染48小时后pcDNA3.1-Foxp3-LLC组LLC细胞中Foxp3表达增高,与LLC组和pcDNA3.1-LLC组相比差异显著(P0.01);pcDNA3.1-Foxp3-LLC组LLC细胞及培养上清对T淋巴细胞增殖的抑制率均明显高于LLC组和pcDNA3.1-LLC组(P0.05);pcDNA3.1-Foxp3-LLC组TGF-β1、IL-10mRNA和蛋白的表达水平明显高于LLC组和pcDNA3.1-LLC组(P0.05)。结论:LLC细胞表达Foxp3,Foxp3可能通过上调TGF-β1和IL-10的表达来抑制T淋巴细胞的增殖,进而参与肿瘤的免疫逃逸。     

LMNA突变体HEK293、C2C12模型的构建及其核纤层蛋白A/C亚细胞定位

目的构建A型核纤层蛋白基因(LMNA)野生型、突变体的融合蛋白真核表达载体及LMNA突变体慢病毒载体,研究其在HEK293、C2C12中表达、核纤层蛋白A/C亚细胞定位及细胞核改变。方法将野生型全长LMNA cDNA克隆入pEGFP-N1质粒,构建LMNA野生型质粒pEGFP-N1-LMNA,以野生型质粒为模板构建c.1117A>G定点突变质粒pEGFP-N1-LMNA-I373V。将构建的2种质粒分别转染HEK293、C2C12,用G418筛选转染的C2C12,荧光显微镜下观察细胞核形态及GFP标记的核纤层蛋白A/C亚细胞定位。以pEGFP-N1-LMNA-I373V为模板,构建pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO慢病毒,对慢病毒进行包装与滴度测定。pHBLV-GFP-PURO、pHBLV-LMNA-C1117-3*flag-GFP-PURO分别转染C2C12,免疫荧光染色法观察转染后细胞核形态及核纤层蛋白A/C亚细胞定位的改变。结果构建的pEGFP-N1-LMNA、pEGFP-N1-LMNA-I373V及pHBLV-h-LMNA-I373V-3*flag-GFP-PURO测序与目的基因序列完全一致。pEGFP-N1-LMNA转染的HEK293、C2C12核纤层蛋白A/C均匀表达于核膜下,pEGFP-N1-LMNA-I373V转染的HEK293、C2C12内核纤层蛋白A/C核内异常聚集,呈散点样分布;与HEK293相比,C2C12细胞转染效率明显降低。慢病毒转染C2C12的转染率高,突变体慢病毒转染的细胞核形态异常及核纤层蛋白A/C核内分布异常。结论成功构建2种LMNA突变体真核表达载体及突变体转染的HEK293、C2C12模型,为LMNA突变体导致疾病的机制研究奠定科学基础。     

重组pEGFP-C2-p100-TSN点突变质粒构建及表达

目的 将6个不同的p100-TSN.Mutants基因片段分别定向连入PEGFP-C2质粒中,使P100-TSN突变蛋白能够与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达,从而为进一步研究p100蛋白TSN结构域的功能奠定实验基础. 方法 利用EcoR Ⅰ和XhoⅠ双酶切方法从6个pcDNA3.1 (+) -p100-TSN.Mutants重组质粒中分别获得p100-TSN.Mutants的cDNA片段,将其连入pEGFP-C2质粒载体中,再将成功构建的6个pEGFP-C2-p100-TSN.Mutants质粒分别转染COS7细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 ①将重组质粒进行双酶切鉴定可见p100-TSN.Mutants的cDNA片段;②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论 ① 6个pEGFP-C2-p100-TSN.Mutants重组质粒构建成功;② p100-TSN突变蛋白可与绿色荧光蛋白在COS7细胞中融合表达.     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

丙型肝炎病毒核心蛋白DNA免疫初步研究

目的　观察HCV核心蛋白基因的DNA免疫效果。方法　将HCV核心蛋白基因插入真核表达载体pcDNA3.1( ) ,构建重组质粒pcDNA3.1 c。在证明该重组质粒可在哺乳动物COS7细胞中表达的基础上 ,用重组质粒 10 0 μg免疫小鼠 ,同时设立空白质粒组和PBS组两组对照 ,初次免疫后 4周、8周各进行一次加强免疫。小鼠体液免疫反应和T淋巴细胞增殖检测分别采用间接免疫荧光法和MTT法。结果　pcDNA3.1 c可在COS7细胞内表达HCV核心抗原 ,接种于Balb c小鼠能有效诱导体液和细胞免疫应答。结论　重组质粒pcDNA3.1 c对于丙型肝炎防治具有潜在价值     

问号状赖型钩端螺旋体LAg42膜蛋白基因的克隆及真核表达研究

目的:构建赖型钩端螺旋体lag42基因真核表达载体并转染哺乳动物细胞,为进一步研究奠定基础。方法:分别以问号状赖型钩体017株,56601株及双曲钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建lag42基因与质粒pcDNA3.1A 的重组真核表达质粒,克隆筛选并测序;通过脂质体介导将重组质粒转染入COS7细胞,用RT-PCR检测转染结果。结果:不同毒力赖型钩体均能扩增出约1100 bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pcDNA3.1A -lag42构建成功;经RT-PCR检测证实重组质粒转染成功。结论:赖型钩体具有编码LAg42膜蛋白的基因,构建完成真核表达载体pcD-NA3.1A -lag42,并成功转染COS7细胞。     

结核杆菌热休克蛋白-65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的构建结核杆菌热休克蛋白-65(HSP65)真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达. 方法用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-HSP65转染到A549 细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT-PCR的方法检抗性细胞中HSP65 mRNA的表达 . 结果经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确;RT-PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65 mRNA为阳性. 结论真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功 , 并可在真核细胞A549细胞中稳定表达.     

NDVLaSota株P、NP蛋白基因表达载体的构建及鉴定

目的 构建新城疫病毒LaSota株NP、P基因的真核表达载体,为研究NP、P蛋白机理及反向遗传操作系统奠定基础.方法 利用RT-PCR法扩增出新城疫病毒LaSota株的NP、P基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体中,并再次亚克隆到真核载体pcDNA3.1（＋）上,得到重组质粒pcDNA3.1（＋）-NP、pcDNA3.1（＋）-P,瞬时转染到293、BHK-21 细胞中,免疫酶法及Western Blot法检测表达情况.结果 经免疫酶法及Western Blot法分别检测到了P、NP蛋白在两种细胞的表达.结论 构建的两个重组质粒pcDNA3.1（＋）-NP、pcDNA3.1（＋）-P 在293、BHK-21两种细胞中均可稳定表达,为即将进行的NDV反向遗传操作系统奠定基础.     

登革Ⅰ型病毒E蛋白在293T细胞中的分泌表达

目的 分泌表达登革Ⅰ型病毒prM/E基因,为研究该蛋白的免疫学功能和特性奠定基础.方法 用RT-PCR法获得登革Ⅰ型病毒广州分离株全长prM/E基因,在prM基因前添加乙型脑炎病毒的信号肽或同时替换E基因羧基末端的20%为乙脑病毒E基因相应的部分,分别将其克隆入真核表达载体pcDNAS/FRT中,获得三种重组质粒DlprME-pc5,D1JsprME-pc5,D1JsprM80E20JE-pc5.用脂质体法分别将重组质粒DNA转入293T细胞,通过免疫荧光、Western印迹检测外源基因在真核细胞中的分泌表达.结果 用免疫荧光法检测到分别转染了三种重组质粒的293T细胞的胞质中均有登革Ⅰ型病毒蛋白的表达.Western印迹检测转染了D1prME-pc5重组质粒的293T细胞上清中没有特异蛋白条带,转染了经基因改造的重组质粒D1JsprME-pc5和D1JsprM80E20JE-pc5的细胞上清中均存在登革Ⅰ型病毒的特异蛋白条带.结论 转染了三种重组质粒的293T细胞均可表达登革Ⅰ型病毒prM/E蛋白,只有在prM基因前添加了信号肽的重组质粒转染后蛋白才获得分泌表达.     

Tau蛋白过度表达促进细胞重新进入细胞周期

目的 探讨tau蛋白过度表达对细胞重新进入细胞周期的影响.方法 采用免疫印迹和免疫荧光细胞化学的方法,分别检测稳定转染质粒peDNA3.1-tau和空载体pcDNA3.1的HEK293细胞(HEK293/tau和HEK293/vec)中tau的表达,用细胞周期抑制剂Aphidicolin处理细胞抑制细胞周期,在Aphi...     

程序性死亡蛋白1(PD-1)在转染的HEK293T细胞的表达和鉴定

目的优化HEK293T细胞转染条件,比较程序性死亡蛋白1(PD-1)在不同真核载体的表达水平以高效获取目标蛋白。方法设计L9(33)正交试验,对细胞转染条件进行优化;扩增人PD-1胞外段基因,构建PD-1重组蛋白表达载体,瞬时转染HEK293T细胞,通过ELISA、Western blot对pCMV3、pcDNA3. 1和pMH3三种真核表达载体的蛋白表达水平进行比较。结果PD-1胞外段蛋白编码序列成功构建到pc DNA3. 1和pMH3真核表达载体上,目的蛋白成功表达。在最佳转染条件下,PD-1重组蛋白在pMH3中的表达量最高,其次为pCMV3、pcDNA3. 1的表达量最低。结论人PD-1胞外段蛋白在pMH3-PD1真核载体转染的HEK293T细胞中表达量最高。