小热休克蛋白22基因在腓骨肌萎缩症中的突变分析

目的 探讨小热休克蛋白22（small heat-shock protein 22，HSP22）基因在中国人腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease，CMT）中的突变特点。方法 应用聚合酶链反应和DNA直接测序方法，对1个发现HSP22基因423（G→T）突变的CMT2L家系外的114个CMT家系先证者进行了且HSP22基因的突变分析。结果 114个先证者中有2例患者在且HSP22基因的第3外显子发生了582（C→T）碱基改变，由于编码的氨基酸未改变，均为色氨酸（Thr），为一种同义突变。结论 HSP22基因突变在中国人的腓骨肌萎缩症患者中少见，突变率为0.87％（1／115）。     

中国人腓骨肌萎缩症小热休克蛋白27基因突变分析

目的 探讨中国人腓骨肌萎缩症（Clmrcot-Marie-Tooth disease，CMT）小热休克蛋白27基因（small heat-shock protein 27，HSP27）的突变特点。方法 应用聚合酶链反应结合DNA序列分析方法，对114个CMT家系的先证者进行HSP27基因突变研究，并进一步对基因突变家系进行单体型分析。结果 在4个常染色体显性遗传CM32家系中发现一个HSP27基因错义突变C379T，单体型分析提示这4个家系很可能具有共同祖先。结论 中国人CMT患者存在HSP27基因突变，但突变率较低（0．90％）。HSP27基因C397T突变除引起远端型遗传性运动神经病外尚可导致CMT2，进一步证实同一CMT疾病基因的同一突变可引起不同的表现型。     

热休克蛋白40和热休克蛋白70抑制N2a细胞内突变亨廷顿蛋白聚积和毒性

目的 研究热休克蛋白40(HSP40)和热休克蛋白70(HSP70)对N2a细胞内突变亨廷顿蛋白(htt) 聚集物形成和毒性的影响. 方法 应用荧光显微镜术和免疫印迹技术检测单独或共同过表达HSP40和HSP70对N2a细胞内转染的突变htt(含有150个谷氨酰胺重复数,150Q)聚集物形成的影响;应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析细胞活力和比色法检测细胞内活性氧(ROS)含量. 结果 单独过表达HSP40或HSP70,尤其是共同过表达HSP40和HSP70显著减少150Q htt在N2a细胞内的聚积,各组含有聚集物的细胞为(n=1 000):仅表达150Q htt 组约50%,过表达HSP40组约12%,过表达HSP70组约15%,共同过表达HSP40和HSP70组约5%.MTT分析结果显示,单独尤其是共同过表达HSP40和HSP70能显著增加150Q细胞的活力( P<0.01, n =3),同时减少ROS产生( P<0.01, n =3). 结论 HSP40和HSP70通过抑制细胞内突变htt聚积以及减少氧化应激而增加150Q N2a细胞活力.     

轴突型腓骨肌萎缩症2L型致病基因HSPB8突变导致细胞内聚集物形成的机理研究

目的探讨轴突型腓骨肌萎缩症2L型（axonal Charcot-Marie-Tooth disease type 2L，CMT2L）致病基因小分子热休克蛋白HSPB8（small heat shock protein HSPB8，HSPB8）的K141N突变导致细胞内聚集物形成的可能机理。方法建立pEGFPN1-HSPB8、pEGFPN1-^K141N HSPB8瞬时表达细胞模型，并进行EGFP-^K141N。HSPB8与小分子热休克蛋白HSPB1（small heat shock protein HSPB1，HSPB1）、神经丝轻链（neurofilament light chain，NEFL）的免疫荧光共定位分析，观察EGFP-^K141N HSPB8在不同内源性表达细胞系的聚集物形成情况，采用t检验和单因素方差分析的统计学方法分析聚集物形成的可能机理。结果EGFP-^K141N HSPB8形成以核周分布为主的聚集物，EGFP-^K141N HSPB8与HSPB1、NEFL均存在免疫荧光共定位。EGFP-^K141N HSPB8在不同内源性表达细胞系的聚集物形成百分率的差异有统计学意义。结论突变型HSPB8（K141N）形成以核周分布为主的胞内聚集物，聚集物中^K141N HSPB8与HSPB1、NEFL均存在共定位。聚集物形成的可能机理包括^K141N HSPB8多肽链构象发生改变后不能维持稳态而出现自身异常聚集；与家族内其他成员特别是HSPB1结合成异常的异源多聚体，在胞内形成不可溶性大分子后产生聚集。     

HSPB1的R127W突变蛋白细胞内表达与神经丝轻链的共定位研究

目的 观察HSPB1的R127W突变蛋白在细胞内的分布,对神经丝轻链(neurofilament light chain,NFL)蛋白自身组装的影响和二者的共定位情况.方法 构建pEGFPN1-wt HSPB1和pEGFPN1-R127W HSPB1真核表达载体,瞬间转染Hela细胞后在激光共聚焦显微镜下观察EGFP-wt HSPB1 和EGFP-R127W HSPB1的胞内分布情况.pCL-NFL与pEGFPN1-wt HSPB1、pEGFPN1-R127W HSPB1共转染Hela细胞,通过间接免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下观察NFL胞内表达情况及R127W HSPB1与NFL是否存在共定位.结果 EGFP-R127W HSPB1在胞浆内形成以核周分布为主的聚集物,EGFP-wt HSPB1在胞浆和胞核中均匀分布;NFL与wt HSPB1共表达时在胞浆形成均一结构,与R127W HSPB共表达时形成胞内聚合物,聚合物中NFL与R127W HSPB1存在共定位.结论 HSPB1的R127W突变可能导致蛋白异常聚集、神经元细胞骨架不能维持稳定和正确组装.轴索细胞骨架的不稳定和物质转运障碍可能是R127W HSPB在腓骨肌萎缩症的主要致病机理.     

黑色素瘤B16细胞热休克蛋白-抗原肽复合物(HAC)的提纯及其抑瘤作用

热休克蛋白 (Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ ,ＨＳＰ)是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核真核生物中的蛋白质 ,具有携带特异性抗原的作用[1] 。从肿瘤组织中提取的ＨＡＣ(ＨＳＰ -ａｎｔｉｇｅｎｐｅｐｔｉｄｅｃｏｍｐｌｅｘ)具有肿瘤疫苗的作用 ,能特异性地抑制     

大鼠局灶性脑梗死后细胞凋亡及热休克蛋白70表达的变化

目的 探讨大鼠局灶性脑梗死后热休克蛋白70(HSP70)及细胞凋亡的变化。方法采用光化学法诱导制作大鼠局灶性脑梗死模型，冰冻切片行HSP70免疫组化染色，并用TdT-介导duTP-生物缺口末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞。结果免疫组化显示对照组和假手术组动物无HSP70免疫反应；局灶性脑梗死组12h即有：HSP70的表达，48h时HSP70表达至高峰，阳性反应局限于半暗带。TUNEL结果显示，对照组和假手术动物无凋亡细胞；局灶性脑梗死组6h时在半暗区凋亡细胞出现，3d达高峰。结论局灶性脑梗死可诱导HSP70的表达、神经细胞凋亡，两者的分布一致，但HSP70的表达高峰明显早于细胞凋亡。     

空肠弯曲菌热休克蛋白43对T细胞的活化作用

本文用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入试验发现空肠弯曲菌４３ＫＤ热休克蛋白（ＨＳＰ４３）能显著促进小鼠脾淋巴细胞活化，并呈剂量依赖关系，这种活化作用不但能被特异性针对ＨＳＰ４３的二株单抗明显抑制，而且也能针对ＨＳＰ６０家族保守区序列的二株单抗所抑制，去除巨噬细胞同样也能抑制ＨＳＰ４３活化作用。用单抗和补体的特异性杀伤所致Ｔ细胞亚群缺失试验发现ＨＳＰ４３主要活化ＣＤ４＾＋Ｔ细胞，本文结果提示空肠弯曲菌ＨＳＰ４３可     

热休克蛋白60对小鼠树突状细胞功能影响体外研究

目的：探讨动脉粥样硬化中重要炎性物质——热休克蛋白60（HSP60）体外对小鼠树突状细胞（mDC）功能影响.方法：小鼠骨髓提取DC,体外培养成熟后与两种浓度mHSP60孵育,动态观察DC突起改变;流式细胞仪检测孵育前后mDC表面标志改变;MLR测定孵育前后mDC刺激功能变化;ELISA法测定MLR上清液中细胞因子浓度.结果：孵育后,mDC突起增加明显;CD11c^＋、CD80及CD86表型显著增加;淋巴细胞刺激功能明显增强;分泌细胞因子IL-12、IFN-γ增加（P＜0.01）而IL-4增加不明显（P＞0.05）,IFN-γ/IL-4比值升高.结论：mHSP60体外可以促进mDC功能,作用呈剂量依赖性.     

VP-16诱导细胞凋亡及其细胞核基质中热休克蛋白表达的研究

目的　研究VP 16诱导HL 6 0细胞凋亡的变化特点以及凋亡细胞及核基质中热休克蛋白 (HSP)表达的变化。　方法　琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞基因组DNA断裂 ;TUNEL法观察凋亡细胞的形态学变化 ;用免疫印迹方法显示凋亡细胞核基质蛋白、细胞总蛋白中HSP表达的差异。　结果　VP 16作用HL 6 0细胞 0 5h出现早期凋亡特征。作用 4h可见明显的DNA梯状条带。与未凋亡的细胞比较 ,凋亡细胞核基质蛋白中HSP70和HSC70表达明显上调 ;VP 16作用 2、3及 4h细胞总蛋白中HSP70的表达随时间延长略显增加 ;诱导 2 2h比诱导 4h时去除VP 16后孵至 2 2h凋亡细胞总蛋白HSP70表达量增强了 3 4倍。　结论　 1 HL 6 0细胞早期凋亡形态出现在DNA梯状条带形成之前。 2 凋亡细胞核基质中HSP70、HSC70的表达明显增加 ,经 2、3及 4h作用的细胞总蛋白中HSP70表达差异不显著。这提示细胞凋亡后HSP70的活性位点主要位于核基质上。 3 VP 16作用细胞时间增长至2 2h ,HSP的保护作用可能消失     

Myelin protein zero (MPZ) gene mutations in nonduplication type 1 Charcot-Marie-Tooth disease

The myelin protein zero gene (MPZ) maps to chromosome 1q22-q23 and encodes the most abundant peripheral nerve myelin protein. The P_o protein functions as a homophilic adhesion molecule in myelin compaction. Mutations in the MPZ gene are associated with the demyelinating peripheral neuropathies Charcot-Marie-Tooth disease type 1B (CMT1B), and the more severe Dejerine-Sottas syndrome (DSS). We have surveyed a cohort of 70 unrelated patients with demyelinating polyneuropathy for additional mutations in the MPZ gene. The 1.5-Mb DNA duplication on chromosome 17p11.2-p12 associated with CMT type 1A (CMT1A) was not present. By DNA heteroduplex analysis, four base mismatches were detected in three exons of MPZ. Nucleotide sequence analysis identified a de novo mutation in MPZ exon 3 that predicts an Ile(135)Thr substitution in a family with clinically severe early-onset CMT1, and an exon 3 mutation encoding a Gly(137)Ser substitution was identified in a second CMT1 family. Each predicted amino acid substitution resides in the extracellular domain of the P_o protein. Heteroduplex analysis did not detect either base change in 104 unrelated controls, indicating that these substitutions are disease-associated mutations rather than common polymorphisms. In addition, two polymorphic mutations were identified in MPZ exon 5 and exon 6, which do not alter the codons for Gly(200) and Ser(228), respectively. These observations provide further confirmation of the role of MPZ in CMT1B and suggest that MPZ coding region mutations may account for a limited percentage of disease-causing mutations in nonduplication CMT1 patients. © 1996 Wiley-Liss, Inc.     

腓骨肌萎缩症 GDAP1基因突变分析

目的　分析神经节苷酯诱导分化相关蛋白 1( ganglioside- induced differentiation- associatedprotein- 1,GDAP1)基因在中国人腓骨肌萎缩症的突变特点。方法　应用多聚酶链反应 -单链构象多态性分析结合 DNA直接测序的方法 ,对 8个常染色体隐性遗传的腓骨肌萎缩症家系先证者和 15个散发病例共 2 3例患者进行了 GDAP1基因 6个外显子及其侧翼区的突变检测。结果　在 1个常染色体隐性遗传家系中发现 GDAP1基因的 A5 33G、A76 7G的复合杂合突变。纯合、杂合 T5 0 7G为人群常见多态。结论　GDAP1基因 A5 33G、A76 7G为新发现的突变     

Mutations in the myelin protein zero gene associated with Charcot-Marie-Tooth disease type 1B

Charcot-Marie-Tooth type 1 (CMT1) disease is an autosomal dominant neuropathy of the peripheral nerve. The majority of CMT 1 cases are due to a duplication of an 1.5-Mb DNA fragment on chromosome 17pl1.2 (CMT la). Micromutations were found in the gene for peripheral myelin protein 22 (PMp22) located in the duplicated region of CMT la, and in the peripheral myelin protein zero (PO) located on chromosome lq21-23 (CMT Ib). We have characterized two new mutations in the PO gene in two french families presenting CMT disease. Both mutations occur in the extracellular domain of the PO protein. One mutation is a de novo mutation and is from paternal origin. © 1995 Wiley-Liss, Inc.     

Four novel mutations of the connexin 32 gene in four Japanese families with Charcot-Marie-Tooth disease type 1

DNA-based mutation analysis on the connexin 32 gene was performed in 49 families with Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) type 1 but without duplication involving the chromosomal region, 17p12-p11.2. Mutations were identified in five of the 49 families, and four of the five mutations were hitherto undescribed: Val37Met, Glu57His, Arg142Glu, Val177Ala. X-linked CMT sometimes lacks evidence for X-linked transmission and cannot be differentiated from CMT type 2, especially in females with mildly decreased nerve conduction velocity. Therefore, molecular analysis is useful for molecular pathology of their disease. Am. J. Med. Genet. 80:352–355, 1998. © 1998 Wiley-Liss, Inc.     

NEFL Pro22Arg mutation in Charcot-Marie-Tooth disease type 1

Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is classified into demyelinating neuropathy (CMT1) and axonal neuropathy (CMT2). Mutations in the neurofilament light chain polypeptide (NEFL) gene are present in CMT2E and CMT1F neuropathies. Two types of Pro22 mutations have been previously reported: Pro22Ser in CMT2E with giant axons, and Pro22Thr in CMT1F. In this study, we identified another Pro22 mutation, Pro22Arg, in a Korean CMT1 family. An investigation to identify the clinical and pathological characteristics of the Pro22Arg revealed that it is associated with demyelinating neuropathy features in CMT1F. Histopathological findings showed onion bulb formations but no giant axons. It appears that the Pro22 mutations may influence not only the Thr-Pro phosphorylation site by proline-directed protein kinases but also other structural alteration of the NEFL protein in a different way. J.S. Shin and K.W. Chung contributed equally to this work.     

定位于12q24的腓骨肌萎缩症2L型10个候选基因的排除克隆

目的克隆定位于12号染色体微卫星标记D12S1720和D12S161l之间约6．8cM的区间内的腓骨肌萎缩症2L型的致病基因。方法应用生物信息学方法筛选10个候选基因，设计合成扩增10个基因外显子及外显子与内含子交界的引物，DNA直接测序法进行序列变异分析。结果在基因外显子及侧翼区共发现11个序列变异，其中杂合序列变异共5个，纯合序列变异共6个。上述序列变异与疾病表型无共分离现象。结论排除了10个候选基因（TAOK3、RAB35、RPLPO、PXN、RIVFl0、RHOF、VPS33A，RSN、DENR、RNP24）为腓骨肌萎缩症2L型致病基因的可能。发现了以上10个候选基因共11个单核苷酸多态，除镜影细胞（reed-steinberg cell，RS）细胞特异性中间丝相关蛋白基因的3207G→C在多态数据库已报道，其余均为新发现的单核苷酸多态。     

腓骨肌萎缩症1A亚型的发病机制及靶向药物研究进展

腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease,CMT)是一组常见的累及周围神经的单基因遗传病,其发病率约为1/2500。CMT1A是CMT最常见的亚型,约占确诊病例的50%。目前认为CMT1A的病因为外周髓鞘蛋白22基因重复突变,导致基因表达调控机制紊乱,与NRG1/ErbB通路失调、脂质代谢障碍等多种因素共同影响施旺细胞髓鞘形成。目前CMT1A患者的治疗以对症支持为主,针对上述可能的发病机制,CMT1A的靶向治疗药物正在研发中。本文就CMT1A的发病机制和靶向治疗药物的研究进展做一综述。