ELISA检测HBsAg洗板方法的探讨

目的探讨酶联免疫试验(ELISA)检测HBsAg的最佳洗板次数和方式,试图找到一种实用、可靠的ELISA洗板方法。方法选择50例HBsAg阴性体检者完全分离后的血清为检测对象,分别进行3～7次洗板,得到阴性数和假阳性数,得出最佳洗板机洗板次数;收集同一批号试剂盒的阴阳性标准品及质控品,将质控品平行检测31孔,共2板分别用手工和洗板机2种方法各洗板7次。结果不同洗板次数的结果差异有统计学意义,且洗板7次假阳性率最低;2种洗板方式测定值结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论洗板7次能达到理想的洗板效果;对标本量少或无洗板机的基层医院可采用标准化手工洗板的方式。     

表皮生长因子ELISA检测方法的建立及其在肿瘤临床的初步应用

目的建立表皮生长因子(EGF)酶联免疫检测方法,探讨其在临床常见肿瘤患者血清中含量的变化规律。方法采用EGF单克隆抗体包被酶标板、兔抗EGF多抗为二抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为酶标抗体,建立夹心法ELISA,检测临床常见肿瘤患者及健康体检人群的血清EGF含量。结果建立的EGF酶联免疫吸附法最小检测限为15.6ng/L,批内精密度8.7%,批间精密度11.6%,平均回收率94.7%,符合临床检测要求。血清EGF含量在31名正常人为(1.305±0.382)ng/ml;24例乳腺癌患者术前为(0.729±0.347)ng/ml,术后为(0.711±0.332)ng/ml;17例结直肠癌患者术前为(0.678±0.311)ng/ml,术后为(0.658±0.298)ng/ml;19例胃癌患者术前为(0.598±0.224)ng/ml,术后为(0.614±0.257)ng/ml。各肿瘤组患者血清EGF水平较健康对照组明显降低(P<0.01)。结论建立了适用于临床检测EGF的ELISA法,肿瘤患者血清中EGF含量较健康对照组明显下降,为进一步探讨肿瘤的发病机制提供了有效手段。     

ELISA检测HBsAg室内质控血清的制备和应用

目的为了提高HBsAg检测质量，自制HBsAg室内质控血清，以降低假阳性、假阴性的出现率，相应提高检测的准确度。方法采用不同厂家的诊断试剂检测，将质控血清分装放在不同温度下保存后多次测定。结果自制的室内质控血清室温下测得0D：0．0567，SD：0．002594，S／CO：1．2；在4℃保存1周测得OD：0．05958，SD：0．002800，S／CO：1．2；在一20℃保存1个月测得OD：0．05978，SD：0．002945，S／CO：1．2，经统计处理三者之间无显著差异（P〉0．05）。结论自制HBsAg室内质控血清稳定，易保存，能反映常规检测精密度，该质控血清适宜作HBsAg室内质控使用。     

ELISA法检测HBsAg实验条件的优化

目的探讨温度、孵育时间、振荡对ELISA法检测HBsAg的影响,以期进一步优化检测条件。方法采用HBsAg含量约为1ng/mL的血清标本,在4种不同条件(37℃振荡、37℃不振荡、25℃室温震荡、25℃室温不振荡)下的3个不同反应时间(10、20、30min)测定HBsAg,记录吸光度值。结果除10min37℃不振荡和25℃不振荡差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组差异都有统计学意义(P<0.05)。结论 37℃振荡20min为ELISA检测HBsAg的较佳条件。     

RIA检测ELISA HBsAg灰区标本204例结果分析

目的探讨放射免疫法(RIA)对ELISA测定乙肝表面抗原灰区标本的乙肝标志物的检测结果。方法采用RIA方法对经ELISA检测HBsAg临界值以下的部分标本进行乙肝5项检测。结果 RIA方法 HBsAg阳性率为49.02%,有85.29%的标本检出了各类HBV的标志物;按照标志物组合模式计以HBsAg抗-HBe抗-HBc阳性(小三阳)最多(34.80%)。结论受方法学限制,ELISA测定乙肝表面抗原存在一定的漏检率,采用高灵敏度的RIA方法可在一定程度上减少漏检的机会。     

血清MMP9蛋白ELISA检测方法的建立及在肝癌患者血清检测中的初步应用

目的建立基质金属蛋白酶9（MMP9）的双抗体夹心ELISA检测方法，探讨血清中MMP9在正常人及肝癌患者中的差异。方法从人肝组织中经过反转录扩增出MMP9基因721—1156bp区段，插入到原核表达质粒pQE30中，在大肠埃希菌M15中诱导蛋白表达。以纯化的融合蛋白HIS—MMP9为抗原免疫实验用兔及豚鼠，得到的MMP9抗血清经过纯化后，建立双抗体夹心ELISA法。对227份正常及193份肝癌患者血清中的MMP9进行检测。结果SDS—PAGE显示所表达的HIS—MMP9融合蛋白相对分子质量约为17000；以原核表达蛋白为抗原制备的MMP9抗血清可有效地识别重组MMP9和中性粒细胞和HepG2细胞内源性MMP9蛋白；利用建立的MMP9 ELISA检测技术发现肝细胞癌患者血清中MMP9的含量高于正常人群，差异具有统计学意义，P〈0．001。结论建立的双抗体夹心ELISA方法可用于血清MMP9的检测，为建立以MMP9为检测指标的肝细胞癌患者转移复发筛查方法提供了科学基础。     

ELISA检测HBsAg影响因素探析

ELISA方法具有简便、灵敏度高、特异性强等特点而被广泛应用,成为目前检测HBsAg的常用方法。但ELISA进行HBsAg检测时易受试剂、标本、操作等诸多因素影响出现假阳性或假阴性结果,因此应从以下几方面加强监测,减少错误结果的产生。     

ELISA法检测乙型肝炎表面抗原假阳性的影响因素

<正>目前,大多数实验室采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行定性检测,当检测标本的吸光度值大于试剂盒设定的临界值时为阳性,反之为阴性。对于强阳性和明显阴性的标本几乎不会错检,但是在检测临界值附近的弱显色反应(S/CO:1～2)标本时可能出现假阳性结果,ELISA法操作过程中也存在一部分     

影响ELISA法检测乙型肝炎病毒血清标志物的因素

影响ELISA法检测乙型肝炎病毒（HBV）血清标志物的因素有以下几点：     

血清glypican 3 ELISA检测法的建立及初步应用

目的 建立血清中磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3,GPC3)的双抗体夹心ELISA检测法,并探讨其应用价值.方法 以本室自制抗GPC3单克隆抗体为包被抗体,以兔抗人GPC3抗体为检测抗体,建立检测GPC3的双抗体夹心ELISA法.对建立的方法进行线性范围、灵敏度、精密度、回收率等方法学评价,并用于测定原发性肝...     

结缔组织生长因子在糖尿病大鼠肾脏中的表达

目的 通过观察结缔组织生长因子（CTGF）在糖尿病大鼠肾脏中表达的动态改变,探讨CTGF在糖尿病肾病发生发展中的作用。方法 尾静脉内注射链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病大鼠模型。采用RT-PCR和Western blot检测1个月、3个月和6个月时糖尿病大鼠肾脏组织中CTGF的mRNA和蛋白的表达。光镜下观察糖尿病大鼠不同时期肾脏组织形态学的改变。结果 糖尿病大鼠1个月、3个月和6个月与同期对照大鼠相比,肾脏CTGF的mRNA表达上调,分别为对照组的1.56倍、2.05倍和3.74倍（P〈0.01）;同时蛋白表达亦上调,分别为对照组的2.48倍、2.93倍和5.82倍（P〈0.01）;此外,糖尿病6个月大鼠的CTGF mRNA和蛋白的表达明显高于糖尿病1个月和3个月大鼠的表达水平（P〈0.01）。组织形态学观察表明,糖尿病大鼠3个月时肾脏出现基膜增厚、肾小球扩张等糖尿病肾病早期的病理改变,随着病程的延长,病理改变越严重;6个月时出现肾小球硬化、肾间质纤维化等晚期的改变。结论 糖尿病大鼠早期肾脏已存在CTGF基因表达上调,在糖尿病肾病的发展过程中,CTGF基因表达上调仍持续存在。因此,CTGF基因表达上调在糖尿病肾病的发生发展中起着重要作用。     

血清肝癌特异性γ-谷氨酰转移酶ELISA检验方法的建立及临床应用

目的 应用抗人肝癌组织中蔓陀罗凝集素(DSA)强结合的γ-谷氨酰转移酶(GGT)单克隆抗体(MeAb),建立其血清DSA-GGT生物素-链霉亲和素ELISA检测方法 ,并探讨其在原发性肝癌(PHC)诊断的应用价值.方法 通过McAb技术制备的抗DSA-GGT的McAb,采用蛋白G亲和层析柱色谱纯化;纯化的McAb经生物素标记后,构建血清DSA-GGT生物素-链霉亲和素ELISA检测方法 .用建立的方法 对39例PHC患者和122例非PHC患者进行初步临床应用研究,用P-P概率图检验119例健康对照血清DSA-GGT分布状态,依据受试者工作曲线(ROC)确定DSA-GGT诊断PHC的cut-off值.结果 获取5株分泌McAb杂交瘤细胞制备的腹腔积液,经纯化后McAb蛋白总量在2.12～6.70 mg之间;McAb的生物素标记率为48.6%～72.2%.所构建的血清DSA-GGT生物素-链霉亲和素ELISA检测方法 的最低检出限为2μg/L;平均批内、批间变异分别为8.9%和11.5%.119份健康对照血清DSA-GGT水平呈正态分布,x±s为(1.50±0.51)μg/L;经ROC分析确定其诊断PHC的临界值为3.25μg/L.39例PHC患者26例DSA-GGT阳性,其诊断PHC敏感度为66.7%;122例非PHC患者10例DSA-GGT阳性,其诊断特异度为91.8%.结论 所建立的血清DSA-GGT生物素-链霉亲和素ELISA检测方法 具有良好的重复性和可靠性.临床初步应用表明其诊断PHC的敏感度、特异度良好,且方法 操作简便,便于临床推广应用,为PHC实验室诊断提供了新方法 .     

夹心酶联免疫吸附试验检测人表皮生长因子的方法建立及其应用研究

目的:建立临床适用的表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)酶联免疫检测方法,探讨EGF在临床常见肿瘤患者血清中的含量变化规律。方法:采用EGF单抗包被酶标板,兔抗EGF多抗为二抗,以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为酶标抗体建立夹心法ELISA检测临床常见肿瘤患者及健康体检人群的血清EGF含量。结果:建立的EGF酶联免疫吸附法最小检测限达15.6ng/L,批内精密度为8.7%,批间精密度为11.6%,平均回收率为94.7%,符合临床检测要求。血清EGF含量在31名正常人为(1.305±0.382)ng/mL,24名乳腺癌病人术前值为(0.729±0.347)ng/mL,术后为(0.711±0.332)ng/mL,17名结直肠癌病人术前为(0.678±0.311)ng/mL,术后为(0.658±0.298)ng/mL,19名胃癌病人术前为(0.598±0.224)ng/mL,术后为(0.614±0.257)ng/mL。各肿瘤组患者血清EGF水平较健康对照组明显降低(P<0.01)。结论:建立了适用于临床检测的EGF酶联免疫检测方法,肿瘤患者血清中EGF含量较健康对照组明显下降,该检...     

强直性脊柱炎患者血清和骶髂关节结缔组织生长因子的表达——附30例检测分析

目的：了解AS患者血清和骶髂关节中结缔组织生长因子（CTGF）的表达情况。方法：选择30例AS患者和20名健康志愿者,分为AS组和健康对照组。采用ELISA法检测两组的血清CTGF水平,AS组患者行CT引导下骶髂关节细针穿刺活组织检查术,组织标本应用免疫组织化学染色检测CTGF的表达情况。结果：AS组骶髂关节组织的CTGF在血管翳炎症细胞及骨髓细胞的胞浆中高度表达,其阳性细胞数为（57．9±42．4）／HP,明显多于正常骶髂关节组织（2．7±2．5）／HP（P〈0．05）,AS组血清CTGF水平略低于健康对照组,但比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：AS骶髂关节中存在CTGF的高表达,提示CTGF可能在AS关节软骨纤维化、关节强直中起重要的作用。     

ELISA联合检测方法的建立及应用

目的在微孔板平台上建立多指标联合检测的方法,为急诊、门诊及基层等多种医疗机构提供1种新的血清学检测手段。方法本研究根据酶联免疫吸附法(ELISA法)原理,以卵泡刺激素(FSH)、泌乳素(PRL)、黄体生成素(LH)、生长激素(GH)为检测靶标,在自行设计的聚苯乙烯板孔上完成反应体系的优化,包括FSH、PRL、LH、GH包被抗体浓度及酶标抗体浓度,建立1种并行分析样品中多种指标的方法。结果成功确定4种垂体激素联合检测的条件,包括4种激素抗体包被浓度、酶标抗体浓度等,并成功应用于临床样本的检测。结论本研究首次建立了1种简单、特异性高、成本低、并行分析4种垂体激素的联合检测方法,提高了常规ELISA法的检测效率。     

肝细胞癌组织和血清中肝细胞生长因子的临床意义

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)在慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌(HCC)患者肝组织和血清中的表达水平及其临床意义.方法 收集2003年12月至2008年8月期间天津市第三中心医院11份正常、6份肝炎、20份肝硬化、60份HCC组织(高分化21份、中分化23份、低分化16份),及其癌旁0、1、2、3 cm组织(N0、N1、N2、N3)各24、21、54和43份.用实时荧光定量逆转录(RT)-PCR分析不同肝组织HGF mRNA表达;同时,用ELISA测定健康体检者、肝炎、肝硬化患者血清标本各20份及HCC患者57份术前1d、术后1周内血清标本的HGF浓度.多组间组织HGF mRNA水平比较用Kruskal-Wallis检验,两组间组织HGF mRNA水平比较用Mann-Whitney U检验.多组间血清HGF浓度比较用单因素方差分析,两组间血清HGF浓度比较用LSD-t检验.性别、年龄、肿瘤类型、肿瘤直径等临床因素对HCC患者组织、血清HGF水平的影响及其与患者预后的相关分析分别用Logistic回归分析及Cox比例风险模型.筛选出影响患者术后生存的独立预后指标,以中位数水平分层,由Kaplan-Meier生存曲线计算不同分层水平的死亡终点事件发生风险,并用Log-rank检验评价分层间死亡终点事件发生率.结果 实时荧光定量RT-PCR检测健康对照组、肝炎、肝硬化、N3、N2、N1、N0、HCC组HGF mRNA表达分别为0.99(0.78～1.66)、2.15 (1.06～3.40)、1.78(1.18～2.73)、4.59(2.67 ～8.63)、3.86(2.25 ～6.45)、3.12(1.59 ～5.74)、2.92(0.88 ～5.99)、0.48(0.19～1.06);ELISA检测血清HGF在健康体检者、肝炎、肝硬化及HCC患者术前1d、术后1周的浓度分别为(0.31±0.05)、(0.65±0.07)、(1.27 ±0.30)、(2.06±0.66)及(2.14±0.52)μg/L.不同肝组织相比,HGF mRNA在N3组织中表达最高,而在HCC组织中的表达不仅低于以上各良性肝病组织,而且低于正常肝组织(U=196.50,P=0.03);不同血清HGF浓度相比,HGF在肝炎、肝硬化、HCC患者血清中的浓度均明显高于健康对照组,且HCC患者术后1周的血清HGF浓度高于其术前血清HGF浓度(t=2.70,P＜0.01);Logistic回归分析显示,HCC患者癌组织及血清HGF水平分别受肿瘤数目及Child-pugh肝功能分级影响,OR分别为0.15(95％ CI:0.03 ～0.72,P＜0.05)和0.13(95％口:0.27 ～0.89,P＜0.05).Cox比例风险模型分析显示,肿瘤组织HGF mRNA水平、血清HGF浓度是影响HCC患者术后生存的独立预后指标,OR分别为0.02(95％ CI:0.00 ～0.52,P＜0.05)和10.01(95％CI:1.16 ～86.23,P＜0.05).以肿瘤组织HGF mRNA 2-AACT中位数0.49对HCC患者进行分层分析显示,两组患者术后累计生存率差异无统计学意义(x2=0.13,P=0.72).以血清浓度中位数0.69 μg/L对HCC患者进行分层分析,HGF≥0.69 μg/L的HCC患者,其术后死亡的风险是HGF＜0.69 μg/L患者的2.84倍(95％ CI:1.03 ～7.92,P＜0.05).结论 HCC患者癌组织中HGF mRNA表达降低,但癌旁组织HGF mRNA表达和血清HGF浓度明显升高,且血清HGF浓度影响患者预后,检测血清HGF有望用于评估HCC患者预后.     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位基因片段的克隆表达及其检测自身免疫性肝炎的价值

目的 克隆去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein reeeptor,ASGPR)H1亚单位显性表位435 bp基因片段,构建表达重组质粒,进行表达、纯化,以获得具有免疫活性的ASGPR蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测自身免疫性肝炎(AIH)中抗ASGPR抗体的价值.方法 将ASGPRH1亚单位糖类识别区(CRDH1)435 bp的基因片段定向克隆至真核表达载体PEGH,经D-半乳糖诱导表达,表达产物用谷胱甘肽凝胶珠(Glutathione Sepharose4B)亲和纯化,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(WB)及蛋白质谱(MALDI-TOF)进行免疫活性鉴定,应用表达蛋白建立ELISA法.同时用该方法检测45例AIH、30例SLE、30例类风湿关节炎(RA)、10例原发性干燥综合征(SS)患者、30名健康献血者的抗ASGPR抗体阳性率.结果 经重组质粒测序结果证实,CRDHl/PEGH目的 基因已正确插入真核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;SDS-PAGE检测表达产物为l条相对分子质量42 500的蛋白表达条带.质谱蛋白肽指纹数据通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对,与ASGPR H1亚单位蛋白同源性为98.34%,WB分析表明,重组蛋白具有人ASGPR抗原反应性;间接ELISA检测血清结果显示,AIH组中抗ASGPR抗体的阳性率为35.6%(16/45),非AIH组均为阴性,差异有统计学意义(χ2=31.85,P<0.01).结论 成功克隆的ASGPR H1基因可在啤酒酵母菌中成功表达,且重组的自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化蛋白建_上的间接ELISA检测AIH抗ASGPR抗体具有较好的特异性.