RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子拮抗肾脏纤维化的发展

目的 研究RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子(CTGF)对高血压大鼠肾脏纤维化指标的影响.方法 本研究于2006-2008年在武汉协和医院心血管病研究所完成,实验以自发性高血压大鼠(SHR)为动物模型,随机(随机数字法)分为未干预的SHR组(n=10)和RNA干扰组(RNAi组,n=10),并设置WKY大鼠(n=8)为正常对照组.构建并筛选出靶向大鼠CTGF的RNAi质粒重组体,通过升主动脉钳夹冠脉灌注法联合尾静脉注射将质粒转染至大鼠体内,RNA干扰结束后,获取肾脏标本,RT-PCR和Western blotting检测肾脏组织CTGF及纤维连接蛋白(FN)的mRNA和蛋白表达,免疫组化技术分析CTGF及FN在肾脏的空间表达.0.1%天狼星红-饱和苦味酸胶原染色分析肾组织胶原类型及代谢水平(以胶原容积分数CVF表示),比色法测定肾脏组织羟脯氨酸含量.所有数据以(x-±s)表示,多个均数的组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为有统计学意义.结果 RNA干扰使高血压大鼠肾脏组织CTGF的mRNA和蛋白表达分别下调66%和62%(P<0.01),FN mRNA和蛋白的表达也相应降低达56%和51%(P<0.01);免疫组化显示了同样的抑制效应,而且观察到CTGF及FN不同的空间表达,CTGF在肾实质和间质中均可表达,而FN主要在肾脏间质表达.天狼星红染色显示RNA干扰组胶原沉积减少,偏光显微镜下进一步观察到RNA 干扰主要抑制了I型胶原的合成;肾脏组织羟脯氨酸含量在RNA干扰组显著减少[SHR组:(0.596±0.067)μg/mg,RNAi组:(0.368±0.084)μg/mg,P<0.01].结论 C-CTGF靶向性RNA干扰显著下调肾组织中CTGF的表达并相应抑制细胞外基质在肾间质的沉积,且这种效应独立于降压之外.提示CTGF在肾脏纤维化发生及进展中起着关键作用.     

RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子拮抗肾脏纤维化的发展

Objective To investigate the impact on renal fibrosis by inhibition of connective tissue growth factor( CTGF) by RNA interference in spontaneous hypertension rat( SHR) . Method Twenty SHR were randomly (random number) divided into SHR group ( n = 10) and RNAi group ( n = 10), eight Wistar-Kyoto rats were set as control. At the end of RNA interference procedure, all the rats were sacrificed and the kidneys were harvested. The mRNA and plasmosin of CTGF and fibronectin(FN) of renal tissue were extracted and measured by RT-PCR and Western Blotting. And the localization of CTGF and FN were analyzed with immunohistochernistry technique. The collagen deposition(shown as collagen volume traction, CVF) were evaluated with 0.1% sirius-picric staining, and the hydroxyproline of myocardium were detected by colorimetry. Results The mRNA and protein expression of CTGF decreased 66% and 62% in RNAi group (P < 0.01). The mRNA and protein expression of FN decreased 56% and 51% in RNAi group.The same inhibition effect was observed by hislological analysis. Immuno-histochemistry showed that CTGF localized both in renal parenchyma and renal interstitium, whereas FN majorly expressed in renal interstitium. Observation with light microscope showed that collagen deposition(CVF)decreased sharply in RNAi group versus SHR group. And the same effect was viewed in hydroxypnoline assay[SHR group: (0.596 ± 0.067) μg/mg, RNAi group: (0.368±0.084) μg/mg, P < 0.01 ] .Further study by polarized microscope displayed that RNA interference mainly suppressed type I collagen synthesis. Conclusions Targeted inhibition of CTGF by RNA interference leads significant decrease of extracellular matrix deposition in kidney. And the anti-fibrotic effect independent of lower the blood pressure. This study indicated CTGF take a key role in the development and progress of renal fibrosis.     

RNA干扰选择性下调血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的表达

目的:从血管平滑肌细胞结缔组织生长因子的基础分泌及转化生长因子β1对其分泌的诱导作用入手,进一步观察并验证RNA干扰技术靶向抑制结缔组织生长因子对下游纤维化因子的影响。方法:实验于2006-03/2007-05在武汉协和医院心血管病研究所实验室完成。①实验材料:健康雄性成年SD大鼠,体质量150～180g。②实验方法及分组:分离培养成年大鼠血管平滑肌细胞,以5μg/L终浓度转化生长因子β1对培养的血管平滑肌细胞进行诱导,再通过脂质体法将靶向大鼠结缔组织生长因子的shRNA干扰质粒转染入血管平滑肌细胞,200mg/L终浓度的G418筛选出稳定转染细胞株后培养增殖进入后续实验。将实验分为5组,分别为对照组,不给与任何干预措施;转化生长因子β1刺激组,在培养的血管平滑肌细胞培养液中加入转化生长因子β1(5μg/L终浓度)刺激诱导24h;HK阴性质粒对照组,血管平滑肌细胞常规培养3～5代后转染HK阴性质粒继续培养48h;RNA干扰组,先以转化生长因子β1(5μg/L终浓度)诱导刺激血管平滑肌细胞24h后再转染干扰质粒继续培养48h;单纯转染试剂组,细胞常规培养3～5代后仅加入lipo2000转染试剂。③实验评估:通过逆转录-聚合酶链反应和(或)蛋白免疫印迹技术进一步检测各组心肌细胞结缔组织生长因子、纤维连接蛋白mRNA及蛋白的表达。结果:①组织块贴附法培养的原代血管平滑肌细胞,可见大量细胞紧密排列成长梭形。②倒置荧光显微镜下观察,脂质体lipo2000转染血管平滑肌细胞瞬时转染效率仅有大约30%左右;而通过加入G418进行稳定转染后,几乎所有细胞均可被激发出亮绿色荧光,转染效率可达95%以上。③对照组结缔组织生长因子、纤维连接蛋白均有低水平的基础分泌,在予以转化生长因子β1诱导后表达显著升高(P<0.01);而在靶向特异性RNA干扰后,与转化生长因子β1刺激组比较,结缔组织生长因子及纤维连接蛋白的表达均被显著抑制(P<0.01);并且纤维化因子纤维连接蛋白及胶原的表达与促纤维化因子结缔组织生长因子的表达有显著相关性。结论:血管平滑肌细胞可自主分泌结缔组织生长因子及细胞外基质成分;而通过RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子后可阻抑血管平滑肌细胞分泌下游纤维化因子。提示血管平滑肌细胞可主动参与心血管重塑及纤维化,而RNA干扰靶向沉默结缔组织生长因子基因的表达可以有效干预纤维化过程。     

抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA对大鼠肝纤维化的影响

目的观察抗结缔组织生长因子小分子干扰RNA(CTGF siRNA)对大鼠肝纤维化肝脏功能及肝纤维化指标的影响。方法雄性SD大鼠30只,随机分成5组,即空白对照组、模型组、治疗组、预防组及晚期治疗组,检测各组肝功能及肝纤维化指标,并对肝脏进行组织学检测。结果与模型组相比,预防组及治疗组肝组织炎症、坏死及纤维化明显减轻,血清氨基转移酶、总胆红素、肝纤维化指标水平降低,清蛋白升高(P<0.05)。晚期治疗组与模型组相比肝组织炎症、坏死及纤维化减轻,血清、总胆红素、肝纤维化指标水平降低,清蛋白升高(P<0.05)。结论经尾静脉注射抗CTGFsiRNA可有效防治大鼠肝纤维化,改善大鼠肝脏功能,且对已发生的肝纤维化也具有一定的疗效,提示抗CTGFsiRNA将成为抗肝纤维化治疗的新策略。     

结缔组织生长因子与LPS致肝纤维化的关系

目的：研究结缔组织生长因子(CTGF)表达水平与LPS致大鼠肝纤维化的关系。方法：体外培养条件下,LPS处理大鼠肝星状细胞(HSC),半定量RT-PCR方法检测不同时点不同LPS浓度处理的HSC FN mRNA和CTGF mRNA的表达水平。结果：LPS不仅短时间内即能上调HSC FN mRNA和CTGF mRNA表达,而且LPS与CTGF mRNA的表达量呈一定的剂量效应关系。恒定LPS作用浓度(1μg／ml)下,CTGF mRNA的表达水平随LPS作用时间的增加而增加,LPS作用24h-48h后CTGF mRNA的表达水平最高。结论：LPS是一个重要的致纤维化因素,可同时上调HSC的FN mRNA和CTGF mRNA表达。CTGF在LPS介导的肝纤维化的病理生理过程中可能发挥着重要的作用。     

结缔组织生长因子与器官纤维化

目的:通过综述结缔组织生长因子的研究现状,探讨结缔组织生长因子与器官纤维化的关系。资料来源:应用计算机检索美国NCBI PubMed数据库1988-01/2006-12相关结缔组织生长因子与器官纤维化方面的文献,检索词“connective tissue growth factor,fibrosis”,限定文献语言种类为English。资料选择:对资料进行初审,选取包括结缔组织生长因子与器官纤维化的文献,开始查找全文。纳入标准:具有原创性,论点论据可靠的实验文章。观点明确,分析全面的综述文章。文献主体内容与本课题联系紧密的文章。排除标准:具有明显实验设计和结果错误的文章及观点模糊的综述。质量评价主要考察资料的真实性、实施过程是否严密。资料提炼:共检索到336篇关于结缔组织生长因子与器官纤维化的文献,最终纳入32篇符合标准的文献。资料综合:结缔组织生长因子基因是即刻早期基因家族成员,可刺激细胞增殖、分化和凋亡、促进细胞外基质沉积、介导细胞粘附、刺激细胞迁移、促进胚胎发育、损伤修复及新血管的生成。在病理状态下,结缔组织生长因子作为转化生长因子β的下游因子在多种纤维化疾病的发生和发展中起重要作用。文章分别阐明了结缔组织生长因子及其超家族成员、结缔组织生长因子基因和蛋白质结构、受体、功能和生物学作用、致纤维化作用和与其相关的防纤维化策略。结论:通过抑制结缔组织生长因子的表达有望阻断和逆转纤维化进程。     

结缔组织生长因子在肝纤维化发生中的作用机制初探

目的:观察结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在人及大鼠纤维化肝组织中的表达,探讨CTGF及其介导的生物学信号在肝纤维化发生中的作用机制。方法:雄性SD大鼠32只,皮下注射CCl_4制备大鼠肝纤维化模型,分别于注射后1、4、8用处理动物并收集肝组织标本;44例人肝组织(12例正常肝组织、32例慢性病毒性肝炎和肝硬化组织)来自外科手术切除的诊断明确的病理存档标本。采用免疫组化方法对检测肝组织中CTGF的表达及分布。结果:免疫组化显示．CTGF主要表达于大鼠肝星状细胞(HSC)及肝细胞胞质中。CCl_4注射诱导后,大鼠肝组织中CTGF的表达较正常对照明显增强(P＜0．01或P＜0．05),且CCl_4注射1、4、8周组肝组织中CTGF的表达强度呈明显递增的趋势(P＜0．01或P＜0．05)。在人肝纤维化组织中,CTGF亦主要表达于HSC胞质及部分肝细胞胞质中,CTGF表达水平显著高于人正常肝组织(P＜0．01)。结论:CTGF作为一种促纤维化因子,其过表达主要促进HSC的增殖活化,促进细胞外基质的形成,从而参与肝纤维化的发生、发展。     

结缔组织生长因子和糖尿病肾病

随着社会经济的发展,糖尿病正在日益成为威胁人类健康的主要杀手,在终末期肾功能衰竭的患者中,糖尿病肾病(DN)所占比例逐年增加。细胞外基质(ECM)堆积是DN病理损害的关键,ECM降解及合成失调是肾小球硬化发生重要因素。DN发病机理复杂,近年来临床和动物实验证明许多细胞生长因子     

RNA干扰的研究方法

ＲＮＡ干扰 (ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ,ＲＮＡｉ)现象是由与靶基因序列同源的双链ＲＮＡ (ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｅｄＲＮＡ ,ｄｓＲＮＡ)引发的广泛存在于生物体中的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶Ⅲ家族成员之一的ｄｓＲＮＡ特异性的核酸酶Ｄｉｃｅｒ将ｄｓＲＮＡ裂解成 2 1～ 2 5个核苷酸组成的小的干涉ＲＮＡ(ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ ,ｓｉＲ ＮＡ)作为介导子 ,引起相同序列特异性的ｍＲＮＡ降解。ＲＮＡｉ现象是细胞中固有的消除大量的异常ｍＲＮＡ和抵御分子“寄生虫”(如病毒、转…     

结缔组织生长因子在特发性肺纤维化患者肺组织的表达及意义

目的:研究结缔组织生长因子(CTGF)在特发性肺纤维化(IPF)患者肺组织的表达及意义。方法:IPF组的肺组织标本来自35例IPF患者,对照组的正常肺组织标本来自30例肺叶切除术。用原位杂交结合免疫组化方法检测CTGFmRNA及其蛋白的表达,用免疫组化方法检测纤维连接蛋白(Fn)的表达。结果:IPF组CTGFm-RNA及其蛋白以及Fn的阳性面积百分比均高于对照组(P均<0.001);IPF组CTGFmRNA及其蛋白在增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞、肺泡巨嗜细胞和肺间质成纤维细胞中的表达强度均高于对照组(P均<0.001),在细支气管上皮细胞中的表达无差异(P>0.05);IPF组CTGFmRNA及其蛋白的阳性面积百分比与Fn阳性面积百分比之间呈正相关。结论:IPF患者肺组织CTGFmRNA及其蛋白表达增高,并主要定位于Ⅱ型肺泡上皮细胞、肺泡巨嗜细胞和间质成纤维细胞,CTGF可能通过促进Fn的合成而在IPF中发挥作用。     

原发性肝细胞肝癌患者血清CTGF测定的临床意义

目的:探讨原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血清结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)水平的变化及临床意义。方法:采用酶联免疫吸附法检测384例HCC患者、126例慢性肝病患者及102名健康对照者的血清CTGF水平,并分析血清CTGF水平与HCC的TNM分期、肿瘤直径、AFP分级间的关系。结果:HCC患者的血清CTGF水平明显高于正常对照者(P<0.001),亦高于慢性肝病患者(P     

肾间质纤维化中结缔组织生长因子（CTGF）与肾小管上皮细胞表型转化的关系

目的研究肾间质纤维化过程中CleF与肾小管上皮细胞表型转化的关系方法采用免疫组化方法,检测各组肾活检标本CTGF和α-SMA的表达。结果CTGF主要表达于肾小管上皮细胞和一些肾间质细胞胞浆,并且随间质病变的加重,表达量增加,范围增大;α-SMA在病变肾间质区域表达增强,一些管腔破坏和萎缩的肾小管上皮细胞也可见表达,阳性分布区域与CTGF相似。肾小管间质中CTGF、α-SMA表达量之间呈正相关,CTGF和α-SMA表达量与肾间质纤维化病变程度呈正相关关系。结论CTGF可能通过促进间质中肌成纤维细胞的形成而参与肾间质纤维化的形成,CTGF的表达上调对肾脏疾病有预后价值。     

PAMAM纳米载体介导pCTGF-shRNA抑制小鼠腹膜间皮细胞CTGF的表达

目的研究G9PAMAM纳米载体介导的结缔组织生长因子（CTGF）短发夹RNA（shRNA）质粒（pCTGF-shRNA）对小鼠腹膜间皮细胞CTGF表达的影响。方法设计并构建质粒pCTGF1-shRNA、pCTGF2-shRNA和阴性对照pHK-shRNA；应用G9PAMAM将质粒分别转染4．25％葡萄糖刺激下的第3代小鼠腹膜间皮细胞；采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）检测细胞CTGFmRNA水平，采用WesternBlot检测CTGF蛋白含量。结果4．25％葡萄糖可刺激小鼠腹膜间皮细胞CTGF的mRNA和蛋白表达明显上调。pcTGF1-shRNA转染组和pCTGF2-shRNA转染组的CTGF表达较高糖组明显下调（P〈0．05），尤其以pCTGF2-shRNA组显著。pHK-shRNA转染组与高糖组比较，差异无显著性（P〉0．05）。结论G9PAMAM纳米载体可介导pCTGF-shRNA转染原代小鼠腹膜间皮细胞，并能抑制高糖诱导的CTGF表达上调，提示PAMAM介导的pCTGF-shRNA可有效地用于腹膜纤维化的基因治疗。     

绞股蓝总皂甙对单侧输尿管结扎大鼠肾组织结缔组织生长因子表达的影响

目的:研究绞股蓝总皂甙(GPs)对单侧输尿管结扎(UUO)大鼠肾组织结缔组织生长因子(CTGF)表达及肾间质纤维化的影响。方法:采用UUO大鼠模型,将大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、GPs组、缬沙坦组。假手术组和模型组仅给予标准饲料30g,GPs组和缬沙坦组于术前3d至术后9d每天分别给予GPs200mg/(kg·d)、缬沙坦24mg/(kg·d)灌胃,第9天处死各组大鼠。免疫组化法检测各组肾组织CTGF、转换生长因子β1(TGF-β1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;RT-PCR方法检测各组CTGFmRNA含量;Masson染色评定各组肾小管间质损害程度。结果:模型组CTGF、TGF-β1、α-SMA的表达及肾小管间质损伤指数明显高于假手术组(P<0.01),而GPs组和缬沙坦组各项指标明显低于模型组(P<0.01);GPs组与缬沙坦组差异无显著性(P>0.05)。各项指标作相关分析,CTGF与肾小管间质损伤指数(r=0.756,P<0.01)、TGF-β1(r=0.879,P<0.01)、α-SMA(r=0.892,P<0.01)为正相关关系。结论:GPs可以抑制肾纤维化时CTGF表达,从而...     

阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的防治作用

目的 观察阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型肾间质纤雏化的作用及机制。方法 采用单侧输尿管结扎术致肾间质纤雏化大鼠模型，将大鼠随机分为3组：假手术组、UUO模型组、阿托伐他汀治疗组。手术后第1、4、7、10、14天处死大鼠，经HE染色、PAS染色、天狼星红染色，免疫组化、Western蛋白印迹分析方法，观察各组α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、结缔组织生长因子、低密度脂蛋白受体相关蛋白及肾小管间质损伤指数。结果 UUO模型组平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、结缔组织生长因子、低密度脂蛋白受体相关蛋白的表达及肾小管损伤指数均明显高于假手术组（P〈0．01），而阿托伐他汀治疗组明显低于模型组（P〈0．01）。结论 结缔组织生长因子、低密度脂蛋白受体相关蛋白与肾间质纤雏化进展相一致；阿托伐他汀减少单侧榆尿管梗阻侧大鼠肾脏低密度脂蛋白受体相关蛋白的表达，下调单侧榆尿管梗阻侧大鼠肾脏Ⅰ型胶原、平滑肌肌动蛋白的表达，阿托伐他汀通过非降脂途径延缓UUO所致大鼠肾间质纤维化的程度。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对胰腺癌细胞基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子表达及细胞增殖与侵袭的影响

目的 通过研究结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸(ASODN)对人胰腺癌细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)表达及细胞增殖与侵袭力的影响,深入探讨CTGF在胰腺癌发生、发展中的作用机制,为CTGF ASODN在胰腺癌基因治疗中的运用奠定理论基础.方法 经脂质体介导将CTGF ASODN转染人胰腺癌细胞株SW1990,荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测转染细胞CTGF、MMP-9与VEGF mRNA与蛋白表达;噻唑盐(MTT)比色法检测转染细胞的增殖活性;采用Transwell小室检测细胞侵袭能力.结果 (1)荧光显微镜及流式细胞仪检测显示CTGF ASODN可成功转染SW1990细胞.(2)反义组、无义组和单加脂质体组细胞CTGF mRNA表达量分别为0.24±0.09、0.67±0.21、0.63±0.18,反义组较其他组的mRNA表达明显减少(P<0.01);相应的CTGF蛋白表达量分别为0.19±0.07、0.75±0.26、0.71±0.23;相应的MMP-9 mRNA表达量分别为0.21±0.12、0.78±0.35、0.81±0.37;相应的VEGF mRNA表达量分别为0.16±0.06、0.42±0.22、0.43±0.28;相应的MMP-9蛋白表达量分别为0.68±0.22、1.97±0.46、1.92±0.39;相应的VEGF蛋白表达量分别为0.27±0.07、0.52±0.19、0.55±0.18,反义组CTGF、MMP-9和VEGF的表达较其他组显著降低(P<0.01).(3)反义组、无义组、单加脂质体组细胞增殖活性分别为1.67±0.14、2.34±0.17、2.29±0.21,反义组较其他组细胞增殖被显著抑制(P<0.01).(4)反义组、无义组、单加脂质体组微孔滤膜外侧细胞数分别为24.88±6.17、52.37±8.62、55.49±8.83,反义组较其他组微孔滤膜外侧细胞数显著减少(P<0.01).结论 CTGF ASODN转染可有效抑制SW1990细胞CTGF的表达,并降低其MMP-9、VEGF的表达及细胞增殖活性与细胞侵袭力.     

糖基化终末产物对大鼠海马结缔组织生长因子与炎症因子表达的影响

目的探讨糖基化终末产物（AGEs）对大鼠海马区结缔组织生长因子（CTGF）与炎症因子白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）表达的影响及其可能的机制。方法 50只Wistar大鼠随机分为5组（每组10只）,各组用微量注射泵海马内注射法制造动物损伤模型。3周后：通过免疫组织化学检测各组大鼠海马转化生长因子β1（TGF-β1）、CTGF表达;通过Westernblot检测大鼠海马TGF-β1、CTGF以及炎症因子IL-1β和TNF-α表达并进行蛋白半定量分析。结果在AGE-BSA组大鼠的大脑海马区神经元内TGF-β1、CTGF着色呈棕黄色,颜色灰度明显高于正常对照组;AGE-BSA组TGF-β1、CTGF、IL-1β和TNF-α蛋白表达明显高于正常对照组（P〈0.01）;与AGE-BSA组比较,RAGE中和抗体组TGF-β1、CTGF、IL-1β和TNF-α蛋白表达明显减少（P〈0.05）。结论糖基化终末产物通过与其受体（RAGE）结合促进TGF-β1的表达上调,进而导致海马区神经元内CTGF的高表达,而且可以造成炎症因子IL-1β和TNF-α表达增多。