抑制Smad3的pSUPER RNAi系统的构建和活性鉴定

目的:构建抑制Smad3的shRNA表达载体.方法:化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向Smad3的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到经BgL Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切同时经牛小肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,CIP)处理后的pSUPER载体的poly Ⅲ H1启动子的下游,重组构建RNA干扰(RNA induced interference,RNAi)质粒,同时设立错义寡核苷酸作为非特异性对照.并将所构建的pSUPER Smad3转染到人类肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC),检测其抑制效果.结果:重组构建的pSUPER Smad3载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.体外活性鉴定表明其能成功地抑制Smad3的基因和蛋白表达,却不影响Smad2的表达.结论:载体成功构建,其在体外抑制效率高,且特异性好.     

突变型P53的pSUPER-EGFP1 RNAi系统的构建

目的构建抑制突变型p53基因siRNA表达载体。方法化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向突变型p53基因的寡核苷酸(各58个碱基),退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切后的pSUPER-EGFP1(pSG)载体的polⅢH1启动子的下游,重组构建RNAi质粒,同时设立非特异对照。构建好的干扰载体瞬时转染胃癌细胞SGC-7901,用RT-PCR检测其对突变型p53基因的抑制效果。结果重组构建的pSUPER-EGFP1-p53(pSG-p53i)载体经双酶切电泳分析及插入基因序列分析,58个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。RT-PCR显示pSG-p53i对突变型p53基因的表达具有较好的瞬时抑制作用。结论载体的成功构建,有助于深入研究其对突变型p53基因的稳定抑制作用。体内合成siRNA的方法,可将RNAi技术用于细胞培养和哺乳动物研究。     

siRNA介导表皮生长因子受体基因沉默导致HepG2凋亡

目的：研究含有与EGFR基因序列相同的19nt序列RNAi质粒针对HepG2细胞表皮生长因子受体的RNA干扰效果。方法：用pSIREN-hE转染细胞,其质粒骨架为RNAi-Ready pSIREN-Shuttle Vector,含有可以被U6启动子转录成shRNA的寡核苷酸链,大小为69nt,含有2段19nt的寡核苷酸,用于编码EGFR基因的RNA干扰的siRNA的正义链及反义链,评价该RNAi质粒对人肝细胞癌细胞株（HepG2）EGFR基因的mRNA表达抑制效果及对细胞凋亡的作用。结果：HepG2细胞EGFR基因的mRNA被明显抑制并伴有凋亡增加。结论：含有与EGFR基因序列相同序列RNA质粒对EGFR基因的RNA干扰可能是治疗肝细胞癌的一种有效手段。     

抑制人血管内皮生长因子C表达的shRNA逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建抑制人血管内皮生长因子C(VEGF-C) 基因表达的RNA干扰(RNAi)逆转录病毒表达载体pSIREN-VEGF-C.方法:根据GenBank中VEGF-C序列,设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后用T4连接酶与线性化的pSIREN载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,抽提质粒,获得重组pSIREN-VEGF-C质粒;BglⅡ和EcoRⅠ双酶切、测序鉴定.结果:重组质粒经双酶切,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致;测序显示序列完全正确.结论:成功构建了表达人VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C.     

RNA干扰EGFR基因对卵巢癌细胞放疗敏感性影响的实验研究

目的:构建针对表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)基因的小于扰RNA(Small interference RNA,siRNA)质粒,转染人卵巢癌SKOV3细胞株后,检测RNA干扰(RNA interference,RNAi)对EGFR基因表达及评估细胞对放疗敏感性的影响.方法:体外构建EGFR小发卡状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)的表达质粒,脂质体法转染入SKOV3细胞及G418筛选阳性克隆.实验随机分为阳性RNA干扰组(A组)、阴性RNA干扰组(B组)、空白对照组(C组).采用RT-PCR、Western Blot技术检测EGFR mRNA及其蛋白质的表达情况.分别给予不同放射剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射,MTF法绘制细胞存活曲线.结果:靶向EGFR的序列特异性shRNA可明显抑制EGFR基因的表达,EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为77.5%和76.1%;序列特异性shRNA-EGFR可明显提高SKOV3细胞对放疗的敏感性,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:体外研究表明RNAi沉默EGFR基因可以提高卵巢癌SKOV3细胞对放疗的敏感性.     

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.     

大鼠血管内皮生长因子shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制角膜新生血管的研究做准备.方法:用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pSihncer2.0 U6中,进行酶切鉴定和测序.结果:酶切证明构建的shRNA序列已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠VEGF shRNA表达质粒.结论:成功构建了3条大鼠VEGF shRNA真核表达质粒,为靶向VEGF的RNAi抑制角膜新生血管奠定了基础.     

VEGF基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建干扰血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因RNA表达的重组质粒。方法设计3组针对VEGF基因的核糖核酸干扰（RNA interference,RNAi）序列,应用基因重组技术克隆入载体pcDNA3.1中,重组质粒分别命名为pcDNA3.1-VEGF-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,用DNA直接测序法和双酶切法鉴定构建的重组质粒。结果 DNA测序证实克隆入载体pcDNA3.1（-）中的序列正确,双酶切证实RNA干扰序列正确插入载体pcDNA3.1（-）。结论成功构建针对VEGF基因的RNAi质粒,为进一步研究该RNAi质粒在脉络膜新生血管形成中的作用奠定了基础。     

靶向端粒酶调节相关基因TRAP siRNA表达载体的构建

目的构建靶向端粒酶调节相关基因TRAP的siRNA表达载体。方法根据siRNA设计原则,设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列、靶向端粒酶调节相关基因TRAP的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到线性化的pSilencerTM21u6neo质粒U6启动子下游重组构建RNAi质粒。结果重组质粒pSilencerTM21u6neoTRAP经过插入片段基因序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预定位子,并且序列完全一致。结论成功构建靶向TRAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究TRAP在调控hTERT的表达、降低端粒酶活性和肿瘤的基因治疗方面的作用做了基础。     

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定

目的 构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的RNA干扰（RNAi）表达载体。方法 化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到pSilencer1．0-U6 shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）启动子的下游，构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。结果 经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。结论 已成功构建pSliencer-hTERT载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。     

短发夹RNA靶向抑制EGFR基因对人卵巢癌Skov-3细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对卵巢癌细胞表皮生长因子受体(EFR)基因表达的影响及其效应.方法 体外合成EFR的DNA模板序列和pSilencer 2.1-U6neo质粒构建编码shRNA的表达载体,应用脂质体Lipofectamine 2000将其转染到人卵巢癌Sov-3细胞,采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学技术检测转染前后Sov-3细胞EFR基因的变化;采用AnnexinV/PI双染色标记的流式细胞仪检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞.结果 成功构建pSilencer-EFR短发卡状siRNA真核表达载体;靶向EFR的序列特异性的siRNA可以有效抑制Sov-3细胞EFR基因的表达;流式细胞分析显示,Sov-3细胞凋亡率明显增加,细胞周期出现明显的0/1期阻滞.结论 RNAi沉默EFR表达可以诱导卵巢癌Sov-3细胞凋亡,并使卵巢癌Sov-3细胞停滞在0/1期,RNAi可作为研究卵巢癌发生发展机制和基因治疗的有效工具.     

人组织因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的:利用RNA干扰(RNAi技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建特异性的RNA干扰真核细胞表达载体.方法:根据GenBank提供的人TF基因的核苷酸序列,设计具有小发夹结构的2条DNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至干扰载体pSUPER质粒中,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,最后进行DNA测序.结果:构建成功的针对人TF基因的RNA干扰真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计序列完全一致.结论:成功构建了针对人TF基因的真核载体,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新方法.     

Dll4基因靶向RNAi重组腺相关病毒载体的构建和高滴度病毒制备

目的：构建一个表达肿瘤血管生成调节基因Delta-like ligand4（Dll4）小干扰RNA的重组腺相关病毒载体,制备靶向性抑制Dll4表达的高滴度重组腺相关病毒。方法：将包含肿瘤血管生成调节基因Dll4特异性小干扰RNA片段的质粒用EcoRI＋SalI双酶切,回收目的片段,将pSNAV2.0质粒用EcoRI＋SalI双酶切后同目的片段连接,脂质体法转染BHK-2l细胞,G418筛选后以辅助病毒感染获取病毒。结果：PCR和测序证实,成功构建包含U6启动子和肿瘤血管生成调节基因Dll4特异性RNA干扰片段的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为2.4×10^11 vectorgenome/L高滴度腺相关病毒。结论：成功构建携带Dll4基因短发夹状干扰RNA的腺相关病毒载体。为下一步探索抗肿瘤血管生成基因治疗的新途径提供实验基础。     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

人类心脏发育候选基因KLHL31RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类心脏发育候选基因KLHL31表达的pSUPER RNAi载体( pSUPER-KLHL31).方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向心脏发育候选基因KLHL31的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、Xho Ⅰ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pS...     

人GLUT3基因RNA干扰病毒载体的构建与鉴定

目的：筛选出人GLUT3基因有效的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列,并构建出慢病毒RNAi载体。方法：根据GLUT3基因mRNA序列设计合成siRNA片段4个,分别定向克隆至pLV-shRNA载体上,并将构建的质粒转染HeLa细胞,运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测GLUT3mRNA的表达量验证其干扰效果。筛选出其中有效的质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒,测定病毒颗粒滴度后,将病毒感染U251胶质瘤细胞以测定感染慢病毒干扰载体后胶质瘤细胞内GLUT3的表达情况。结果：重组RNAi质粒pLV-shRNA-GLUT3-1,pLV-shRNA-GLUT3-2,pLV-shRNA-GLUT3-3,pLV-shRNA- GLUT3-4经测序证实质粒载体构建成功;4个干扰质粒在HeLa细胞中均可以明显抑制GLUT3-mRNA的表达。pLV-shRNA-GLUT3可以在293T细胞中成功包装。收集293T细胞分泌的病毒上清浓缩后测定病毒颗粒LV-GLUT3滴度为1.5×109 TU/mL。与感染阴性对照慢病毒颗粒(0.3641±0.044)相比,胶质瘤U251细胞感染慢病毒颗粒LV- GLUT3后,GLUT3蛋白相对表达明显降低(0.108±0.016,t=16.267,P<0.001)。结论：成功构建了人GLUT3基因有效的慢病毒RNAi载体,为进一步研究GLUT3的生物学功能奠定了基础。