CDglyTK融合自杀基因杀伤喉癌Hep-2细胞的体外实验研究

目的：研究融合自杀基因CDglyTK联合前体药物对喉癌Hep-2细胞的杀伤效应。方法：构建质粒表达载体pcDNA3．1（-）CMV．CDglyTK,XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定,测序分析CDglyTK基因序列。电穿孔法将重组质粒转染Hep-2细胞,400mg／LG418筛选14d获得稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞,RT—PCR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。以转染空白载体pcDNA3．1（-）的Hep-2细胞为对照,MTT法观察5-FC、GCV、5-FC加GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果：酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因,RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段,Western-blotting检测到该基因表达的分子量为59000的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5-FC、GCV、5-FC加GCV干预下生长受到抑制,5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论：CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。     

自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.TK在鼻咽癌细胞中的构建及转染研究

目的 构建含TK自杀基因的质粒表达载体并进行转染研究。方法 根据已发表的Hsv-TK基因的核苷酸序列，设计并合成一对引物，以含TK基因的PGEM/TK质粒为模板扩增出TK基因全长CDS序列，将其克隆到质粒表达载体pcDNA3．1(-)CMV中，进行序列分析和酶切鉴定后，运用电穿孔法将重组体pCDNA3．1(-)CMV-CD车专人鼻咽癌CNE-2细胞中，观察其表达情况以及无毒前体药物GCV干预下对CNE-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和序列分析证明pcDNA3．1(-)(2MV．TK含完整的TK基因序列，RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出预期片段；鼻咽癌CNE-2细胞在无毒前体药物GCV干预下，其生长受到抑制。结论 成功构建了质粒载体pcDNA3．1(-)CMVTK，可以将其作为鼻咽癌自杀基因治疗的一种载体。     

自杀基因载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用的研究

目的检测pcDNA3.1-Egr-CD（简写为pEC）、pcDNA3.1-hTERT-Survivin（简写为pTS）、pcDNA 3.1-Egr-CD-hTERT-Survivin（简写为pEC-TS）真核表达载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用。方法 pEC、pTS、pEC-TS真核表达载体分别转染CNE-2细胞,在放射线照射后用RT-PCR检测和比较胞嘧啶脱胺酶（CD）、Survivin基因的表达,并通过高效液相色谱（HPLC）检测前体药物5-FC转化成5-FU转化效率。结果检测发现用pEC、pEC-TS转染的CNE-2细胞中CD有效表达,HPLC检测前体药物5-FC转化成5-FU;pTS、pEC-TS转染的CNE-2细胞中Survivin基因表达明显降低。结论在CNE-2细胞转染pEC-TS载体后,CD基因能将5-FC转化成5-FU,并通过hTERT启动子特异性降低Survivin基因的表达,有效的提高了CNE-2肿瘤细胞对5-FU的敏感性;为鼻咽癌基因治疗提供了一种新的思路。     

胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶-磷酸核糖基转移酶融合基因/5-氟胞嘧啶治疗鼻咽癌的实验研究

目的研究胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖基转移酶融合基因/5-氟胞嘧啶(fusion cytosine deaminase- uracil phosphoribosyl transferase gene/5-Flurocy- tosine,FCU/5-FC)对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应以及对鼻咽癌移植瘤生长的抑制作用。方法构建表达质粒载体pcDNA3．1(-)CMVe·Egr-1·FCU,BamHⅠ酶切鉴定重组质粒,分析FCU基因和融合启动子CMVe·Egr-1的序列。电穿孔法将重组质粒转染CNE-2细胞,300μg/ml～600μg/mlG418筛选14天获得稳定表达FCU基因的CNE-2细胞,RT-PCR鉴定FCU基因的表达。以转染空白载体pcDNA3．1(-)的CNE-2细胞为对照,MTT法观察5-FC对表达FCU基因的CNE-2细胞生长的抑制作用,考察FCU基因的细胞旁杀效应。5×10~6的CNE-2细胞接种裸鼠右腋下,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,12天后将裸鼠随机分成3组：CU组,CU+PBS组和CU+5-FC组,观察不同处理对移植瘤生长的抑制作用。结果酶切和序列分析证明重组质粒含完整的FCU基因和Egr-1启动子的核心序列,RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出330bp的预期片段。表达FCU基因的CNE-2细胞在5-FC干预下,生长受到抑制。随着表达FCU基因的细胞比例增加,细胞存活率相应地下降。CU组,CU+PBS组移植瘤体积与CU+5-FC组有显著性差异(P＜0．05)。结论表达FCU基因的CNE-2细胞可以被5-FC杀伤,FCU/5-FC系统抑制了移植瘤生长,为治疗鼻咽癌提供了新的策略。     

HNP1基因转染对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长影响的实验研究

目的:观察人α-防御紊HNP1基因对人鼻咽癌细胞株HNE-1生长的影响,探讨其在裸鼠鼻咽癌移植瘤生长中的作用.方法:HNP1基因通过脂质体介导转染人鼻咽癌HNE1细胞株,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察对HNE-1细胞的细胞毒性作用,将筛选的含pcDNA3.1( )-HNP1质粒的HNE-1细胞和空pcDNA3.1( )质粒的HNE-1细胞以及单纯的HNE-1细胞培养、收集后分别注射于8周龄雌性BALB/c裸鼠的右侧腹壁皮下,观察肿瘤生长速度,免疫组织化学检测α-防御素1在肿瘤组织中的表达.结果:HNP1基因转入鼻咽癌HNE-1细胞后能成功地表达有活性的α-防御素1,MTT实验证实有细胞毒作用,转染HNP1基因组裸鼠较对照组肿瘤生长速度慢,体积小.结论:通过转基因方法能表达有活性的α-防御素1并能抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生长.     

VEGF-C真核表达载体的构建和体外表达

目的构建血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因的真核表达载体,检测其在真核细胞CHO中的表达.方法根据人VEGF-C cDNA的序列,设计合成一对特异性引物,用RT-PCR法克隆乳腺癌细胞MCF-7VEGF-C基因的cDNA,回收PCR产物连接于克隆载体.扩增,质粒提取,酶切鉴定并进行基因序列鉴定.酶切回收VEGF-C cDNA全长的基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接称重组质粒进行酶切鉴定.采用脂质体转染法将构建的pcDNA3.1(-)/VEGF-C转染至CHO细胞中,G418加压筛选培养.最后用Western-blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF-C蛋白.结果基因测序证实RT-PCR产物包含VEGF-C cDNA全长.重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF-C cDNA全长序列,Western-blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在.结论成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达.     

热休克蛋白90β(HSP90β)真核表达载体的构建及体外表达

目的克隆人热休克蛋白90β(HSP90β)基因,构建其真核表达载体pcDNA3.1( )/hHSP90β,并检测其在体外的表达情况,为下一步研究鼻咽癌中HSP90β功能奠定基础。方法提取鼻咽癌总RNA,并经RT-PCR获得hHSP90βcDNA。用纯化的hHSP90βcDNA与PGEM Easy T Vector连接,构建中间载体PGEM-hHSP90β。将PGEM-hHSP90β及pcDNA3.1( )质粒经AflII和Xbal双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,构建hHSP90β真核表达载体pcDNA3.1( )/hHSP90β。经酶切和测序后,用脂质体包裹转染COS细胞,采用RT-PCR和Western blot检测HSP90β的表达。结果酶切及测序鉴定表明,hHSP90β与pcDNA3.1( )体外重组成功,命名为pcDNA3.1( )/hHSP90β。该表达质粒在体外转染COS细胞后可表达HSP90β分子。结论采用体外重组技术,成功地将人HSP90β插到了真核表达载体pcDNA3.1( )中;pcDNA3.1( )/hHSP90β表达质粒能在体外表达HSP90β分子。     

质粒载体介导CD基因对喉癌细胞的杀伤作用研究

目的构建含酵母菌自杀基因CD的质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,并利用该载体进行喉癌Hep-2细胞株转染研究,体外实验观察前体药物5-FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞株的杀伤作用.方法通过RT-PCR从酵母菌RNA内扩增出CD基因全长CDS序列,将其定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV中,重组体质粒经XhoI/HindⅢ双酶切鉴定,并对重组体中的CD基因片段进行序列分析,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD运用电穿孔法转入喉癌Hep-2细胞中.经300～600 μg/mlG418正筛选14 d和10 μg/ml前体药物5-FC负筛选,获得稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞株,提取该细胞株细胞的总RNA,经RT-PCR鉴定CD基因的表达.MTT法观察不同浓度5-FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞及转染空白载体pcDNA3.1(-)CMV的对照组喉癌Hep-2细胞的杀伤作用.结果阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD经XhoI/HindⅢ双酶切后获得5353 bp的片段及496 bp的插入片段,DNA自动序列分析证明重组体质粒含完整的477 bp长的CD基因CDS序列.RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出453 bp的预期片段.当添加不同浓度的5-FC时,表达CD基因的Hep-2细胞不同程度地被杀死,而对照组的细胞几乎未受到影响,两组细胞的相对生存率具有显著差异性(P<0.05).结论成功构建了质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,建立了稳定表达酵母菌CD基因的喉癌表达CD基因的Hep-2细胞株,表达CD基因的Hep-2细胞可以被5-FC杀死.     

葡萄糖调节蛋白78上调MMP-2和MMP-9促进鼻咽癌细胞CNE1的增殖与侵袭

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）对鼻咽癌细胞CNE1的增殖与侵袭的作用机制。方法 收集2018年6月—2019年6月手术切除病灶的56例经病理确诊鼻咽癌患者的肿瘤组织作为鼻咽癌组织的研究对象,男40例,女16例;均为初次确诊鼻咽癌,并且尚未经过放/化疗干预。另同期选取进行治疗的50例慢性鼻咽炎组织作为比对,男38例,女12例。用免疫组化分别检测鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中GRP78的表达。CNE1细胞实验分为对照组（CNE1鼻咽癌细胞常规培养,不进行外界干预）、NC组（CNE1鼻咽癌细胞转染LvGFP-Puro-GRP78-NC后,常规培养）、Sh-GRP78组（CNE1鼻咽癌细胞转染LvGFP-Puro-GRP78后,常规培养）,转染完成48 h后,可在荧光显微镜下观察到各组细胞内的绿色荧光蛋白（GFP）,PCR检测各组细胞中GRP78的mRNA的表达。Brdu标记检测各组细胞的增殖能力,Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力,小管形成实验检测各组细胞的血管形成能力;双荧光素酶实验分析GRP78和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9的作用,Western blot检测各组细胞GRP78、MMP-2和MMP-9表达水平。结果 与慢性鼻咽炎组织相比,GRP78在鼻咽癌组织中的表达明显升高,Sh-GRP78组CNE1细胞增殖、侵袭和迁移能力、血管形成能力明显增强,差异均具有统计意义（P<0.05）。双荧光素酶实验结果显示MMP-2和MMP-9是GRP78作用的靶基因。与对照组相比,Sh-GRP78组细胞中GRP78、MMP-2和MMP-9的表达水平明显上升,差异均具有统计意义（P<0.05）。结论 GRP78在鼻咽癌组织中存在高表达的现象,并且GRP78靶向调控MMP-2和MMP-9的表达增强CNE1细胞的增殖、侵袭与血管新生的能力。     

自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD的构建及进行喉癌Hep-2细胞株转染研究

目的:构建含酵母菌自杀基因CD的质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,并利用该载体进行喉癌Hep2细胞株转染研究,体外实验观察前体药物5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株的杀伤作用。方法:通过RTPCR从酵母菌RNA内扩增出CD基因全长CDS序列,将其定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV中,重组体质粒经XhoI/HindⅢ双酶切鉴定,并对重组体中的CD基因片段进行序列分析,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD运用电穿孔法转入喉癌Hep2细胞中。经300～600mg/LG418正筛选14d和10mg/L前体药物5FC负筛选,获得稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞株,提取该细胞株细胞的总RNA,经RTPCR鉴定CD基因的表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察不同浓度5FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep2细胞及转染空白载体pcDNA3.1(-)CMV的对照组喉癌Hep2细胞的杀伤作用。结果:阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD经XhoI/HindⅢ双酶切后获得5353bp的片段及496bp的插入片段,DNA自动序列分析证明重组体质粒含完整的477bp长的CD基因CDS序列。RTPCR从转染细胞总RNA中扩出453bp的预期片段。当添加不同浓度的5FC时,表达CD基因的Hep2细胞不同程度地被杀死,而对照组的细胞几乎未受到影响,两组细胞的相对生存率差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,建立了稳定表达酵母菌CD基因的喉癌Hep2细胞株,表达CD基因的Hep2细胞可以被5FC杀死。     

建立稳定表达融合自杀基因CD／UPRT．UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株

目的：建立稳定表达融合自杀基因CD／UPRT．UL49的CNE-2鼻咽癌细胞株。方法：构建表达载体pcDNA3．1（一）E6．BARFlP．cD／UPRT．UL49,经脂质体法转染CNE-2细胞,G418和前体药物5-氟胞嘧啶筛选出阳性克隆细胞并扩大培养。抽提阳性克隆细胞总蛋白质,Western-blotting检测目的基因表达。结果：融合自杀基因CD／UPRT．UL49在CNE2转染细胞内稳定表达。结论：本组通过脂质体转染技术,成功地建立了稳定表达融合CD／UPRT．UL49基因的CNE-2细胞株。     

Ad．RGD—ING4对人鼻咽癌细胞CNE抑癌增效及其机制的研究

目的：研究带RGD的腺病毒介导的ING4对人鼻咽癌细胞CNE生长、凋亡及细胞周期的影响并探讨其可能调节机制。方法：以Ad．RGD-ING4及腺病毒空载体感染CNE细胞,RT—PCR法检测ING4基因的表达水平,Westernblot法检测目的蛋白的表达。用MTT试验检测ING4对CNE细胞生长情况的影响,用AnnexinV—PE／7一AAD双染色测定ING4对CNE细胞凋亡的影响,用PI单染色检测ING4对CNE细胞细胞周期的影响。RT—PCR检测p21、Bcl-2、Bax基因的表达水平的差异,Westernblot法检测Survivin蛋白、Cleaved—caspase3蛋白表达的差异。结果：CNE细胞感染Ad．RGD-ING472h后,ING4在CNE细胞中过表达,CNE细胞的生长受到明显抑制,细胞凋亡率明显升高,G2／M期出现明显阻滞。RT-PCR结果显示,感染Ad．RGD-ING4的CNE细胞中Bcl-2表达下降,p21、Bax表达升高,差异具有统计学意义（均P〈0．01）。Westernblot结果显示Survivin蛋白表达下降,Cleaved—caspase3蛋白表达升高。结论：Ad．RGD-ING4可以对鼻咽癌细胞株CNE的起到抑癌增效作用,这一作用可能是通过下调Bcl-2、Survivin表达及上调p21、Bax、caspase3实现的。     

yCDglyTK融合自杀基因前药系统对鼻咽癌CNE-2细胞株放射增敏作用的研究

目的研究yCDglyTK融合自杀基因前药系统对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的放射增敏作用。方法pcDNA3.1(-)CMVe·Egr-1yCDglyTK质粒经电穿孔法转染CNE2细胞,给予不同剂量γ射线照射及不同剂量前药,通过免疫组化、高效液相色谱、细胞存活率测定(MTT法)及克隆增殖实验,观察不同剂量辐射对自杀基因阳性CNE-2细胞中自杀基因表达及功能的影响,并观察前药干预及γ射线对CNE-2细胞生长的影响。结果电离辐射可诱导增强自杀基因阳性细胞株中yCDglyTK基因的表达;电离辐射与前药的联合大大增强了对自杀基因阳性CNE-2细胞的杀伤作用,其杀伤作用大于单独自杀基因前药系统和单独放射。结论yCDglyTK融合自杀基因前药系统对CNE-2细胞有放射增敏作用,其与放射联合使用对CNE-2细胞有明显协同杀伤效应。     

鼻咽癌细胞中增强型表达载体调控TK基因与端粒酶活性关系的研究

目的:探讨人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因核心启动子和原核增强子CMV联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统对TK基因的活性改变及与鼻咽癌细胞中端粒酶活性的关系。方法:将改良构建后的增强型载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer及单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp(作为对照组)分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞株及对照组细胞人乳腺癌MCF-7细胞(端粒酶阳性)及正常人血管内皮ECV细胞(端粒酶阴性),采用荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,TRAP银染法检测肿瘤细胞转染前后端粒酶活性改变并分析TK基因表达与端粒酶活性之间的关系。结果:①增强型表达载体转染鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,比单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp及ECV细胞绿色荧光要强。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值亦较对照组明显增高。②转染增强型载体(加GCV)后TRAP银染法检测鼻咽癌5-8F细胞端粒酶活...     

bcl—Xs增加鼻咽癌细胞对喜树碱诱导凋亡敏感性的实验研究

目的：研究bcl-Xs基因对喜树碱（CPT）诱导鼻咽癌CNE－2Z细胞凋亡的影响,。方法：利用脂质体LipofectAmine将含有人bcl-Xs基因的重组真核表达质粒pcDNA3x,导入入鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE－2Z,G418筛选培养后,经Western blot检测bcl-Xs的表达,以不含有bcl0Xs基因的pcDNA3质粒转染CNE－2Z作为对照,喜树碱处理两种细胞一定时间后,通过激光流式细胞仪检测凋亡细胞百分比,结果：Western blot检测证实获得稳定表达bcl-Xs的细胞,经过0．5umol/L,1.0umol/L CPT处理24小时后,激光流式细胞仪检测的凋亡峰值均高于对照细胞,结论：bcl-Xs能显著增加鼻咽癌CNE－2Z细胞对喜树碱诱导凋亡的敏感性。     

pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建靶向人ABCG2基因的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒,运用RNA干扰下调ABCG2基因在鼻咽癌细胞系CNE-2中的表达,并筛选出其基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法:针对ABCG2基因的mRNA序列设计3个干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,用脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞,用real-time PCR和Western blot检测ABCG2基因在mRNA和蛋白水平的抑制效果.结果:经测序证实,成功构建pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒.重组质粒转染CNE-2细胞后,ABCG2基因的mRNA水平及蛋白表达水平明显下调,其中以1号重组质粒效应最强,mRNA水平下调75%,蛋白水平下调68%.结论:成功构建以人ABCG2为靶向的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2的重组质粒.其对鼻咽癌CNE-2细胞中ABCG2的表达具有显著抑制效应,为进一步研究ABCG2在CNE-2细胞中的功能和鼻咽癌的基因治疗奠定了基础.     

Beclin1对喉鳞癌细胞Hep-2紫杉醇敏感性影响的体外研究

目的:通过检测不同Beclin1表达水平对喉癌细胞紫杉醇敏感性的影响。方法:本研究利用以喉癌细胞株Hep-2、稳定转染pcDNA3.1-Beclin1质粒的喉癌细胞株Hep-2-Beclin1、稳定转染pcDNA3.1质粒载体的喉癌细胞株Hep-2-pcDNA3.1为研究对象,对3组细胞施加不同浓度的化疗药物紫杉醇(1、2、5、10、20μg/L)干预24h,利用MTT法及流式细胞术检测紫杉醇对3组细胞增殖和凋亡的影响。利用Western blot检测3组细胞Akt和p-Akt蛋白表达水平。结果:不同浓度的紫杉醇处理后的3组喉癌细胞与药物终浓度正相关地出现生长抑制率提高。当紫杉醇浓度大于5μg/L时,紫杉醇对Hep-2-Beclin1的生长抑制率高于对另两株细胞的生长抑制率。以终浓度为10、20μg/L的紫杉醇处理3株喉癌细胞24h后,流式细胞术检测结果显示:各组细胞20μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率均高于10μg/L紫杉醇处理后细胞的凋亡率(P<0.05)。紫杉醇处理后Hep-2-Beclin1组细胞凋亡率均高于Hep-2组和Hep-2-pcDNA3.1组(P<0.05)。Western blot结果显示:Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞Akt相对蛋白表达量分别为:1.24±0.03、1.25±0.05、1.27±0.09,3组细胞间Akt相对蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05);Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1、Hep-2-Beclin1细胞p-Akt即活化型Akt相对蛋白表达量分别为:0.98±0.09、1.03±0.04、0.54±0.03,Hep-2-Beclin1细胞p-Akt相对蛋白表达量低于Hep-2、Hep-2-pcDNA3.1组细胞(P<0.05)。结论:Beclin1可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的活化上调喉癌细胞对紫杉醇的敏感性。     

靶向增强型TK表达载体在鼻咽癌细胞中的作用研究

目的探讨hTERT启动子及CMV增强子双调控机制的增强型表达载体pGL3-bas-ic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer在鼻咽癌细胞中的靶向杀伤效应。方法构建靶向性增强型hTERT启动子及CMV增强子双调控TK表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer,并以单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp作为对照组,分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌细胞株5-8F、人乳腺癌细胞MCF-7（阳性对照）及正常人血管内皮细胞ECV（阴性对照）。荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,Stretch PCR法检测肿瘤细胞端粒酶活性,MTT法分析杀灭鼻咽癌细胞的效果等作为检验指标。结果①该增强型表达载体转染5-8F细胞及MCF-7细胞后的绿色荧光表达及TK基因的mRNA表达均强于单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp组;而ECV细胞只有极微弱的绿色荧光和极弱的TK基因的mRNA表达。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值较对照组单启动子组明显增高,是单启动子组的2～5倍。StretchPCR法检测转染前后5-8F细胞端粒酶活性明显被抑制。②加入GCV后增强载体组对鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞体外增殖均有明显抑制作用,均高于单启动子载体组、不加GCV的增强型载体组、空载体组及空白对照组。结论以hTERT启动子及CMV增强子双调控机制介导TK基因的新型靶向增强型表达载体能够高效靶向性杀灭鼻咽癌细胞,这种新型高效靶向增强型载体有可能成为一种针对包括鼻咽癌在内的具有较为广泛抗癌谱的恶性肿瘤临床靶向基因治疗的新策略。