玻璃化冷冻与程序化冷冻对小鼠MⅡ期的卵母细胞及经单精子卵胞浆注射得到的胚胎发育潜能的影响

目的评估两种冷冻方法对小鼠卵母细胞和单精子卵胞浆注射(ICSI)胚胎发育潜能的影响,以期为辅助生殖领域人卵母细胞的冷冻保存和胚胎发育潜能的研究提供实验依据。方法分别用玻璃化冷冻与程序化冷冻对小鼠MⅡ期的卵母细胞进行冷冻保存,解冻后存活的卵母细胞用于ICSI注射,然后将得到的胚胎体外发育并进行胚胎移植。用卡方和单因素的方差分析进行统计学分析,并比较两种方法冻存的卵母细胞解冻后的存活率,ICSI胚胎的2-细胞率、8-细胞率、囊胚率和妊娠率等。结果采用玻璃化冷冻法冷冻的MⅡ期卵母细胞存活率为81.6%,明显高于程序冷冻法组的70.7%。两组得到的胚胎在2-细胞形成率方面没有差异,但是8-细胞率和囊胚发育率差异均有统计学意义。两组假孕母体的妊娠率(63.6%和50.0%)和幼崽出生率(20.0%和12.4%)均没有统计学差异。结论与程序化冷冻相比,玻璃化冷冻对于小鼠MⅡ期卵母细胞的保存效果较好。解冻后卵母细胞用于ICSI,玻璃化冷冻组的胚胎得到较高的8-细胞率和囊胚发育率。但这两组的囊胚移植得到的妊娠率和出生率没有差异。     

小鼠囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与维甲酸的诱导作用

背景:细胞凋亡是维甲酸导致早期胚胎异常发育的原因之一,而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3介导的细胞凋亡是细胞凋亡的主要途径。目的:观察维甲酸对体外培养小鼠囊胚细胞凋亡的影响,以及对囊胚细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的改变。方法:获取妊娠3.5d小鼠囊胚,分别在含0,1和10μmol/L维甲酸的M199培养基中培养24h,用带有荧光标记的原位末端标记法观察维甲酸对小鼠囊胚细胞凋亡的效应;并用免疫组织化学S-P法检测维甲酸对小鼠囊胚半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。结果与结论:所有组均观察到囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,高剂量维甲酸组中囊胚细胞凋亡荧光值,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的平均吸光度值和阳性面积率均显著升高(P<0.01)。结果提示维甲酸可促进体外培养小鼠囊胚细胞凋亡和及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,证实了维甲酸对小鼠胚胎的发育的细胞毒性作用。     

白藜芦醇对小鼠超排卵子质量的影响

目的 研究白芦藜醇（RSV）对小鼠超排卵效果及胚胎发育的影响。方法 以2~3月龄的CD-1小鼠为研究对象,在超排卵同时腹腔注射RSV（RSV组）或二甲基亚砜（DMSO组）,观察RSV对小鼠超排卵子质量的影响。选取了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、卵巢和睾丸组织的模板DNA,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分别检测沉默信息调节因子（SIRT1） mRNA在这三者中的表达情况。另外获取小鼠P1卵丘细胞,设置DMSO组、RSV（1 μmol/L）组和EX-527（SIRT1的抑制剂,10 μmol/L）组,使用荧光免疫染色检测各组SIRT的相对荧光强度、qRT-PCR检测各组的mtDNA相对表达量。 结果 RSV组的卵裂率和囊胚率均高于DMSO组（P均< 0.05）。体外实验结果显示,SIRT1 mRNA的相对表达量在卵巢是MEF的15~25倍（P < 0.001）。小鼠P1卵丘细胞在经RSV处理后SIRT1荧光相对强度升高（P < 0.001）。在用RSV和EX-527分别处理小鼠卵丘细胞48 h后,RSV组mtDNA相对表达量高于DMSO组（P < 0.001）,而EX-527组mtDNA相对表达量低于DMSO组（P < 0.01）。结论 小鼠超排卵时补充RSV能够显著改善卵子的发育潜能。     

小鼠囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与维甲酸的诱导作用

背景：细胞凋亡是维甲酸导致早期胚胎异常发育的原因之一,而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3介导的细胞凋亡是细胞凋亡的主要途径。目的：观察维甲酸对体外培养小鼠囊胚细胞凋亡的影响,以及对囊胚细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的改变。方法：获取妊娠3.5d小鼠囊胚,分别在含0,1和10μmol/L维甲酸的M199培养基中培养24h,用带有荧光标记的原位末端标记法观察维甲酸对小鼠囊胚细胞凋亡的效应;并用免疫组织化学S-P法检测维甲酸对小鼠囊胚半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。结果与结论：所有组均观察到囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,高剂量维甲酸组中囊胚细胞凋亡荧光值,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的平均吸光度值和阳性面积率均显著升高（P〈0.01）。结果提示维甲酸可促进体外培养小鼠囊胚细胞凋亡和及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,证实了维甲酸对小鼠胚胎的发育的细胞毒性作用。     

近交系小鼠体细胞核移植胚胎的构建和鉴定

背景：体细胞核移植技术己成功用于多种动物的克隆，但其过程中核移植技术的成功率较低。 目的：通过对卵母细胞不同去核方法的对比分析，观察其对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响，并利用微卫星DNA技术进行核移植囊胚鉴定，幸刀步建立小鼠体细胞核移植技术平台。 设计、时间及地点：以卵母细胞为观察对象的对比实验，于2005—09/2007-10在广西医科大学医学科学实验中心及动物实验中心完成。材料：选用C57BL／6小鼠卵母细胞为受体、BALB／c小鼠卵丘细胞为供体。取600枚受体卵母细胞，根据去核方法不同分为3组。每组200枚。 方法：①盲吸法：吸出卵母细胞第1极体及其附近的适量胞质。②蔗糖辅助去核法：以含蔗糖显微操作液预处理卵母细胞，吸出可见的细胞核等遗传物质。③荧光染色去核法：Hoechest33342预处理卵母细胞，在紫外光下用去除遗传物质。乙醇联合二甲氨基嘌呤进行重构胚激活，激活后卵裂培养基液滴中培养。根据Mouse Genome Database设计小鼠微卫星DNA多态聚合酶链反应引物，提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB／c小鼠、受体C57BL／6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA，使用巢式聚合酶链反应扩增选定的序列。最终扩增出4个微卫星位点DNA片段，即D3Mit28，D11Mit258，D12Mit136及D14Mit50。主要观察指标：比较3种去核方法的去核率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数差异。对巢式聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。 结果：①盲吸去孩法的去核率、处理重构胚的体外发育能力均低于荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法（P〈0.05）。②荧光染包去核法的去核率高于蔗糖辅助去核法（P〈0.05），两组的囊胚率及囊胚细胞数差异均无显著性意义（P〉0.05）。③巢式聚合酶链反应可扩增微量基因组DNA。通过微卫星DNA序列的扩增，证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同，而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系。 结论：荧光染色去核法和蔗糖辅助去核法适用于小鼠核移植，可支持小鼠体细胞核移植胚胎的早期发育。微卫星分析证实体细胞核移植囊胚为供体BALB/c小鼠的克隆，微卫星DNA分析可用于小鼠体细胞核移植囊胚的鉴定。     

电针预处理对大脑中动脉栓塞小鼠脑微血管内皮细胞功能的影响

目的 观察电针预处理对大脑中动脉栓塞（MCAO）小鼠脑微血管内皮细胞功能的影响,并进一步探讨miRNA-155靶向阴阳因子1（YY1）/p53通路在电针预处理调节MCAO小鼠脑微血管内皮细胞功能中的作用。 方法 按随机数字表法将42只小鼠随机分为假手术组、模型组、电针预处理组、miR-155抑制剂组（电针预处理联合miR-155抑制剂处理）、miR-155激动剂组（电针预处理联合miR-155激动剂处理）、miR-155抑制剂阴性对照组（电针预处理联合miR-155抑制剂阴性对照处理）和miR-155激动剂阴性对照组（电针预处理联合miR-155激动剂阴性对照处理）,每组6只小鼠。电针预处理组、miR-155抑制剂组、miR-155激动剂组、miR-155抑制剂阴性对照组和miR-155激动剂阴性对照组均接受电针预处理,假手术组和模型组不接受任何预处理。miR-155抑制剂组、miR-155激动剂组、miR-155抑制剂阴性对照组和miR-155激动剂阴性对照组于电针预处理结束后,且造模前2 h进行对应的侧脑室注射。7组小鼠均于电针预处理最后1次治疗结束48 h后进行MCAO模型制作。于造模成功24 h和72 h后,采用改良神经功能缺损评分（mNSS）评估模型组、假手术组和电针预处理组小鼠的神经功能缺损程度。mNSS评分结束后对7组小鼠取材。采用苏木精伊红（HE）染色法观察缺血区脑组织的损伤情况;采用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）染色法观察内皮细胞的凋亡情况;采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测模型组、假手术组和电针预处理组血清中细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的水平;采用免疫荧光检测脑微血内皮细胞凋亡数及ICAM-1、Bcl-2、Bax阳性细胞数;采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR)检测法检测I/R区miRNA-155、YY1、p53表达水平。 结果 造模成功24 h和72 h后,电针预处理组的mNSS评分分别为（6.17±1.17）分和（4.00±0.63）分,均显著低于模型组同时间点,差异均有统计学意义（P<0.05）。HE染色结果显示,电针预处理组造模成功24 h和72 h后的细胞形态较模型组更规则。TUNEL染色结果显示,电针预处理组造模成功24 h和72 h后的凋亡细胞数量显著低于模型组同时间点（P<0.05）。ELISA检测结果显示,电针预处理组造模成功24 h和72 h后的ICAM-1表达显著低于模型组同时间点（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示,电针预处理组造模成功24 h和72 h后ICAM-1的相对表达量显著低于模型组同时间点（P<0.05）;电针预处理组造模成功24 h和72 h后的Bax/Bcl-2比值显著低于模型组。qRT-PCR检测结果显示,电针预处理组造模成功24 h和72 h后的miRNA-155、YY1、p53的相对表达量显著低于模型组同时间点。miR-155抑制剂组造模成功24 h和72 h后miRNA-155的表达量显著低于miR-155抑制剂对照组同时间点（P<0.05）;miR-155抑制剂组造模成功24 h和72 h后p53的表达量显著低于miR-155抑制剂对照组同时间点（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示,miR-155抑制剂组造模成功24 h和72 h后ICAM-1表达量显著低于miR-155抑制剂对照组同时间点（P<0.05）;miR-155抑制剂组造模成功24 h和72 h后的Bax与Bcl-2比值显著低于miR-155抑制剂对照组同时间点（P<0.05）。 结论 电针预处理可以改善脑缺血再灌注小鼠的脑微血管内皮细胞功能,并可能通过下调miRNA-155介导的YY1/p53通路来减轻脑缺血再灌注损伤小鼠脑微血管内皮细胞的损伤。     

miR-214调控的凋亡在肝纤维化中的作用

目的研究miR-214通过调节凋亡蛋白Caspase 3表达而对肝纤维化小鼠的影响。方法将6周龄C57BL/6小鼠随机分为两组:其中实验组注射四氯化碳诱导肝纤维化,对照组注射橄榄油;采用尾静脉注射方法,对小鼠进行miR-214agomir干预;运用HE和天狼猩红染色观察纤维化模型病理变化;采用Western blot检测实验组和对照组α-SMA和Caspase 3在肝脏的表达水平;实时荧光PCR检测肝组织miR-214表达水平。结果 HE和天狼猩红染色结果显示实验组纤维间隔明显。Western blot结果显示实验组α-SMA高表达,同时miR-214agomir干预组α-SMA及Caspase 3表达下调(P0.05),细胞凋亡及纤维化受到抑制。实时荧光PCR检测结果显示,实验组miR-214在造模6周及8周时表达显著降低(P0.05)。结论 miR-214高表达抑制细胞凋亡,从而可能起到改善肝纤维化的目的。     

miR-27b基因对病毒性心肌炎细胞凋亡的影响研究

目的探讨抑制miR-27b基因表达对病毒性心肌炎心肌细胞凋亡的影响及机制。方法将40只健康BALB/c小鼠随机分为对照组:小鼠一次性腹腔注射0. 1 ml的柯萨奇病毒B3(CVB3); miR-27b抑制剂组(抑制组):小鼠一次性腹腔注射0. 1 ml的CVB3,次日,通过尾静脉注射miR-27b抑制剂(10μg/10 g); miR-27b NC组(NC组):小鼠一次性腹腔注射0. 1 ml的CVB3,次日,通过尾静脉注射miR-27b NC(10μg/10 g)每组10只。于接种CVB3病毒后第7天,采集血清及心脏组织。肌酸激酶(CK)试剂盒检测血清CK含量; qRT-PCR检测心肌组织miR-27b表达;TUNEL试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、髓过氧化物酶(MPO)试剂盒及细胞内活性氧(ROS)试剂盒分别检测心肌细胞凋亡率、心肌组织SOD活力、MPO活性及ROS含量。Western blotting检测NF-κBp65、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果小鼠感染CVB3后第7天体重减轻率及血清CK活性明显高于对照组小鼠(P 0. 05)。与对照组比较,模型组SOD活力、Bcl-2蛋白表达明显降低,miR-27b mRNA表达、细胞凋亡率、MPO活性、ROS含量及NF-κBp65和Bax蛋白表达均明显升高(P 0. 05),与模型组比较,抑制组SOD活力、Bcl-2蛋白表达明显升高,miR-27b mRNA表达、细胞凋亡率、MPO活性、ROS含量及NF-κBp65和Bax蛋白表达均明显降低(P 0. 05)。结论抑制miR-27b基因表达可降低病毒性心肌炎心肌细胞凋亡率及氧化应激反应,其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

不同受精方式在微刺激周期中的应用

目的:探讨助孕周期行微刺激治疗患者采用不同体外受精方式对胚胎实验室指标的影响。方法回顾性分析我院行微刺激治疗的718例患者资料,根据受精方式分为体外受精(in vitro fertilization,IVF)和单精子卵母细胞内注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI),其中ICSI组根据精液情况分为正常精液ICSI组和少弱精ICSI组。分别比较各组的实验室指标,包括受精率、两原核(pronucleus,PN)率、多PN率、卵裂率、完全受精失败率、优质胚胎率、冷冻胚胎率、囊胚形成率。结果:正常精液ICSI组的2PN率显著高于IVF组(P<0.05),多PN率显著低于IVF组(P<0.05),但卵裂率、优质胚胎率、冷冻胚胎率、囊胚形成率与IVF组差异无统计学意义;正常精液ICSI组的完全受精失败率显著低于少弱精ICSI组(P<0.05),受精率、优质胚胎率、冷冻胚胎率、囊胚形成率无明显差异。结论:采用微刺激促排的IVF治疗中,男方精液正常者单精子卵母细胞内注射并不能改善胚胎质量。     

植入前遗传学诊断的方法及应用

植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis,PGD）是指对体外受精胚胎的遗传物质进行分析,诊断胚胎是否有某些遗传异常,确定该胚胎是否适合移植,选择不致造成遗传学疾患的胚胎植入宫腔,从而获得正常胎儿的诊断方法。PGD的步骤包括激素诱导超促排卵,获得卯母细胞,用常规体外受精（in vitro fertilization,IVF）或卵母细胞单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）受精,体外培养至6～8个细胞期或囊胚期,在此期间通过显微操作对胚胎或卵母细胞进行活检,     

压力超负荷致小鼠心肌肥厚中miR378对热休克转录因子1的调节作用

目的:探讨miR-378在压力超负荷致小鼠心肌肥厚中对热休克转录因子1(HSF1)的调节作用及机制。方法:采用C57B/L6雄性小鼠经主动脉缩窄构建心肌的压力超负荷(TAC)模型,2周后对小鼠进行心脏超声和血流动力学测定,并观察miR-378和HSF1的表达变化。体外培养心肌细胞,机械牵张刺激24 h后观察miR-378和HSF1的表达变化;对心肌细胞分别转染miR-378模拟物和抑制物,48 h后观察心肌细胞内源性HSF1的表达变化;通过荧光素酶基因报告系统,检测miR-378是否靶向结合其预测靶点HSF1的3′UTR区域。结果:建模TAC小鼠2周后,心脏表现为代偿性心肌肥厚,HSF1表达升高而miR-378表达下降。心肌细胞机械牵张后HSF1表达升高而miR-378表达下降;心肌细胞过表达miR-378后,HSF1表达显著下降,而当抑制内源miR-378时,HSF1表达显著升高;荧光素酶报告系统证实miR-378能够靶向结合HSF1的3′UTR序列。结论:在心肌肥厚代偿期,miR-378可能通过靶向结合HSF1的3′UTR序列调节心肌内源性HSF1的表达。     

miR-9*和miR-30b在脆性X综合征小鼠海马组织中的表达及意义

目的:观察脆性X综合征(FXS)模型小鼠海马组织中miR-9*和miR-30b的表达,明确脆性X智力低下蛋白(FMRP)缺失是否导致miR-9*和miR-30b转录后表达水平的改变。方法:应用荧光实时定量PCR检测FVB品系近交系雄性1周龄Fmr1基因敲除型(KO1W)和同龄野生型(WT1W)小鼠海马组织中miR-9*和miR-30b的转录后表达水平(n=3)。结果:KO1W与WT1W小鼠miR-9*和miR-30b的转录后表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论:FMRP的缺失可能影响miR-9*和miR-30b的转录后表达水平。     

联合使用1-磷酸鞘氨醇和溶血磷脂酸对小鼠卵母细胞体外成熟和受精后胚胎发育的影响

目的通过在成熟培养液中联合添加或单独添加1-磷酸鞘氨醇(S1P)和溶血磷脂酸(LPA)研究对小鼠卵母细胞体外成熟和受精后胚胎发育的影响,以期为优化人卵母细胞的体外成熟系统和提高体外胚胎发育率奠定实验基础。方法 (1)成熟培养液中单独添加50~2 000 nmol/L S1P或1~100μmol/L LPA,体外成熟后的卵母细胞体外受精,得到的胚胎观察并统计卵裂率、8-细胞率、囊胚率。(2)成熟培养液中联合添加不同浓度组合S1P和LPA,体外成熟后的卵母细胞体外受精,得到的胚胎观察并统计卵裂率、8-细胞率、囊胚率。(3)对各组体外成熟得到的卵母细胞进行免疫荧光法染色,以评估MⅡ期卵母细胞纺锤体的完整性。(4)对各组得到的数据应用卡方检验进行分析。结果添加100 nmol/L S1P组的成熟率(81.0%)和8-细胞率(81.9%)显著高于0 nmol/L和2 000 nmol/L组;添加30μmol/L LPA的成熟率(81.8%)和8-细胞率(81.5%)显著高于0μmol/L和100μmol/L组;500 nmol/L S1P+30μmol/L LPA组的成熟率(90.7%)显著高于100 nmol/L S1P组、30μmol/L LPA组合和不添加组;500 nmol/L S1P+30μmol/L LPA组的囊胚率(77.6%)显著高于100 nmol/L S1P组和不添加组。结论联合添加S1P和LPA可能要比单独添加更能促进小鼠卵母细胞成熟,虽然在正常纺锤体百分率方面没有显示出优势,但通过体外受精得到的胚胎得到了较高的囊胚发育率。     

miR-153-3p调控神经突的生长

目的探讨miR-153-3p在大、小鼠神经突生长中的作用。方法对数生长期C57BL/6小鼠N2A细胞和Rattus norvegicus大鼠PC12细胞,随机分为miR-153-3p过表达组(转染miR-153-3p过表达试剂miR-153-3p mimic)、miR-153-3p抑制组(转染miR-153-3p表达抑制剂miR-153-3p inhibitor)、过表达对照组(转染miR-153-3p mimic空白对照试剂miR-153-3p mimic NC)、抑制剂对照组(转染miR-153-3p inhibitor空白对照试剂miR-153-3p inhibitor NC)。转染48 h,采用实时荧光定量PCR法检测4组细胞miR-153-3p mRNA相对表达量,免疫荧光法检测神经突生长情况。结果 miR-153-3p过表达组N2A细胞、PC12细胞miR-153-3p mRNA相对表达量(28.98±1.63、19.67±0.88)均高于miR-153-3p抑制组(0.94±0.19、0.89±0.05)、过表达对照组(0.99±0.08、1.00±0.09)、抑制剂对照组(1.00±0.04、1.00±0.14)(P0.05),miR-153-3p抑制组、过表达对照组、抑制剂对照组比较差异均无统计学意义(P0.05);miR-153-3p过表达组N2A细胞、PC12细胞神经突总长度[(31.13±3.85)、(38.08±2.12)μm]和最长神经轴突长度[(18.04±2.58)、17.48±1.75)μm]均较miR-153-3p抑制组[N2A细胞:(54.53±1.83)、(31.74±2.36)μm;PC12细胞:(64.46±12.85)、(29.46±7.36)μm]、过表达对照组[N2A细胞:(42.53±6.29)、(24.99±3.47)μm;PC12细胞:(53.58±4.88)、(25.31±3.66)μm]、抑制剂对照组[N2A细胞:(41.33±2.77)、(24.57±3.86)μm;PC12细胞:(44.44±7.59)、(23.04±4.31)μm]短(P0.05),且过表达对照组、抑制剂对照组PC12细胞、N2A细胞神经突总长度和最长神经轴突长度较miR-153-3p抑制组短(P0.05),过表达对照组、抑制剂对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论miR-153-3p可抑制小鼠N2A细胞、大鼠PC12细胞神经突生长。     

microRNA-135a突变体对β分泌酶-1的调控作用及初步临床调查

目的初步研究微小核糖核酸(microRNA,miR)-135a 3523 C→G突变对β分泌酶-1(BACE-1)表达的调控和其在阿尔茨海默病(AD)患者中的发生频率。方法分别合成野生型miR-135a(野生型组)、miR-135a 3523C→G突变体(突变体组)和无意义miR(对照组)并转染含BACE-1 mRNA荧光载体的细胞,使用酶学检测和荧光载体实验等分析miR-135a 3523 C→G突变体对BACE-1活性的影响及其初步机制;对轻度认知障碍患者(MCI)、痴呆期AD患者(DAT)和表面健康受试者进行miR-135a的测序分析。结果 miR-135a突变体转染组的BACE-1活性显著高于野生型miR-135a转染组和对照组(P0.05)。荧光素酶实验结果显示miR-135a 3523 C→G突变体转染组的荧光强度显著高于野生型miR-135a转染组(P0.05)。MCI患者miR-135a 3523 C→G突变携带率为3.85%(3/78),DAT患者的携带率为4.84%(6/124)。MCI患者和DAT患者的血清miR-135a水平显著高于相应的对照组(P0.05),MCI表面健康对照组与DAT表面健康对照组的血清miR-135a水平无显著性差异(P0.05)。结论 miR-135a 3523 C→G突变体能导致其对BACE-1表达调控的失控,其可能参与了AD的发生发展;miR-135a突变体和表达量的联合检测能提高AD的检出率。     

不同分化状态的供体细胞对小鼠克隆胚胎发育的影响

目的:探讨不同分化程度的供体细胞对克隆胚胎发育潜能的影响.方法:采用"一步法"核移植技术将供体细胞核直接注入小鼠卵母细胞,成功构建克隆胚胎.颗粒细胞克隆胚胎经含有10 mmol/L的SrCl2和5 ug/mLCB的培养液中激活处理5～6 h,R1胚胎干细胞克隆胚胎经含有10 mmol/L的SrCl2的培养液中激活处理3h,然后移入CZB培养液中继续培养.结果:颗粒细胞克隆胚胎体外的激活率、卵裂率和囊胚率与胚胎干细胞克隆胚相比具有显著差异,克隆胚胎体内移植后胚胎干细胞克隆胎儿出生率稍高(2.3%vs.1.2%),但没有显著差异.结论:供体细胞分化程度越低,克隆胚胎体内外发育潜能越高.     

双歧杆菌的脂磷壁酸对巨噬细胞MAPK的影响

目的探讨双歧杆菌的脂磷壁酸(LTA)对巨噬细胞丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)活性的影响。方法选取6~8周龄巴比赛(BALB/c)小鼠90只,按随机数字表达法分为九组,每组10只,A组腹腔注射磷酸缓冲盐溶液(PBS);B组腹腔注射LTA;C组腹腔注射LTA+细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂;D组腹腔注射LTA+c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂;E组腹腔注射LTA+p38抑制剂;F组腹腔注射LTA+ERK及JNK抑制剂组;G组腹腔注射LTA+ERK及P38抑制剂组;H组腹腔注射LTA+JNK及P38抑制剂;I组腹腔注射LTA+3种抑制剂。九组小鼠注射5d,每天注射1次,饲养7d后,处死全部小鼠,采用免疫印迹法检测九组小鼠腹腔巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK和JNK蛋白的磷酸化水平。结果 (1)B组小鼠腹腔巨噬细胞ERK1/2蛋白磷酸化水平较A组明显升高,差异有统计学意义(P0.05);两组小鼠腹腔巨噬细胞p38MAPK和JNK平均荧光强度差异无统计学意义(P0.05);(2)向小鼠腹腔注射抑制剂的其他七个组别,其相应的蛋白表达水平几乎为零,且对其他蛋白表达无影响。结论 LTA可能是通过活化巨噬细胞MAPK家族中ERK1/2来激活巨噬细胞表达、合成和分泌细胞因子,抑制剂能够有效阻断蛋白表达通路,对其他蛋白表达无影响。     

囊胚培养及囊胚移植

背景:利用囊胚培养技术,待胚胎形成囊胚后再植入子宫腔,缩短了胚胎移植入子宫腔发育与着床之间的间隔,且子宫收缩逐渐减少,并减少胚胎排出体外的机会,因此,囊胚移植更符合自然的生理现象.目的:追踪随访囊胚移植的临床妊娠情况.方法:采用促性腺激素释放激素激动剂及促性腺激素超促排卵.将卵泡液中捡出的卵冠丘复合物洗涤后,置于含人血清白蛋白的受精液中.授精后16～18 h转移入卵裂培养液中,观察受精情况,记录原核情况并对其进行评分.第3天时观察胚胎的发育情况,记录胚胎的卵裂球数及分级.结果与结论:271例患者中,33例未培养出囊胚的患者,只有1例妊娠,余238例患者,囊胚移植后临床妊娠率49.16%,各年龄组的临床妊娠率无差异.移植囊胚其中一个为优质囊胚的患者122例,临床妊娠率56.56%;移植囊胚均未达优质的患者116例,临床妊娠率41.38%.实验结果表明:女方年龄对囊胚移植的临床妊娠率无影响;未形成囊胚的患者可取消移植,形成囊胚的患者不论是否优质囊胚,均应移植.     

P2X7R抑制剂BBG对小鼠异基因造血干细胞移植后aGVHD的抑制作用研究

目的:探讨P2X7R抑制剂酸性亮蓝G(brilliant blue G,BBG)对小鼠异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)发生的影响。方法:建立小鼠allo-HSCT后并发aGVHD模型,通过不同剂量P2X7R抑制剂BBG(50和75 mg/kg)给药处理,观察受鼠生存情况、体重变化,检测肝脏病理变化及肝功能改变,检测肝脏P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA及相关蛋白表达的变化。结果:成功建立小鼠allo-HSCT后并发aGVHD模型。腹腔注射BBG可减轻受鼠弓背、竖毛、皮肤剥脱、体重下降等aGVHD的临床表现;减轻受鼠肝脏水肿、出血、坏死等病理改变,改善受鼠的肝功能;降低受鼠肝脏P2X7R、IL-1β蛋白的表达;降低受鼠肝脏P2X7R、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18因子mRNA表达;且aGVHD+75 mg/kg BBG组受鼠各项指标变化最为显著。结论:BBG可减轻allo-HSCT后aGVHD引起的肝脏炎性损伤,减少炎性因子分泌,且75 mg/kg BBG组的保护作用优于50 mg/kg BBG组。     

炎性痛小鼠脑内3种环氧合酶亚型的变化及不同选择性环氧合酶抑制剂的镇痛效应比较

目的:比较炎性疼痛小鼠脑内环氧合酶1、环氧合酶2及环氧合酶3的表达变化,以及选择性环氧合酶抑制剂单独或联合应用后的镇痛效应。方法:实验于2004-03-01/12-20在第四军医大学药理教研室完成。138只小鼠足底注射甲醛溶液诱导炎性痛。①用54只小鼠放射免疫分析及54只小鼠反转录聚合酶链反应评估脑环氧合酶1、环氧合酶2及环氧合酶3在甲醛溶液注射前、注射后1,12h,1,3,7,14,30,60d的变化(升高表示疼痛增强)。②30只小鼠随机分成5组,每组6只。对照组灌胃生理盐水0.3mL;SC-560组灌胃SC-560(环氧合酶1选择性抑制剂)300μg/kg;NS-398组灌胃NS-398(环氧合酶2选择性抑制剂)150μg/kg;吲哚美辛组灌胃吲哚美辛(低选择性环氧合酶抑制剂)300μg/kg;以上各组灌胃1次/d,连续2个月。NS-398+SC-560组前1个月灌胃NS-398300μg/kg,后1个月灌胃SC-560150μg/kg,1次/d。应用行为学测定各组动物在甲醛溶液注射前、注射后1,12h,1,3,7,14,30,60d对热痛刺激的反应时间(延长表示热痛敏感性下降)。结果:①甲醛溶液注射前、后环氧合酶的表达:108只小鼠环氧合酶2在注射后12h,3d升高显著(P<0.05),环氧合酶1在注射后14d,30d,60d升高显著(P<0.05)。在整个观察时限内环氧合酶3的表达无明显变化。②对热痛刺激的反应时间:注射甲醛溶液的30只小鼠均出现对热痛刺激反应时间的明显缩短。与对照组相比,NS-398+SC-560组反应时间明显较长。NS-398组动物在注射后1,12h,1,3d对热痛刺激反应时间明显延长。SC-560组动物在整个观察过程中均未出现热痛刺激反应时间的改变。吲哚美辛组对热痛刺激反应时间明显短于NS-398+SC-560组而长于SC-560组。结论:与单纯使用环氧合酶1或环氧合酶2抑制剂相比,早期应用环氧合酶2抑制剂结合后期应用环氧合酶1抑制剂对炎性痛有更好的镇痛效应。