AT1-R在雌激素诱导子宫内膜癌细胞增殖中的作用

目的:探讨血管紧张素受体1(angiotensin Feceptor 1,AT1-R)在雌激素诱导子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖、细胞周期转化中的作用及其对细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2)表达的影响.方法:免疫荧光技术检测AT1-R在HEC-1A细胞中的表达;脂质体介导AT1-R-siRNA质粒转染人子宫内膜癌细胞HEC-1A,经G418选择培养,采用Westemblot检测转染前后HEC-1A细胞中AT1-R蛋白的表达.MTT法检测无雌激素诱导及雌激素诱导10rmin转染前后细胞的增殖;流式细胞技术检测细胞周期;Western blot检测ERK1/2蛋白及ER蛋白表达水平.结果:转染AT1-R-siRNA-GFP后,与未转染组相比AT1-R蛋白表达降低41.79%(P＜0.01);沉默AT1-R能够抑制17B-E2对HEC-1A细胞的促增殖作用.1713-E2处理10min后,HEC-1A细胞G1期细胞减少,S期细胞增多,细胞增殖明显(P＜0.05);AT1-R沉默后,能够抑制17β-E2诱导的HEC-1A细胞周期转化,使G1期细胞增加,S期细胞减少(P＜0.05);雌激素处理10min后,HEC-1A细胞ERK1/2蛋白表达水平升高,沉默AT1-R后ERK1/2蛋白表达水平又明显降低.17β-E2诱导及AT1-R沉默对HEC-1A细胞ER蛋白表达无明显影响.结论:AT1-R在雌激素诱导子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖,细胞周期转化中具有重要作用,其机制可能与ERK1/2表达降低有关,与ER表达无关.     

YAP调控人胶质瘤细胞生长的体外研究

  目的   研究YAP（Yes-associated protein）调控人脑胶质瘤细胞系LN229细胞生长的作用。   方法   采用YAP干扰RNA（siRNA）敲低LN229细胞中YAP的表达,Western Blot法鉴定肿瘤细胞中YAP是否已被敲低;MTT比色法测定YAP敲低后对肿瘤细胞增殖的影响;Transwell实验检测胶质瘤细胞侵袭能力的变化;流式细胞术和Annexin Ⅴ标记法分别检测胶质瘤细胞周期及凋亡的变化。Western Blot法检测相关蛋白。   结果   经Western Blot法检测证实转染YAP siRNA后LN229细胞中YAP被有效敲低;敲低LN229细胞中YAP表达,可以抑制胶质瘤细胞增殖,阻滞细胞周期于G₀/G₁期,并可抑制细胞侵袭能力,促使细胞凋亡数显著增加。促增殖蛋白Ki-67、促侵袭蛋白MMP-9、促周期进展蛋白Cyclin D1以及凋亡相关蛋白Bcl-2表达明显下调。   结论   敲低人胶质瘤细胞中YAP活性可以抑制肿瘤细胞增殖和侵袭,促进凋亡,为进一步探究Hippo-YAP信号通路在胶质瘤中的分子病理机制中的作用提供依据。      

AT1-R对非雌激素依赖型子宫内膜癌Hec-1A细胞增殖及凋亡的影响

目的：通过建立裸鼠子宫内膜癌模型,探讨敲除AT1-R基因对非雌激素依赖型子宫内膜癌细胞Hec-1A体内生长的影响以及对ERK1/2信号通路的调控。方法：将Hec-1A细胞、敲除AT1-R基因的Hec-1A细胞分别接种至裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察各组细胞在裸鼠体内的成瘤时间和成瘤率,测量肿瘤体积、瘤质量并绘制肿瘤生长曲线;Western blot法检测瘤组织内ERK的蛋白表达;免疫组化方法检测瘤组织内Caspase-3表达。结果：与未转染组相比,敲除AT1-R基因组裸鼠移植瘤生长较慢,平均成瘤时间明显延长,成瘤率、瘤体体积和瘤质量显著减少（P〈0.05）;与未转染组相比,敲除AT1-R基因组的Hec-1A-si细胞ERK蛋白表达水平显著减少（P〈0.05）;与未转染组相比,敲除AT1-R基因组Hec-1A-si细胞Caspase-3蛋白表达水平显著升高（P〈0.05）。结论：敲除AT1-R基因在裸鼠体内可抑制HEC-1A细胞增殖、促进HEC-1A细胞凋亡。     

ING1基因沉默后通过抑制Caspase 2调节胃腺癌AGS细胞凋亡

  目的   探讨RNA干扰沉默ING1基因表达对胃腺癌细胞AGS细胞凋亡的影响机制。   方法   将体外合成的ING1基因特异性的siRNA利用脂质体2 000转染到胃腺癌细胞AGS,应用流式细胞技术和TUNEL技术检测ING1基因表达沉默对AGS细胞凋亡的影响。应用荧光定量PCR技术和Western blot技术检测转染后40 h AGS细胞中ING1、Caspase 2和Caspase 3的表达。   结果   转染后40 h,体外合成的siRNA对AGS细胞的ING1表达抑制作用明显。转染前凋亡率为（11.06±0.97）%,转染40 h后凋亡率为（6.70±0.41）%,转染前后凋亡率的改变差异有统计学意义（P < 0.05）。转染后40 h AGS细胞中ING1、Caspase 2和Caspase 3的mRNA相对表达分别为0.170 7±0.06,0.125±0.03和0.999±0.10。转染后40 h AGS细胞中ING1、Caspase 2和Caspase 3的蛋白质水平改变的趋势与mRNA水平一致。   结论   RNA干扰沉默ING1基因表达后,AGS细胞中Caspase 2表达明显下调,ING1基因沉默后通过抑制Caspase 2调节胃腺癌细胞AGS细胞凋亡。      

miRNA-375对胰腺癌细胞Panc-1增殖和凋亡的影响

  目的  探讨miRNA-375的外源性表达对人胰腺癌细胞Panc-1增殖和凋亡的影响。   方法  将miRNA-375表达质粒或对照质粒转染Panc-1细胞, qRT-PCR方法检测miRNA-375在转染细胞中的表达水平, 细胞计数法、流式细胞术分别检测外源性miRNA-375表达后Panc-1细胞增殖、凋亡和周期的变化情况。   结果  miRNA-375表达质粒组与对照组比较, 其miRNA-375表达诱导性升高, 细胞增殖受到抑制, 细胞凋亡率增加, 细胞周期阻滞于G₀~G₁期。   结论  在胰腺癌细胞Panc-1中增加miRNA-375的表达, 可抑制细胞增殖, 促进细胞凋亡和细胞周期阻滞, miRNA-375在胰腺癌细胞Panc-1中可能发挥潜在的抑癌基因作用。      

沉默CDK7对子宫内膜癌细胞顺铂敏感性的影响

  目的   研究沉默CDK7对子宫内膜癌细胞HEC-1-A顺铂化疗敏感性的影响。   方法   根据CDK7的基因序列设计合成不同的CDK7 siRNA片段并转染子宫内膜癌细胞HEC-1-A,通过实时定量PCR和Western blot验证RNA干扰的效果后,选择效果最优的CDK7 siRNA片段特异性沉默子宫内膜癌细胞中CDK7的表达,采用MTT细胞毒性实验、流式细胞仪及Hochest/PI双染色荧光显微镜技术检测转染前后该细胞系对化疗药物顺铂敏感性的变化。   结果   共选择了4个位点设计CDK7 siRNA并成功转染子宫内膜癌细胞系HEC-1-A,实时定量PCR及Western blot验证了各组的干扰作用,证实CDK7-423干扰效果最强,达70%以上。选择CDK7-423转染HEC-1-A,MTT细胞毒性实验结果发现在CDK7表达被抑制后,DDP的IC₅₀由45.122 g/mL降为3.200 g/mL,细胞毒性显著增高（P < 0.05）。流式细胞仪检测结果:CDK7低表达组细胞平均凋亡率细胞为37.57%,与高表达组细胞（11.66 %）相比,凋亡率明显增加（P < 0.05）。Hochest/PI双染色荧光显微镜下可见CDK7低表达组HEC-1-A细胞与亲代细胞比较,凋亡小体明显增多。   结论   通过CDK7 siRNA转染下调子宫内膜癌细胞中CDK7的表达以后,可以明显增强子宫内膜癌细胞对DDP的化疗敏感性,使子宫内膜癌细胞凋亡增加。CDK7可作为子宫内膜癌治疗的新靶点进行更加深入的研究。      

环氧合酶-2基因沉默对食管鳞癌花生四烯酸代谢通路的影响

  目的  探讨siRNA沉默环氧合酶-2（COX-2）对食管鳞癌（ESCC）细胞增殖的影响,观察花生四烯酸（AA）代谢酶COX-2和5-脂氧合酶（5-LOX）、其下游产物PGE₂和LTB₄及细胞凋亡相关基因表达的变化,寻找低浓度COX-2酶抑制剂引起AA代谢转向5-LOX途径并促进ESCC细胞增殖的解决方案。   方法   设空白对照、脂质体对照、随机序列siRNA和COX-2 siRNA组,筛选高效COX-2 siRNA序列作用于ESCC细胞株TE-1及Eca109,四唑单钠法检测细胞增殖、RT-PCR和Western blot检测mRNA及蛋白、ELISA法检测PGE2和LTB4,流式细胞技术检测细胞周期。   结果   与空白对照组相比,COX-2 siRNA转染后,TE-1及Eca109细胞出现增殖抑制（抑制率分别为45.86%和48.99%,均P < 0.05）;COX-2 mRNA、蛋白表达及PGE2下降（P < 0.05）,5-LOX表达及LTB4无明显变化（P>0.05）;G1期细胞比例分别为63.16 %和68.15 %（空白对照组分别为58.93%和33.02%,P < 0.05）;Bcl-2 mRNA及蛋白表达下降而Caspase-9、Bax表达上调（P < 0.05）。   结论  高效COX-2抑制可以避免COX-2低水平抑制引起的AA向5-LOX途径代谢分流,从而有效实现ESCC细胞增殖抑制。      

AT1-R对非雌激素依赖型子宫内膜癌Hec-1A细胞增殖及凋亡的影响

目的 通过建立裸鼠子宫内膜癌模型,探讨敲除AT1-R基因对非雌激素依赖型子宫内膜癌细胞Hec-1A体内生长的影响以及对ERK1/2信号通路的调控.方法 将Hec-1A细胞、敲除AT1-R基因的Hec-1A细胞分别接种至裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察各组细胞在裸鼠体内的成瘤时间和成瘤率,测量肿瘤体积、瘤质量并绘制肿瘤生长曲线;Western blot法检测瘤组织内ERK的蛋白表达;免疫组化方法检测瘤组织内Caspase-3表达.结果 与未转染组相比,敲除AT1-R基因组裸鼠移植瘤生长较慢,平均成瘤时间明显延长,成瘤率、瘤体体积和瘤质量显著减少(P<0.05);与未转染组相比,敲除AT1-R基因组的Hec-1A-si细胞ERK蛋白表达水平显著减少(P<0.05);与未转染组相比,敲除AT1-R基因组Hec-1A-si细胞Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05).结论 敲除AT1-R基因在裸鼠体内可抑制HEC-1A细胞增殖、促进HEC-1A细胞凋亡.     

XIAP siRNA对TRAIL诱导结肠癌细胞SW620凋亡能力的影响

 目的
研究XIAP siRNA对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-Inducing Ligand,TRAIL)诱导结
肠癌细胞SW620凋亡的影响。方法SW620细胞分为转染XIAP siRNA组、空转染对照组或者siRNA阴性对照组,然后给予TRAIL处理。XIAP
表达水平的变化、细胞增殖抑制、Caspase-3活性分别由Western blot、MTT法和Caspase-3荧光测定来检测。切割PARP的表达水平由
Western blot来测定。结果XIAP siRNA转染以后显著下调XIAP蛋白表达水平。和空转染对照组、siRNA阴性对照组相比,XIAP siRNA
显著增强10、100、1 000 ng/ml等浓度的TRAIL作用以后SW620细胞的增殖抑制、Caspase-3活性和激活PARP。结论 XIAP siRNA能显
著增强TRAIL诱导结肠癌细胞SW620的凋亡。     

RNA干扰CysLT2R对LTC4介导的人乳腺癌细胞生物学行为的影响

  目的   观察MCF-7细胞低表达半胱氨酰白三烯Ⅱ型受体(CysLT2R)对半胱氨酰白三烯(LTC4)介导的细胞生长、侵袭能力、细胞周期和凋亡等生物学行为的影响。   方法   针对CysLT2R的已知cDNA序列, 设计并体外转录合成4条特异性shRNA, 用脂质体介导转染入MCF-7细胞48 h, 同时设阴性对照组(1条非特异性序列转染)、正常MCF-7对照组(未转染)。Western blot检测干扰后CysLT2R蛋白表达水平下调的变化。应用噻唑蓝比色(MTT)法检测50 nM LTC4作用下细胞株生长能力; 应用流式细胞仪检测50 nM LTC4作用下细胞周期和凋亡变化; 应用趋化小室检测50 nM LTC4作用下MCF-7细胞侵袭运动活性。   结果   与正常MCF-7细胞和阴性对照组比较, MCF-7细胞CysLT2R低表达组的细胞生长增殖无明显变化(P > 0.05), 干扰后, MCF-7细胞表现出侵袭活性明显增强(P < 0.05), 细胞周期和凋亡无明显变化。   结论   CysLT2R在人乳腺癌MCF-7细胞的侵袭过程中起着一定的作用, CysLT2R有可能是一种新的乳腺肿瘤抑制基因。      

抑癌蛋白PTEN在雌激素和胰岛素样生长因子1诱导子宫内膜癌细胞ERK活化中的作用

背景与目的:雌激素和胰岛素样生长因子1(insulinlikegrowthfactor1,IGF-1)在子宫内膜癌细胞中的信号转导机制尚不清楚。本文拟研究雌激素和IGF-1在子宫内膜癌细胞信号转导中激活细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)的情况,探讨与细胞骨架蛋白同源的磷酸酶(phosphataseandtensinhomologue,PTEN)在雌激素和IGF-1诱导的ERKs活化中的作用。方法:构建野生型PTEN和突变型PTEN(G129E)的逆转录病毒载体,体外转染Ishikawa细胞,用G418筛选稳定表达的细胞系。Westernblot检测PTEN基因在Ishikawa细胞中的表达,并检测和观察17-β-雌二醇和IGF-1对细胞系Ishikawa-EGFP(对照)、Ishikawa-PTEN和Ishikawa-PTEN(G129E)ERKs活化的浓度效应和时相特点,以及17-β-雌二醇在瞬时转染pCXN2hERα和pCXN2hERβ的NIH3T3细胞中激活ERK的情况。结果:IGF-1可激活ERK,以ERK2为主。不同浓度IGF-1作用于Ishikawa-EGFP和Ishikawa-PTEN时,对ERK2活化无明显区别。40μg/L的IGF-1作用显示5min时ERK2活化最明显。PTEN在IGF-1作用Ishikawa30min、2h和24h时均能抑制ERKs活化,而在5min时没有明显作用。40μg/LIGF-1刺激Ishikawa-PTEN(G129E)5min,和Ishikawa-EGFP相比,无明显改变。17-β-雌二醇可激活ERK,以ERK2为主。不     

细胞外信号调节激酶1/2在瘦素促进子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖中的作用

背景与目的:流行病学研究提示瘦素与子宫内膜癌的发生有关,但其作用机制尚不清楚.瘦素作为促有丝分裂原,能够显著促进多种细胞的生长增殖.本研究的目的在于探讨细胞外信号调节激酶1/2(extraeellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)在瘦素促进子宫内膜癌细胞增殖中的作用.方法:免疫荧光染色检测Ishikawa细胞中瘦素受体的表达;于Ishikawa细胞中分别加入不同浓度的瘦素(0、10、50、100、150 ng/ml),作用不同时间(6、12、24h),MIT法检测各组细胞的增殖情况:同时应用ERK1/2激酶特异性抑制剂PD98059阻断ERK1/2磷酸化,观察其对瘦素促进Ishikawa细胞增殖的影响;应用免疫印迹技术检测100 ng/ml瘦素作用于Ishikawa细胞不同时间后(20、40、60 min)ERK1/2的活化水平(以P-ERK1/2与ERK1/2的比值表示).结果:免疫荧光检测结果证实Ishikawa细胞存在瘦素受体的表达:瘦素能明显促进Ishikawa细胞的增殖.在0～100 ng/ml范围内瘦素浓度越高.细胞增殖越显著,100 ng/ml瘦素作用24h其增殖效应最大(A值=0.73±0.02),100 ng/ml组与150 ng/ml组差异无统计学意义(P=0.129);PD98059能明显抑制瘦素对Ishikawa细胞的增殖作用.100 ng/ml瘦素和100μmol/L PD98059作用24h后,细胞增殖率为(6.88±0.86)%;Ishikawa细胞经100 ng/ml瘦素处理后,ERK1/2活化程度明显增高.结论:瘦素可能通过激活ERK1/2信号转导途径促进子宫内膜癌细胞的增殖.     

ERRγ对子宫内膜癌细胞移植瘤组织中Akt、ERK表达的影响

目的:以ERα（+）子宫内膜癌细胞株Ishikawa为研究对象,建立子宫内膜癌细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,进一步研究在子宫内膜癌细胞移植瘤中ERK、p-ERK、Akt、p-Akt蛋白的表达及其意义。方法:利用转染前后的Ishikawa细胞建立子宫内膜癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,采用免疫组织化学链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合物(SABC法)检测裸鼠移植瘤中ERRγ蛋白的表达情况。Western blot方法检测移植瘤组织中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白的表达情况。结果:免疫组化检测Ishikawa 细胞移植瘤组与no-silence Ishikawa细胞移植瘤组（空载体组）ERRγ蛋白表达阳性率无显著性差异（P＞0.05）,Ishikawa 细胞移植瘤组与ERRγ-shRNA Ishikawa细胞移植瘤组阳性率具有显著性差异（P＜0.05）。Western blot方法检测3组组织的活化情况:ERRγ-shRNA Ishikawa细胞移殖瘤组中Akt、p-Akt、ERK、p-ERK表达量均低于Ishikawa 细胞移殖瘤及no-silence Ishikawa细胞移殖瘤组（P＜0.05）。结论:沉默ERRγ基因的瘤组织的ERK及Akt的表达呈现低表达,从而可以推测:通过ERRγ的表达来调节ERK及Akt信号通路的表达,进一步抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖,促进其凋亡。