钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ通过介导凋亡加重H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinase II,Ca MKII)在H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤中的作用。方法:H9c2心肌细胞随机分为4组:正常对照(control)组、Ca MKII特异性抑制剂KN-93(1μmol/L)对照(KN-93)组、H/R组和KN-93+H/R组,其中KN-93组及KN-93+H/R组先用1μmol/L KN-93预处理2 h后,再进行其它处理。倒置显微镜观察各组H9c2心肌细胞的形态变化,CCK-8法检测各组H9c2心肌细胞的活力,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测各组培养基中LDH的活性,Western blot法检测Ca MKII及其底物受磷蛋白(phospholamban,PLN)的磷酸化水平以及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达,TUNEL染色和流式细胞术观察细胞凋亡。结果:与control组相比,KN-93组各项指标均无显著性差异;H/R组细胞皱缩,大量死亡,细胞活力明显降低,培养基中LDH活性明显升高(P0.01),Ca MKII及PLN的磷酸化水平和cleaved caspase-3的蛋白水平显著增加(P0.01),TUNEL染色阳性细胞数和流式细胞凋亡率显著增加(P0.01);1μmol/L KN-93干预H/R可明显改善细胞形态,增加细胞活力,降低培养基中LDH活性(P0.01),减少Ca MKII和PLN的磷酸化水平以及cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05),降低TUNEL染色阳性细胞数和流式细胞凋亡率(P0.01)。结论:Ca MKII通过介导细胞凋亡参与H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

胰岛素对新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响

目的:探讨胰岛素在新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤中对细胞凋亡的影响。方法:通过给原代培养乳鼠心室肌细胞行缺氧2 h/复氧4 h,建立缺氧/复氧(Anoxia/Reoxygenation)心肌细胞损伤模型。将培养心肌细胞随机分为:正常对照组(CON)、缺氧/复氧组(A/R)、缺氧/复氧+胰岛素组(I/R+INS)。于复氧4 h后,利用2,4二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛(MDA)含量,原位末端标记法(TINEL)和DNA梯带法(DNA Ladder)检测细胞凋亡,并比较各组间差异。结果:与A/R组相比,A/R+INS可明显降低MDA、LDH值(P<0.01),抑制心肌细胞凋亡(P<0.01)。结论:胰岛素具有减少新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤作用,其作用机制与抑制细胞凋亡作用有关。     

右美托咪定对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 观察右美托咪定对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法 H9C2心肌细胞随机分为三组:正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、Dex（5 μmol/L）干预H/R组。Dex干预H/R组先用Dex预处理6 h后,再经缺氧/复氧处理。采用倒置显微镜观察各组H9C2心肌细胞形态的变化,检测各组细胞培养基中LDH的含量,CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞的存活率,试剂盒检测caspase-3活性,TUNEL法检测细胞凋亡并计算凋亡指数。结果 与Control组相比,H/R组细胞皱缩,大量死亡,细胞活力降低,培养基中LDH含量增加,caspase-3活性增加,细胞凋亡指数增加,统计学意义显著（P＜0.01）;Dex预处理可明显改善H/R处理后细胞形态,提高细胞活力,减少LDH含量和caspase-3活性,降低细胞凋亡指数,统计学意义显著（P＜0.01）。结论 Dex可通过减少H9C2心肌细胞缺氧/复氧引起的细胞凋亡减轻损伤。     

HBSP减轻急性缺氧复氧大鼠心肌细胞损伤

目的研究促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对急性缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法体外培养H9C2乳鼠心肌细胞系,建立缺氧(3 h)/复氧(3 h)模型。实验分为对照组、缺氧/复氧组(A/R)、A/R+HBSP组。测定培养细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)含量;用annexin-V与PI双染法及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率;分离细胞质与线粒体,用Western blot法检测线粒体内和胞浆中的细胞色素C蛋白的表达,用caspase试剂盒检测心肌细胞caspase-9及caspase-3的表达。结果与正常对照组比较,A/R组细胞存活率和线粒体内细胞色素C蛋白水平明显下降(P0.01),而凋亡率、caspase-9、caspase-3活性及胞质内细胞色素C蛋白水平均显著升高(P0.01)。结论HBSP对缺氧复氧乳鼠心肌细胞具有明显的保护作用,其机制可能与抑制线粒体途径介导的细胞凋亡有关。     

黄连素对缺氧复氧诱导大鼠心肌细胞内Nrf2/Keap1的影响

目的　探讨黄连素(BR)对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤后凋亡的影响及其作用机制。 方法　将培养的H9c2心肌细胞随机分为：正常对照组(NC组)、单纯药物组(BR组)、缺氧/复氧组(H/R组)、药物低剂量LBR组(1.5×10-6 mol/L)及高剂量HBR组(1.5×10-4 mol/L)。处理结束后,用MTT比色法检测H9c2心肌细胞的活力,用Hoechst33258染色检测细胞核形态的变化,用Western blot法检测Nrf2, Keap1蛋白的表达。 结果　与NC组比较,单纯BR对H9c2心肌细胞无影响。与H/R组比较,低、高剂量BR组细胞的活力明显上升(65.2±1.6%; 82.3±1.4%) (P<0.01),心肌细胞的凋亡率明显减少(P<0.05),Western blot的结果显示,BR可明显促进抗氧化相关蛋白Nrf2表达,抑制Keap1的表达。 结论　 BR对H9c2心肌细胞H/R损伤后的凋亡具有显著的抑制作用,可能与其促进抗氧化核转录因子Nrf2表达有关。     

右美托咪定减轻氧化应激改善H9C2细胞缺氧/复氧损伤

目的 探讨右美托咪定减轻氧化应激改善H9C2细胞缺氧/复氧损伤的作用。方法 H9C2心肌细胞随机分为三组,正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、Dex（5 μmol/L）干预H/R组。Dex干预H/R组先用Dex预处理6 h后,再经缺氧/复氧处理。检测各组细胞培养基中LDH的含量,CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞的存活率,试剂盒检测caspase-3活性,试剂盒检测MDA的含量和SOD活性。结果 与Control组相比,H/R组细胞活力降低,培养基中LDH含量增加,caspase-3活性增加,MDA含量升高而SOD活性降低,统计学意义显著（P＜0.01）;Dex预处理提高H/R处理后的细胞活力,减少LDH含量和caspase-3活性,降低MDA含量,增加SOD活性,统计学意义显著（P＜0.01）。结论 Dex可通过减轻氧化应激改善H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

羟基红花黄色素A减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的观察羟基红花黄色素A(HSYA)对乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧(A/R)损伤的保护作用及其与磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(PI3K/Akt/GSK3β)信号通路的关系。方法分离大鼠的乳鼠心肌细胞,孵育48 h,待细胞贴壁后,分为:对照组(Con组)、缺氧复氧组(A/R组)、HSYA处理组(A/R+H组)、PI3K抑制剂(LY294002)处理组(A/R+L组)和HSYA+LY294002处理组(A/R+H+L)。测培养基上清液LDH;流式细胞仪检测凋亡率;Western blot检测Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt(Ser473)、GSK3β和p-GSK3β(Ser9)的蛋白表达水平。结果与对照组比较,A/R后LDH释放量和凋亡率增加(P0.001),促凋亡蛋白Bax表达增加(P0.001),而抗凋亡蛋白Bcl-2、p-Akt(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白表达减少(P0.001);HSYA处理后LDH释放量和凋亡率降低(P0.001),Bax表达减少(P0.001),而Bcl-2、p-Akt(Ser473)和p-GSK3β(Ser9)蛋白表达增加(P0.001);与A/R+H组比较,A/R+H+L组Bax表达增加(P0.001),而Bcl-2、p-Akt(Ser473)和p-GSK3β(Ser9)蛋白表达减少(P0.001)。结论 HSYA可以通过调控PI3K/Akt/GSK3β信号通路保护大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

甘氨酸脂质体对心肌细胞线粒体膜电位及凋亡的影响

目的：观察甘氨酸脂质体对缺氧/复氧损伤心肌细胞线粒体膜电位及凋亡的影响。方法:建立培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤模型，以DiOC6(3)为荧光分子探针检测实验各组心肌细胞线粒体膜电位；以Annexin V联合PI染色法检测实验各组心肌细胞凋亡率。结果:（1）H/R处理组心肌细胞线粒体膜电位明显低于对照组(P<0.01)，甘氨酸脂质体处理组心肌细胞线粒体膜电位降低最少，弱荧光部分细胞百分率为(9.61±0.76)%。与甘氨酸组比较有显著差异(P<0.01)。（2）H/R处理组心肌细胞凋亡率为(20.78±1.58)%，明显高于对照组(P<0.01)。甘氨酸脂质体处理组心肌细胞凋亡发生率低于甘氨酸组(P<0.01)。空白脂质体组细胞凋亡发生率与H/R组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:甘氨酸脂质体能抑制培养心肌细胞缺氧/复氧损伤诱导的心肌细胞线粒体膜电位下降和心肌细胞凋亡，脂质体携载甘氨酸能更好发挥其细胞保护作用。     

ROS/PKC/p38 MAPK途径在山茱萸多糖抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用

 目的:观察山茱萸多糖（polysaccharide from Fructus corni,PFC）对缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤心肌细胞的保护作用,并探讨其对ROS/PKC/p38 MAPK途径的影响。方法: 分离原代乳鼠心肌细胞,建立H/R模型,细胞分为7组：正常对照组（N组）、缺氧/复氧组(H/R组)、缺氧/复氧+PFC（终浓度20 mg/L、100 mg/L和200 mg/L）预处理组、缺氧/复氧+PFC（100 mg/L）预处理+蛋白激酶C特异性阻断剂chelerythrine（1 μmol/L）组及缺氧/复氧+PFC（100 mg/L）预处理+p38 MAPK特异性阻断剂SB203580（10 μmol/L）组。倒置显微镜下观察细胞形态和自发搏动频率,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡率,酶标仪测定ROS含量、SOD活性及LDH漏出量,免疫印迹法检测PKC、p-p38 MAPK和HSP70的蛋白水平。结果: H/R组细胞活力下降,搏动频率减慢,细胞ROS含量、LDH漏出量、细胞凋亡率及p-p38 MAPK的水平均较N组显著增加（P<0.01）。经PFC预处理后,细胞搏动频率、SOD活性及PKC、HSP70的水平较H/R 组显著增加（P<0.05,）,p-p38 MAPK的水平和细胞凋亡率均减少（P<0.05）,而PFC的保护作用能被chelerythrine或SB203580抑制。结论: 山茱萸多糖可抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤,其作用可能与增加SOD活性、抑制ROS产生、激活PKC并抑制p38MAPK的过度激活有关。     

CaMK Ⅱ通过程序性细胞坏死通路加重H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的 探讨钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)在H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型中的作用.方法 将H9c2心肌细胞分为4组:正常对照组(Control)、H/R组、CaMK Ⅱ抑制剂KN-93+ H/R组和KN-93组.H/R组是对H9c2心肌细胞进行缺氧4h,再复氧6h处理;后两组是先用KN-93(终浓度1μmol/L)预处理2h后再进行/不进行H/R损伤.采用MTT法检测各组细胞活力,碘化丙啶(PI)染色观察细胞坏死情况,Western blot法检测受体相互作用蛋白激酶(RIPK)3、磷酸化混合谱系蛋白激酶样结构域蛋白(pMLKL)和pCaMK Ⅱ蛋白的表达.结果 与Control组比较,H/R组细胞活力显著降低,PI阳性细胞数明显增多,RIPK3、pMLKL和pCaMK Ⅱ的表达水平显著增加(P＜0.01);与H/R组比较,KN-93+ H/R组细胞活力显著增加,PI阳性细胞数明显减少,RIPK3、pMLKL和pCaMKⅡ蛋白表达明显下调(P＜0.01);而KN-93组的各项指标与Control组相比无显著性差异(P＞0.05).结论 CaMK Ⅱ可通过程序性细胞坏死通路加重H9c2心肌细胞的H/R损伤.     

京尼平抑制高糖诱导的大鼠心肌H9c2细胞氧化应激及凋亡损伤

目的:探讨京尼平(genipin,GEN)对高糖损伤的大鼠心肌H9c2细胞的抗氧化作用和抑制细胞凋亡的机制。方法:体外培养大鼠心肌H9c2细胞,高浓度(50 mmol/L)葡萄糖处理H9c2细胞建立细胞损伤模型,分为正常糖对照组(NC组,葡萄糖浓度为5.6 mmol/L)、高糖损伤组(HG组,葡萄糖浓度为50 mmol/L)、正常糖+京尼平组(NC+GEN组)和高糖+京尼平组(HG+GEN组,京尼平浓度为10μmol/L)。CCK-8法检测细胞活力;酶标法和WST-1法分别测定细胞内丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性;微板法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;荧光探针DCF检测细胞内活性氧簇(ROS)水平;ELISA法检测核小体片段的聚集值;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞内线粒体膜电位变化;利用Western blot法检测线粒体内抗氧化酶锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD),以及早期凋亡蛋白细胞色素C(Cyt C)、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:与HG组比较,HG+GEN组细胞活力显著升高(P 0.05),细胞内MDA的含量及细胞上清液中LDH的活性明显降低(P 0.05),细胞内SOD活性升高(P 0.05),细胞内线粒体膜电位明显升高(P 0.05),ROS水平降低(P 0.05),核小体片段聚集程度显著降低(P 0.05)。HG组线粒体内抗氧化酶Mn-SOD比NC组降低(P 0.05),但线粒体内凋亡蛋白Cyt C、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平比NC组显著升高(P 0.05),而HG+GEN组与HG组相比,Mn-SOD升高(P 0.05),Cyt C、Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平显著降低(P 0.05)。结论:京尼平对高糖损伤的心肌H9c2细胞具有抗氧化保护作用和抑制细胞凋亡的作用。     

siRNA 技术沉默SOCS3 对缺氧复氧心肌细胞增殖、凋亡的影响以及作用机制

目的：研究小干扰RNA（siRNA）靶向沉默细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）基因对心肌细胞增殖、凋亡的影响以及可能作用机制。方法：采用脂质体Lipofectamine 2000转染大鼠H9C2心肌细胞,分为对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+siRNA NC组、缺氧/复氧+siRNA SOCS3组;免疫印迹试验（Western blot）检测细胞的转染效果;噻唑蓝（MTT）观察细胞的增殖活性,观察细胞中乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平的变化;膜联蛋白 V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶(PI)染色法检测细胞凋亡率,Western blot检测核因子-κB（NF-κB）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、c-Myc蛋白水平。结果：与对照组相比,缺氧/复氧组心肌细胞SOCS3蛋白水平显著增加（P<0.05）,细胞的增殖活性、SOD显著下降（P<0.05）,LDH、MDA、凋亡率显著升高（P<0.05）;靶向沉默缺氧复氧心肌细胞SOCS3基因表达较缺氧/复氧组细胞的增殖活性和SOD显著增加（P<0.05）,LDH、MDA、凋亡率显著降低（P<0.05）;缺氧/复氧干预心肌细胞显著抑制NF-κB、Cyclin D1、c-Myc蛋白表达（P<0.05）,下调SOCS3基因表达显著增加NF-κB、Cyclin D1、c-Myc蛋白表达（P<0.05）。结论：沉默SOCS3表达促进缺氧复氧心肌细胞增殖,抑制其凋亡,增强机体氧自由基的清除能力,其作用机制与NF-κB信号通路的激活有关。     

左西孟旦通过调控EGOT/微小RNA-641对缺氧/复氧心肌细胞纤维化的影响

目的 探讨左西孟旦（Lev）是否通过调控长链非编码RNA（LncRNA）嗜酸性粒细胞个体发育转录本（EGOT）/微小RNA（miR）-641分子轴从而影响缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞增殖、凋亡及纤维化。 方法 体外培养大鼠心肌细胞系H9C2,H/R处理细胞建立细胞损伤模型,随机分为对照（control）组、H/R组、H/R+Lev 1 μmol/L（H/R+Lev-L）组、H/R+Lev 5 μmol/L（H/R+Lev-M）组和H/R+Lev 10 μmol/L（H/R+Lev-H）组,每组9例;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;Real-time PCR 检测EGOT、miR-641的mRNA表达水平;分别将pcDNA-EGOT、EGOT小分子干扰RNA（si-EGOT）转染至H9C2细胞,采用上述方法检测细胞增殖及凋亡率;双荧光素酶报告基因实验验证EGOT和miR-641的靶向关系;Western blotting检测Bax、Bcl-2、胶原蛋白Ⅰ型（ColⅠ）、胶原蛋白 Ⅲ型（ColⅢ）、组织金属蛋白酶抑制因子2（TIMP2）、基质金属蛋白酶 2（MMP-2）的表达。 结果 与control组比较,H/R组细胞存活率降低（P＜0.05）,细胞凋亡率升高（P＜0.05）,Bax、ColⅠ、ColⅢ、TIMP2和MMP-2蛋白水平升高（P＜0.05）,Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）,EGOT的表达水平降低（P＜0.05）,miR-641的表达水平升高（P＜0.05）;与H/R组比较,H/R+Lev-L组、H/R+Lev-M组及H/R+Lev-H组细胞存活率升高（P＜0.05）,细胞凋亡率降低（P＜0.05）,Bax、ColⅠ、ColⅢ、TIMP2和MMP-2蛋白水平降低（P＜0.05）,Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05）,EGOT的表达水平升高（P＜0.05）,miR-641的表达水平降低（P＜0.05）,且H/R+Lev-L组、H/R+Lev-M组、H/R+Lev-H组各指标比较差异有统计学意义（P＜0.05）;双荧光素酶报告基因实验证实EGOT可靶向结合miR-641;转染pcDNA-EGOT与Lev的作用相似;转染si-EGOT可降低Lev对H/R诱导的H9C2细胞增殖、凋亡及纤维化的作用。 结论 左西孟旦可能通过上调EGOT表达及下调miR-641表达而促进H/R诱导的H9C2细胞增殖及抑制细胞凋亡、纤维化。     

下调miR-199a-5p对阿霉素诱导的心肌细胞凋亡的影响和机制研究

目的:探讨下调miR-199a-5p对阿霉素诱导的心肌细胞凋亡的影响和机制。方法:将心肌细胞H9C2分成Control组(常规培养的对照细胞)、DOX组(经含1μM阿霉素的细胞培养液培养)、DOX+Anti-miR-NC组(转染inhibitor control,经含1μM阿霉素的细胞培养液培养)和DOX+Anti-miR-199a-5p组(转染miR-199a-5p inhibitor,经含1μM阿霉素的细胞培养液培养)、DOX+Anti-miR-199a-5p+DKK1组(转染miR-199a-5p inhibitor,经含1μM阿霉素和20ng/ml的Wnt/β-catenin信号抑制剂DKK1的细胞培养液培养)。各组细胞处理24h以后,Realtime PCR测定miR-199a-5p表达,CCK-8测定细胞增殖,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定C-Caspase-3、β-catenin、c-Myc蛋白表达。结果:与Control组比较,DOX组细胞中miR-199a-5p水平升高,细胞增殖活性下降,细胞凋亡和C-Caspase-3蛋白表达水平升高,β-catenin、c-Myc蛋白表达水平降低(P均<0.01)。与DOX+Anti-miR-NC组比较,DOX+Anti-miR-199a-5p组细胞中miR-199a-5p水平降低,细胞增殖活性升高,细胞凋亡水平和C-Caspase-3蛋白表达水平降低,β-catenin、c-Myc蛋白表达水平升高(P均<0.01)。与DOX+Anti-miR-199a-5p组相比,DOX+Anti-miR-199a-5p+DKK1组心肌细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中C-Caspase-3蛋白表达水平升高,β-catenin、c-Myc蛋白表达水平降低(P均<0.01)。结论:下调miR-199a-5p通过激活Wnt/β-catenin信号抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。     

尼古丁促进高糖/高脂培养的大鼠心肌细胞系H9C2凋亡

目的研究在不同浓度尼古丁(Nic)条件下高糖/高脂(HGHL)对大鼠心肌细胞系H9C2凋亡的影响。方法体外培养H9C2细胞,给予不同浓度Nic(6×10^-8、6×10^-7、6×10^-6mol/L)2 h后,HGHL(33 mmol/L葡萄糖和500μmol/L棕榈酸酯)培养24 h,CCK8法检测细胞增殖;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞活力;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3及caspase3的表达及ERK1/2、JNK和p38MAPK磷酸化水平;流式细胞计量术测定细胞凋亡和上清液ROS水平。结果与对照组相比,HGHL和尼古丁联合HGHL均显著抑制细胞活力,增加上清液中LDH水平(P<0.001);HGHL及Nic+HGHL细胞凋亡率显著增加(P<0.001)及cleaved-caspase3蛋白表达明显增加(P<0.01);Bcl-2/Bax蛋白表达显著下降(P<0.01);在Nic+HGHL组,ROS水平表达最显著(P<0.001);HGHL能激活MAPK磷酸化,Nic+HGHL组ERK1/2磷酸化水平显著升高(P<0.01);ROS清除剂(NAC)能显著减少caspase3蛋白表达水平(P<0.001)。结论尼古丁、HGHL能导致H9C2细胞损伤并增加其凋亡,其发生与ROS及MAPK信号通路密切相关。     

RNA结合蛋白对大鼠胰岛β细胞株RINm凋亡的保护作用

目的:探讨RNA结合蛋白Tristetraprolin(TTP)对大鼠胰岛β细胞RINm凋亡的影响。方法:取培养增殖期的NR8383巨噬细胞,分别转染不同载体,设为空载体组(pcDNA 3.1组)、TTP过表达载体组(pcDNA 3.1-TTP组)、TTP抑制载体组(si-TTP组)、阴性对照组(si-NC组)和空白对照组(NC组),于转染后12h,更换新鲜培养基,继续培养至36h,取各组巨噬细胞和部分上清,采用RT-qPCR和Western bloting检测其TTP和白细胞介素-6(IL-6)mRNA及其蛋白表达水平。取各组剩余上清液加入体外培养大鼠胰岛β细胞株,形成与前述对应的pcDNA 3.1+RINm组、pcDNA 3.1-TTP+RINm组、si-TTP+RINm组、si-NC+RINm组和NC+RINm组,再培养24h,采用流式细胞术检测各组胰岛RINm细胞凋亡率。结果:(1)pcDNA 3.1-TTP组TTP mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组明显升高(P<0.01),IL-6 mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组明显降低(P<0.01);si-TTP组TTP mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组显著降低(P<0.01),IL-6 mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组显著升高(P<0.01)。pcDNA 3.1组、si-NC组和NC组间TTP、IL-6 mRNA和蛋白水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)pcDNA 3.1-TTP+RINm组胰岛RINm细胞凋亡率较pcDNA 3.1+RINm组明显降低(P<0.01);si-TTP+RINm组胰岛RINm细胞凋亡率较pcDNA 3.1+RINm组明显升高(P<0.01)。pcDNA 3.1+RINm组、si-NC+RINm组和NC+RINm组间胰岛RINm细胞凋亡率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:过表达TTP可能通过抑制巨噬细胞分泌炎性因子,进而抑制胰岛β细胞凋亡。     

松香酸通过诱导自噬减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激反应

目的:本文旨在探索松香酸(abietic acid,AA)对晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激的影响及其相关机制。方法:H9c2细胞分为5组:对照组加入生理盐水处理24 h;AGEs处理组加入AGEs(100 mg/L)处理24 h;AGEs+AA(10、25和50μmol/L)组同时加入AGEs(100 mg/L)和AA(10、25和50μmol/L)处理24 h。MTT法检测H9c2细胞活力。Western blot分析肌红蛋白(myoglobin,Mb)、肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、cleaved caspase-12、GADD34、Bi P、LC3、P62和beclin 1的蛋白水平。ELISA检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。流式细胞术分析细胞凋亡。结果:低浓度(低于50μmol/L)的松香酸对H9c2细胞活力无明显影响,高浓度(高于50μmol/L)的松香酸会降低H9c2细胞活力。AGEs组Mb、CK-MB和c Tn I蛋白表达及LDH的水平明显高于对照组(P0.05);与AGEs组相比,AGEs+AA(10、25和50μmol/L)组Mb、CK-MB和c Tn I的蛋白表达及LDH的表达水平明显降低(P0.05)。松香酸(10、25和50μmol/L)可抑制AGEs诱导的心肌细胞凋亡、CHOP和cleaved caspase-12蛋白水平的升高及GADD34和Bi P表达的降低(P0.05)。而且,松香酸(10、25和50μmol/L)可抑制AGEs诱导的心肌细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和beclin 1表达的降低及P62表达的升高(P0.05)。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可逆转松香酸对心肌细胞LC3、Mb、cleaved caspase-12和Bi P蛋白水平的影响(P0.05)。结论:松香酸通过诱导自噬减轻AGEs诱导的心肌H9c2细胞凋亡和内质网应激反应。     

XBP1 / CHOP / Puma 信号转导通路对高糖心肌细胞凋亡的作用研究

目的:探讨X 盒结合蛋白1(XBP1)通过调控XBP1/ CHOP/ Puma 信号转导通路对高糖诱导的H9C2 心肌细胞凋亡的影响。方法:实验分为4 组:低糖组(LG 组)、高糖刺激组(HG 组)、高糖+siRNA-NC 组(HG+NC 组)、高糖+siRNA-XBP1组(HG+siRNA 组);蛋白质免疫印迹(Western blot) 检测细胞转染后各组细胞中XBP1 蛋白、C/ EBP 同源蛋白(C/ EBP homologous protein,CHOP)、p53 上调凋亡调控因子(p53 upregulated modulator of apoptosis,Puma)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),CCK-8 法检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:siRNA-XBP1 可使心肌细胞XBP1 表达量降低(P<0.05)。与LG 组相比,HG 组、HG+NC 组、HG+siRNA 组细胞存活率均显著降低(P<0.05),凋亡率显著增高(P<0.05);与HG 组相比,HG+siRNA 组细胞存活率明显升高(P<0.05),凋亡率明显降低(P<0.05)。与LG 组相比,HG 组、HG+NC 组、HG+siRNA 组细胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3 的表达量均显著增加(均P<0.05);与HG 组相比,HG+siRNA 组细胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3 的表达量显著降低(P<0.05)。结论:XBP1 通过调节XBP1/ CHOP/ Puma 信号通路抑制高糖环境下心肌细胞凋亡、促进其增殖。     

硫化氢对肠缺血再灌注损伤大鼠回肠上皮细胞凋亡的影响

 目的: 探讨硫化氢(H₂S)对大鼠缺血再灌注(I/R)损伤回肠上皮细胞线粒体形态和功能及凋亡的影响。方法: 24只雄性Wistar大鼠随机分为假手术(sham)组、I/R组和I/R+NaHS组。建立大鼠肠I/R损伤模型。在灌注前10 min时经I/R+NaHS组大鼠尾静脉注入100 μmol/kg NaHS后按1 mg·kg^-1·h^-1输注直到再灌注2 h,实验结束后取回肠标本测定回肠上皮细胞形态和呼吸功能指标。敏感硫电极法测定血浆H₂S含量。RT-PCR检测回肠组织Bcl-2和Bax mRNA表达,Western blot 检测总caspase-3、活化型caspase-3、细胞色素C(Cyt C)、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果: I/R组线粒体的面积、体积密度、最大直径、最小直径、等效直径以及活化型caspase-3、Cyt C和Bax表达均显著大于I/R+NaHS和sham组(P<0.01)。I/R组线粒体数量、周长、比表面、面积密度和粒子数密度、血浆H₂S、R₃、R₄、RCR、P/O和Bcl-2表达均显著小于I/R+NaHS和sham组(P<0.01)。结论: 硫化氢下调活化型caspase-3、Cyt C和Bax的蛋白水平,上调Bcl-2表达,对I/R损伤大鼠回肠上皮细胞线粒体形态和功能均有保护作用。