肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞的研究进展

<正>肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)最初发现于肝组织中,是一种多功能细胞生长因子,拥有促血管生成、促细胞分裂等作用。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)具有多向分化潜能。有研究[1]表明,更多还原     

人肝细胞生长因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的: 构建含人肝细胞生长因子(hHGF)基因的骨髓间充质干细胞(MSCs),获得高表达hHGF的MSCs.方法: 构建含hHGF基因的腺病毒表达载体pDC316-HGF-IRES-EGFP.同源重组法获得含hHGF的重组腺病毒Ad-HGF.以仅表达GFP基因的重组腺病毒Ad-GFP为对照,体外分别以Ad-GFP, Ad-HGF感染MSCs.荧光激活细胞分选术检测受染细胞的基因表达效率.酶联免疫吸附测定法检测转导细胞培养上清中hHGF表达的浓度和持续时间.结果: 腺病毒表达载体经限制性内切酶切后有2.2 kb的hHGF目的基因片段和5.2 kb的线性化载体片段;目的片段测序结果与基因库中hHGF cDNA序列一致.病毒液Ad-HGF纯化后滴度可以达到8.02×1010 pfu/ml.FACS检测HGF/MSCs的GFP阳性率达95.19%.HGF/MSCs细胞培养上清中hHGF能持续表达至少14 d;最高浓度达到99 ng/ml.结论: 本实验中腺病毒表达载体构建正确;重组腺病毒液Ad-HGF滴度高;转导后在MSCs中获得高效、稳定和持续表达的hHGF.该载体达到实验设计要求,为进一步的体内外研究提供了实验依据.     

肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞迁移的影响

目的研究肝细胞生长因子（HGF）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）迁移的影响。方法采用Percoll密度梯度离心法分离BMSCs,进行表面抗原表达及分化鉴定。使用Dunn chamber装置研究BMSCs的定向迁移。并且研究PI3K抑制剂LY294002对HGF诱导BMSCs迁移的影响。结果分离培养的BMSCs呈CD29、CD90、CD106阳性表达,CD34、CD45阴性表达,BMSCs可诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞。Dunn chamber迁移实验显示,外槽加入不同浓度的HGF,BMSCs迁移速率没有变化,迁移效率随着HGF浓度的增加而增加,50ng/ml与100ng/mlHGF均显著提高了细胞迁移效率;内外槽同时加入50ng/mlHGF,迁移速率与迁移效率均没有变化;经30μmol/LLY294002预处理1h后,HGF诱导的BMSCs的定向迁移受到抑制。结论 HGF能够趋化BMSCs的定向迁移,PI3K信号通路参与介导这一过程。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）在体外定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法：采用梯度离心法分离纯化雄性SD大鼠的mMSCs。A组原代培养；B组原代培养分别加刺激因子50ng／ml肝细胞生长因子（HGF）和50ng／ml成纤维细胞生长因子4（FGF-4），倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的7、14、21、28d，细胞免疫荧光法检测各组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达。采用过碘酸希夫（PAS）染色法检测各组细胞糖原染色情况。结果：分离纯化B组大鼠的mMSCs，应用HGF和FGF-4诱导10d后变为肝细胞样圆形。细胞免疫荧光测定B组显示，培养第7dAFP即出现阳性，第21d表达明显减弱；第7dCK-19染色阳性，以后增强；第14d白蛋白与CK-18染色开始阳性，以后表达逐渐加强。A组在培养过程中不表达AFP、ALB、CK-18和CK-19。糖原染色显示，B组第14d开始阳性，-直持续到第28d；A组未见阳性染色。结论：大鼠mMSCs在较高浓度的HGF及FGF-4诱导下可分化为肝细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞

目的：研究HGF、aFGF及OSM诱导MSCs成为肝细胞的能力及其在分化中的作用。方法：用HGF、aFGF、OSM诱导分化MSCs后,用化学发光法、RT—PCR法及谷氨酸脱氢酶法检测细胞AFP、ALB及尿素的表达情况。结果：除对照组外其余各组细胞均有AFP表达（P〈0．05）;对照组及a＋O组无ALB、尿素的表达,其余各组出现ALB及尿素的表达（P〈0．05）。结论：HGF联合aFGF、OSM及aFGF能够诱导MSCs分化为表达AFP、ALB、尿素的肝细胞;aFGF与OSM在没有HGF存在时不能诱导MSCs向较为成熟的肝细胞的分化。     

骨髓间充质干细胞向肝细胞的体外诱导分化

目的：探索肝细胞生长因子（HGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、制瘤素M（OSM）诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）为肝细胞的能力及效果。方法：采用红细胞裂解＋贴壁法分离纯化大鼠骨髓MSCs,取第4代MSCs,按如下分组诱导其向肝细胞分化：①MSCs组（空白对照）：不加细胞因子;②H＋a组：20μg/LHGF＋20μg/LaFGF;③H＋O组：20μg/LHGF＋20μg/LOSM;④a＋O组：20μg/LaFGF＋20μg/LOSM;⑤H＋a＋O组：20μg/LHGF＋20μg/LaFGF＋20μg/LOSM;⑥H＋a＋O（分）组：20μg/LHGF（1～9d）＋20μg/LaFGF（9～18d）＋20μg/LOSM（9～21d）。于不同时间点采用RT-PCR检测甲胎蛋白（AFP）和细胞角蛋白18（CK18）的表达,溴甲酚绿法检测其中白蛋白（ALB）的含量,谷氨酸脱氢酶法检测其中尿素（Urea）含量。结果：除对照组外,其余各组在7～14d可见AFP mRNA的表达,21d仅a＋O组表达阳性。除对照组及a＋O组外,其余各组均出现CK18 mRNA、ALB及Urea,在同一时间点,H＋a＋O组表达量高于其余各组（P〈0.05）。结论：HGF联合aFGF/OSM能够成功诱导MSCs分化为肝细胞;aFGF与OSM不能诱导MSCs向较为成熟的肝细胞的分化,但与HGF联合使用能明显提高分化率。     

肝细胞生长因子和低氧诱导因子1修饰间充质干细胞的应用研究进展

间充质干细胞（MSC）是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞,肝细胞生长因子（HGF）是一种多功能细胞生长因子,HGF修饰骨髓MSC可以抑制骨髓MSC凋亡,提高细胞存活率.此外,MSC对缺氧反应的分子机制主要涉及低氧诱导因子1（HIF-1）信号通路,HIF-1修饰的MSC将改善干细胞移植时的缺点,降低凋亡、促进增殖,提高细胞黏附能力,促进血管生成.同时,MSC可以成为HGE和HIF-1理想的细胞表达载体,可能成为组织工程和细胞治疗等领域的研究热点.     

人肝细胞生长因子基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:构建人肝细胞生长因子(HGF)基因慢病毒载体pNL-HGF-增强绿色荧光蛋白(EGFP)并转染骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测HGF基因在BMSCs中的表达.方法:采用基因重组技术,利用限制性内切酶酶切获取HGF基因序列并克隆到慢病毒载体pNL-EGFP上,构建重组慢病毒质粒pNL-HGF-EGFP;将慢病毒...     

Notch-1蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化中的表达

目的探讨肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）、成纤维生长因子-4（fibroblastg rowth factor-4,FGF-4）和间接共培养条件下诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞定向分化可行性及Notch信号系统在此分化过程中作用。方法分别采用含有HGF、FGF-4条件诱导液单独培养骨髓间充质干细胞（bone mesenchymM stem cell,BMSC）以及Transwell培养板联合培养MSC和肝细胞,同时加入Notch-1蛋白抑制剂DAPT,通过免疫细胞化学检测白蛋白和Notch-1蛋白表达,RT．PCR检测Notch-1mRNA表达。结果条件诱导液培养第9天免疫细胞化学染色出现白蛋白表达,Notch-1蛋白及Notch-1mRNA表达降低;联合培养组第3天免疫细胞化学染色出现白蛋白表达,Notch-1蛋白及Notch．1mRNA表达降低。加入DAPT抑制Notch信号系统,提高诱导分化率。结论在一定诱导因素作用下,骨髓间充质干细胞可以向肝细胞转化,而且转化的肝细胞具有合成白蛋白功能。在此转化过程中Notch信号系统起到关键作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为肝细胞诱导条件的筛选

目的比较目前常用的诱导因素诱导MSCs分化为肝细胞的效果,以探讨大鼠骨髓MSCs向肝细胞方向分化的最佳诱导条件.方法无菌条件下取成年大鼠四肢骨骨髓分离出骨髓来源的间充质干细胞（marrowmesenchymal stemcells,MSCs）.在培养液中分别添加不同量的干细胞因子（SCF）、肝细胞生长因子（HGF）、成纤维生长因子-4（FGF-4）和不同组合的细胞因子以及不同量的肝细胞提取液,诱导MSCs向肝细胞方向分化,以未加任何诱导因素的培养液作为对照组,观察诱导细胞的形态学变化,并且应用生化检测诱导培养液上清中白蛋白和尿素的产生量,免疫组化检测分化后细胞的细胞角蛋白-18（CK18）的表达,并观察分化后细胞吲哚靛青绿（ICG）的摄入情况.结果诱导分化后的细胞呈圆形或多角形,类似肝细胞形态.未加任何诱导因素的培养细胞仍旧呈长梭形.不同用量的单一SCF、HGF和FGF-4、不同组合的细胞因子以及不同用量的肝细胞提取液均能诱导MSCs向肝细胞方向分化,但肝细胞提取液（1.0 mg/mL）组的诱导效果最佳.各诱导培养上清液中均有不同量的白蛋白和尿素的产生,诱导分化后细胞均见不同程度CK18的表达,并见分化后细胞不同程度的摄入ICG.未加任何诱导因素的细胞培养上清液中未见白蛋白和尿素产生,细胞不表达CK18,同时不能摄入ICG.结论细胞因子（SCF、HGF、FGF-4）和肝细胞提取液均能诱导MSCs向肝细胞方向分化,其中肝细胞提取液的诱导效果最佳.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨髓内的非造血干细胞,具有多向分化、低免疫源性等优势.肝移植是目前终末期肝病的有效治疗方法,但因肝源短缺及免疫排斥等缺陷,其临床运用严重受限.BMSCs经过不同的诱导方法可以在体外分化为肝细胞,应用于晚期肝病的治疗,是目前治疗肝损伤的一种新兴治疗手段.本文主要将近年来BMSCs的分离培养...     

脐血间充质干细胞向肝细胞分化的研究进展

随着对脐血干细胞的不断认识，研究者们发现脐血中含有丰富的造血干细胞。自1988年Gluckman等首次报道脐血移植治疗范科尼病以来，脐血移植已成为治疗恶性及非恶性血液系统疾病的重要方法之一。脐血干细胞的研究得到了人们的重视，世界各地已经建立了许多脐血库。2000年Erices等通过研究发现脐血中还存在有在细胞形态、免疫表型及功能特点方面与骨髓间充质干细胞相似的一类同质细胞群。自此脐血间充质干细胞（umbilical cord blood-mesenchyrmal stem cell，UCB-MSC）引起广泛关注。同时关于UBC-MSC分化能力的研究也逐步展开，现对脐血间充质干细胞及其向肝细胞的分化作一综述。     

肝细胞生长因子修饰兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究重组腺病毒肝细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞的转染率及转染后细胞的分化特点。方法获取骨髓间充质干细胞并传代培养、鉴定,以MOI=150的重组腺病毒肝细胞生长因子（Ad—HGF）对其进行修饰,以Ad—GFP检测病毒72h转染率,观察转染后细胞的成骨及成脂分化特点。结果Ad—HGF对MSCs感染效率为99．78％,成骨及成脂诱导14d后可见典型分化。结论以Ad—HGF对MSCs进行感染效果良好,可成为缺血性骨坏死较为有效的治疗手段。     

骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞相关转录因子的表达

目的 观察体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中肝细胞相关转录因子的表达和分布.方法 从大鼠骨髓中分离间充质干细胞,体外诱导分化为肝细胞.采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 比较肝细胞分化过程中转录因子肝细胞核因子4α(HNF4α)、CCAAT增强子结合蛋白α和β(C/EBPα和C/EBPβ)在诱导分化组和对照组中的表达水平;免疫荧光染色方法 检测HNF4α在细胞中的表达定位.结果 在肝细胞分化成熟过程中,转录因子HNF4α和C/EBPα的mRNA表达水平在诱导分化早期的细胞中显著高于对照组细胞,而C/EBPβ mRNA表达水平在分化成熟的细胞中显著高于对照组细胞(P<0.05).免疫荧光染色结果 显示,HNF4α定位于分化细胞核内.结论 在肝细胞分化过程中,转录因子HNF4α、C/EBPα和C/EBPβ呈特征性时序表达,表明骨髓间充质干细胞在向肝细胞分化时,肝细胞相关转录因子的表达与细胞分化的启动和维持密切相关.     

VEGF-165基因修饰的骨髓间充质干细胞移植修复犬股骨头坏死

目的研究hVEGF-165基因转染的犬骨髓间充质干细胞移植修复自体股骨头坏死的效果。方法用股骨颈截骨后克氏针再固定的方法建立犬股骨头坏死的动物模型,分为转基因间充质干细胞移植组、单纯间充质干细胞移植组和未治疗组,每组9只动物(18侧髋关节)。脂质体法将hVEGF-165基因转染进入骨髓间充质干细胞。造模后10周经大转子将细胞植入股骨头坏死区,转基因间充质干细胞和未转基因干细胞随机植入同一动物的左侧或右侧后肢。细胞移植后第2、8和12周取股骨头标本进行骨小梁定量分析,结合X线和同位素断层扫描分析3组间成骨修复的差别,并比较第12周时各组标本中截骨平面以上的血管数。结果①造模手术后10周,手术侧股骨颈骨折已愈合,但股骨头均出现典型的坏死。②骨小梁定量分析提示,在每一个时间点各组的成骨修复的差别有统计学意义:转基因间充质干细胞移植组的成骨修复好于单纯干细胞移植,未治疗组最差。X线和SPECT的表现与此相符。③12周时,转基因间充质干细胞移植组中血管数量最多,间充质干细胞移植组与未治疗组的血管数量没有统计差别。结论与未转基因的间充质干细胞移植相比,转染hVEGF-165基因后的间充质干细胞移植能够增加股骨头坏死区血管...     

脐血间充质干细胞向肝细胞诱导分化的研究进展

干细胞（Stem Cells）是一类具有多向或定向分化潜能的原始细胞。根据其发育阶段的不同,干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell）和成体干细胞（Adult Stem Cell）。胚胎干细胞具备全能分化的潜力,利用胚胎干细胞治疗疾病有着广泛的应用前景;但是胚胎干细胞的应用受社会伦理学的制约,并且在实际应用中还存在致瘤性的问题。于是研究者把目光投向了成体干细胞的研究,特别是间充质干细胞的研究。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

肝脏部分切除对骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化的影响

目的:探讨肝脏损伤对小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向肝细胞诱导分化的影响。方法:昆明系小鼠分两组,分别行肝脏2/3切除和开关腹手术,分别于术后12 h,24 h,36 h,48 h,72 h后提取MSCs,取第3代的MSCs,流式细胞仪鉴定MSCs后,应用HGF联合EGF诱导,20 d后免疫荧光染色鉴定肝细胞标志物ALB,CK8,计数ALB阳性细胞数量和同视野细胞总数,计算阳性率。结果:诱导分化20 d,两组均有ALB、CK8表达,24 h时间点,实验组阳性率(10.41±0.11)%,对照组阳性率为(9.83±0.32)%,实验组与对照组阳性率比较差异有显著性意义;其余时间点实验组和对照组阳性率比较差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:肝脏损伤后24 h,提取MSCs定向肝细胞的阳性率高。