关中黑猪IL-5 cDNA的克隆表达与多克隆抗体制备

目的 克隆关中黑猪IL-5 cDNA,构建该基因的不同表达质粒,获得表达的IL-5并制备其多克隆抗体.方法 提取佛波酯(PHA)刺激的关中黑猪外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR克隆猪IL-5基因(sIL-5),鉴定后将sIL-5基因分别克隆到pQE30、pET-32a和pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pQE-sIL-5和pET-sIL-5及pEGFP-sIL-5,将pEGFP-sIL-5瞬时转染PK-15细胞,将pQE-sIL-5和pET-sIL-5分别转化JM109和BL21,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot法鉴定表达蛋白后,通过镍柱纯化目的蛋白.用纯化的BL21表达的IL-5免疫小鼠,制备其多克隆抗体,用纯化的JM109表达的IL-5通过优化的间接ELISA检测抗体效价.结果 成功获得关中黑猪的IL-5基因(登录号KC660157),大小405 bp,与GenBank中猪IL-5参考序列同源性99.75％,仅25位的T变成C,但编码的氨基酸完全相同;荧光显微镜观察发现pEGFP-sIL-5 在PK-15细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示JM109表达的目的蛋白的相对分子质量(M,)约15 000,而BL21表达的目的蛋白Mr约30 000,Western blot法检测结果表明,表达的目的蛋白均具有良好的反应原性;免疫小鼠后获得了IL-5的多克隆抗体,抗体效价最高可达1∶12 800.结论 克隆了关中黑猪IL-5基因片段并成功表达,获得了IL-5的多克隆抗体.     

Golph2蛋白质的原核表达及多克隆抗体制备

目的:新近发现Golph2蛋白与肝癌关系密切,制备Golph2重组蛋白质和多克隆抗体,建立Western blot检测技术,为后续研究提供基础.方法:RT-PCR从人肝癌细胞株WBF44钓取Golph2基因序列,PCR回复突变制备全长完整基因(1 206 bp),将其插入至原核表达载体pET-21、转化大肠杆菌DH5a,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析纯化蛋白,SDS-PAGE鉴定.将纯化蛋白质免疫家兔,制备多克隆抗血清.建立Western blot 鉴定重组蛋白和抗血清特异性,测定临床血清标本中Golph2蛋白水平.结果:从肝癌细胞中钓取的基因,出现2个碱基置换突变和1个碱基缺失突变,经回复突变,获得与NM 177937完全一致序列.SDS-PAGE和Western blot证实,重组Golph2蛋白质与预期结果一致.抗血清能够特异地识别52 kD重组蛋白质和73 kD血清蛋白质.结论:Golph2蛋白质表达和抗血清制备完全成功,可以用于后续研究     

人硫氧还蛋白cDNA的克隆、表达及其多克隆抗体制备

目的制备硫氧还蛋白1(thioredoxin-1,Trx-1)多克隆抗体。方法从乳腺癌细胞系MCF-7中用RT-PCR的方法得到了Trx-1全长基因,将它克隆到原核表达载体上进行大量的表达和纯化,纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40d后取其血清用梯度饱和硫酸铵沉淀的方法进行多克隆抗体的纯化。用ELISA和Western印迹实验测定抗体效果。结果成功获得了Trx-1全长cDNA,通过原核表达得到了大量Trx-1蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。结论此多克隆抗体对Trx-1蛋白具有良好的识别能力,可以应用于Trx-1的功能研究。     

人前蛋白转化酶枯草溶菌素9的cDNA克隆和表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的原核表达载体并诱导其表达,制备其蛋白的多克隆抗体.方法 聚合酶链式反应扩增人工合成的pcsk9 cDNA序列;扩增产物经TA克隆、双酶切、连接,构建pET-28b-pcsk9表达载体;将重组质粒转化人大肠杆菌表达菌BL21(DE3)的感受态细胞中,诱导表达;用纯化检测过的目的蛋白免疫新西兰兔,最后采集全血收集血清,获得多克隆抗体,并对该抗体进行免疫印迹及效价测定.结果 PET-28b-pcsk9原核表达载体构建成功,用诱导表达的目的蛋白免疫动物,收集血清获得多克隆抗体.对多克隆抗体进行纯化,免疫印迹检测结果证明自制多克隆抗体特异性良好,效价测定为1∶13 200.结论 成功构建了pcsk9原核表达载体pET-28b-pcsk9,且获得了其蛋白的多克隆抗体.     

annexinA2基因片段的克隆、表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:构建人源annexinA2基因片段的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法:从GenBank(BC093056.1) 中获得人源annexinA2基因的cDNA序列并根据不含信号肽的编码序列设计引物,用PCR的方法扩增编码annexinA2基因部分序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达annexinA2的蛋白.表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化,用His抗体进行Western blot 鉴定.用纯化的目的蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得annexinA2的抗血清,通过ELISA测定兔多克隆抗体的滴度.在CaSki细胞内采用细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术(FCM)检测内源annexinA2蛋白的表达,用于鉴定制备的多克隆抗体特异性.结果:通过双酶切及测序证实原核表达质粒pET28a(+)-annexinA2构建成功,可在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导高表达,得到相对分子质量约28 000的annexinA2蛋白.纯化的蛋白免疫日本大白兔后,产生特异的高滴度的抗体(ELISA 滴度达 1:640 000).CIF和 FCM 结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性.结论:构建了annexinA2的原核表达质粒并获得高纯度的蛋白,免疫动物后,获得了特异、高效价的多克隆抗体,为人源annexinA2蛋白的生物学功能及肿瘤治疗的研究提供了实验基础.     

降钙素原基因克隆表达及多克隆抗体的制备

目的 克隆、表达降钙素原(PCT),制备相应的多克隆抗体.方法 根据GenBank上PCT的基因序列,设计10条用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技术扩增PCT基因并构建pGEX-KG-PCT重组质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白PCT-GST,然后用融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot法进行生物活性鉴定,并利用琼脂免疫扩散实验检测了多克隆抗体的特异性和效价.结果 成功获得PCT全长基因,重组质粒pGEX-KG-PCT在大肠杆菌中成功表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白相对分子质量(Mr)大小为36 000左右.利用纯化的蛋白同时制备了GST和PCT-GST多克隆抗体,琼脂免疫扩散实验显示多克隆抗体可以特异性识别PCT,效价为1∶4.结论 成功克隆、表达并纯化出PCT蛋白,制备了相应的多克隆抗体.     

人SUMO-2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:构建人SUMO-2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO-2多克隆抗体.方法:用PCR的方法得到人SUMO-2基因并克隆至pET41a( )原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、Western blot检测抗体效价和特异性.结果:测序证实重组质粒pET41a( )-SU-MO2-SUMO2构建成功;SDS-PAGE结果证实获得Mr为52 000的GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合,ELISA检测为阳性.结论:获得了人SUMO-2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO-2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具.     

中国旱獭β2m基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的 克隆、原核表达中国旱獭β2m基因,并制备多克隆抗体.方法 利用RT-PCR技术从中国旱獭脾细胞中扩增β2m基因,克隆至pET28a(+)质粒,构建原核表达载体pET-28a(+)-CWβ2m,再转化宿主菌Rosetta(DE3)pLacI诱导其表达.使用切胶回收纯化目的蛋白,将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验检测抗体的灵敏度和特异性.结果 克隆出的中国旱獭β2m基因,与GenBank已公布的土拨鼠的碱基序列一致;Western印迹结果显示克隆的β2m基因能在大肠埃希菌中高效表达,免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体.结论 成功克隆了中国旱獭β2m基因,在原核宿主中进行了高效表达,获得的多克隆抗体具有较高的效价.为人工制备MHC-Ⅰ类分子复合物,深入研究嗜肝病毒感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础.     

Orai2蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备及初步应用

目的:原核表达跨膜蛋白Orai2的GST融合蛋白,获得高敏感性、高特异性的兔抗Orai2多克隆抗体,用于Orai2条件性基因敲除小鼠鉴定及Orai2蛋白功能研究.方法:PCR扩增Orai2 CDS编码序列,亚克隆到编码GST的pGEX-6p-1原核表达载体上,将编码Orai2的pGEX-6p-1-Orai2重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Orai2融合蛋白表达,经固化的谷胱苷肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩,获得用于免疫的高纯度GST-Orai2融合蛋白.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,按常规方法免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体.Western blot检测抗体效价和特异性,并进行Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织鉴定.结果:经亲和纯化后的GST-Orai2融合蛋白纯度较高,BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度约0.35 mg/ml.抗Orai2多抗抗体效价达1:10 000.能特异性识别转染真核细胞获得的过表达Orai2,以及小鼠脑组织内源性的Orai2蛋白,而不与Orai1发生交叉反应.同时,用自制的Orai2多克隆抗体检测发现,与同窝野生型小鼠相比,Orai2条件性基因敲除小鼠脑组织中Orai2蛋白表达明显降低.结论:成功表达并纯化了GST-Orai2融合蛋白,获得了高敏感度、特异性的抗Orai2蛋白的多克隆抗体,该抗Orai2多抗能特异性识别过表达的和小鼠脑组织内源性Orai2蛋白,能对Orai2条件性基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠脑组织进行鉴定,且与Orai1没有交叉反应,为进一步研究Orai2功能奠定了基础.     

INHA基因的克隆表达以及多克隆抗体的制备

目的INHA的表达、纯化,以及多克隆抗体的制备。方法利用基因重组技术获得INHA基因以及去信号肽的INHA基因,将其都分别构建到原核表达系统并分离纯化得到相对分子质量为58000的带有组氨酸标签的重组INHA融合蛋白。用分离纯化后的INHA融合蛋白作为抗原免疫,获得抗INHA的多克隆抗体。结果成功地获得INHA基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,用间接酶联免疫吸附（ELISA）方法,Western blot检测结果显示．该抗体能特异性地与INHA的抗原以及胎盘组织产生明显免疫亲和反应。结论建立原核高效稳定INHA表达系统．获得具有生物学活性的蛋白,为进一步获得高特异性的抗体奠定基础。     

人RGS22蛋白表达及多克隆抗体制备

目的:构建人RGS22真核表达载体,表达人RGS22蛋白,制备其多克隆抗体,以探讨其在精子发生和肿瘤转移中的作用.方法:以cDNA文库为模板,用PCR法扩增人的RGS22基因.将其克隆到原核表达质粒PET22b中,构建重组质粒PET22b-RGS22.将该重组质粒依次进行PCR、酶切鉴定及测序后,转化BL21菌,以IPTG诱导表达.表达产物用质谱鉴定.纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA测定滴度.结果:用PCR法扩增出3 800 bp的RGS22基因编码框,测序证实为人RGS22基因,并在BL21菌中表达RGS22重组蛋白,用亲和层析Ni柱进行纯化得到人RGS22蛋白.质谱分析其肽混合物的肽质量指纹谱,数据库检索证实为RGS22蛋白.用纯化的RGS22重组蛋白免疫小鼠2个月后,得到相应的多克隆血清抗体,经ELISA检测,滴度均能达到1/10万.结论:制备了RGS22的多克隆抗体,为进一步研究RGS22在精子发生中的作用创造了有利条件.     

PEG10基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

肝癌是我国主要恶性肿瘤之一,其死亡率在所有肿瘤中居第二位.近年来随着诊疗手段的不断提高,肝癌的预后有所改善,但生存率仍很低.     

人FasL胞外区cDNA的克隆及表达

应用RT PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增FasL胞外区cDNA ,克隆入PCR2 1载体 ,测序验证后在大肠杆菌DH5α中表达 ,经亲和层析柱纯化 ,Westernblot鉴定所得表达产物为可溶性人FasL胞外区蛋白。     

CML66基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:获得原核表达的新的肿瘤抗原CML66蛋白,并制备兔多克隆抗体。方法:采用RT-PCR技术从睾丸中获得cML66的cDNA,亚克隆至pGEMT载体中,经测序确证后,将该基因插入原核表达载体pET32b( )中,通过电穿孔技术转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2 亲和柱层析纯化。通过SDS-PAGE、Westernblot鉴定后,应用纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:获得的CML cDNA序列与GenBank登录的cDNA序列 一致。用纯化的目的蛋白免疫家兔后,获得高滴度的特异性兔抗血清。结论:成功地克隆CML66基因,建立了原核表达、纯化体系。制备纯化的CML66蛋白和高滴度、特异的兔抗血清。     

大鼠βB2-晶体蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达并纯化βB2-晶体蛋白,制备其多克隆抗体,用以研究βB2-晶体蛋白聚合的机制。方法用RT-PCR的方法扩增了βB2-晶体蛋白的cDNA并克隆到原核表达载体pMON5473中。用萘啶酮酸诱导recA启动子后,蛋白质在大肠杆菌中得到了高效表达。表达的蛋白质用DEAE纤维素层析和凝胶过滤纯化,SDS-PAGE显示一条带。与佐剂混合后免疫新西兰大白兔。结果纯化了大鼠βB2-晶体蛋白,成功制备了其多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

人精胺氧化酶的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆、原核表达有酶活性的重组人精胺氧化酶(SMO)蛋白,并制备兔抗人SMO多克隆抗体.方法:采用RT-PCR法从人非小细胞肺腺癌A549细胞株总RNA中克隆人精胺氧化酶cDNA,构建SMO原核表达质粒pET-15b/SMO.将SMO原核表达质粒转化E.coli的BL21(DE3)菌并使用IPTG诱导重组SMO表达.表达的蛋白产物经Ni-NTA亲和层析纯化、透析复性后,化学荧光法测定其酶活性.使用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化重组人SMO蛋白,以此蛋白作为抗原皮内接种日本大耳白兔来制备抗人SMO多克隆抗体.分别以ELISA、Western blot和免疫细胞化学法检测兔血清中抗体的滴度和抗原特异性.结果:纯化并透析复性后的重组人SMO蛋白具备快速氧化精胺的酶活性.用此重组蛋白制备的抗体具有较高抗体滴度和针对人SMO的特异性.结论:建立了人SMO原核表达、纯化系统,获得了有酶活性的高纯度人SMO蛋白并成功制备了兔抗人SMO的多克隆抗体,为以SMO为靶点的抗肿瘤基础和临床研究提供了有力的研究工具.     

破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2的真核表达及多克隆抗体制备

目的：为了获得真核表达的重组蛋白OCILRP2-Fc和OCILRP2特异性抗体,用于OCILRP2生物学功能的进一步研究。方法：构建了融合人IgG Fc段的小鼠OCILRP2真核表达载体pIg-CD5-OCILRP2,将pIg-CD5-OCILRP2转染CHO细胞,G418筛选稳定表达细胞株;Protein A 亲和层析从 CHO 细胞培养上清中纯化重组蛋白OCILRP2-Fc 并免疫家兔制备OCILRP2多克隆抗体。 ELISA检测抗血清和多克隆抗体的效价,Western blot 验证多克隆抗体的特异性,并应用该抗体检测OCILRP2在树突状细胞（ Dendritic cells ,DC）中的表达。结果：ELISA结果表明OCILRP2-Fc稳定表达细胞株经过多次传代培养后仍然具有较高的蛋白表达水平;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化后的蛋白只有单一条带出现,且该条带可以被抗人IgG检测到;重组蛋白OCILRP2-Fc免疫家兔获得的抗血清和纯化后得到的OCILRP2多克隆抗体效价分别为1∶1280000和1∶320000,Western blot证明该抗体可以和免疫原OCILRP2-Fc及NIH/3T3细胞中表达的OCILRP2特异性结合。应用该抗体检测OCILRP2在 DC 的表达发现 OCILRP2在成熟 DC 的表达明显高于不成熟 DC。结论：获得了真核表达的重组蛋白OCILRP2-Fc和高效价的OCILRP2特异性抗体,为进一步研究OCILRP2在免疫应答中的功能奠定了基础。     

小鼠睾丸膜联蛋白A1的克隆、表达及定位

目的:克隆、表达小鼠睾丸膜联蛋白A1,并研究其在睾丸中的定位。方法:利用RT-PCR技术从小鼠睾丸组织中扩增膜联蛋白A1的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T。以亲和层析法纯化蛋白免疫家兔制备多抗,并做睾丸切片免疫组织化学检测。结果:重组质粒测序结果表明,插入片段与小鼠膜联蛋白A1的序列完全一致。K802重组菌高效表达出相对分子质量为63 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%。多抗效价达1∶102 400,可特异识别重组蛋白。免疫组织化学显示膜联蛋白A1主要分布于精原细胞核、精子细胞顶体帽及精子胞质残余体内。结论:成功克隆、表达了小鼠膜联蛋白A1基因;膜联蛋白A1在睾丸生精细胞中的不同分布预示其可能与生精过程有关。     

TRPM2蛋白在大肠杆菌的表达纯化和多克隆抗体制备

目的 获得人瞬时受体电位M2(TRPM2)离子通道蛋白N末端的原核表达融合蛋白,制备兔抗人TRPM2多克隆抗体.方法 采用PCR扩增编码人TRPM2蛋白N末端l～334位氨基酸残基(在人与小鼠中高度保守)的cDNA序列,将其克隆至谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-3上.将原核表达重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-TRPM2N融合蛋白的表达,并纯化获得相对分子质量(Mr)约70 000的GST-TRPM2融合蛋白.将此融合蛋白与弗氏完全佐剂混合后采用经典的4次免疫法免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用Western blot法对该抗体进行鉴定.结果 通过PCR扩增获得编码TRPM2蛋白N末端的cDNA片段并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T3中,采用IPTG诱导、蛋白质的变性与复性纯化获得融合蛋白GST-TRPM2N,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备获得特异性抗TRPM2蛋白的多克隆抗体.结论 成功制备了特异性抗人TRPM2蛋白的多克隆抗体.     

果蝇硒蛋白D-SelK原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码果蝇硒蛋白D-SelK结构基因并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗D-SelK的抗体。方法:利用PCR从pGM-T-D-SelK质粒中扩增D-SelK基因,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-D-SelK,以重组质粒转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,通过变性、电泳纯化D-SelK蛋白,SDS-PAGE和Westem blot方法鉴定目的蛋白的表达;以表达的D-SelK蛋白免疫家兔,制备抗D-SelK的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了D-SelK基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出目的蛋白,纯化后免疫家兔,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶51 200以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建D-SelK基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗D-SelK抗体,效价及特异性均良好,这为进一步研究功能特异性的D-SelK提供了有效的手段。