重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A的纯化研究

目的对重组幽门螺杆菌热休克蛋白A大肠杆菌工程菌表达的rHspA蛋白进行纯化研究。方法酵后的重组大肠杆菌进行高压破菌后,采用镍离子亲和柱层析和凝胶过滤柱层析相结合的方法分离纯化rHspA,使用SDS-PAGE和HPLC鉴定蛋白纯度,注射免疫家兔检测纯化后的rHspA的免疫学活性。结果所纯化获得的rHspA蛋白纯度>98%,总回收率为60%,并且保持了良好的免疫学活性。结论建立了从重组大肠杆菌中纯化高纯度rHspA的工艺,为Hp疫苗的进一步研究提供了材料。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

目的 获取人幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp)热休克蛋白A基因（hsqA)进行核苷酸序列分析。方法 利用PCR技术扩增HspA的DNA,并将其定向插入PinPoint^TMXa-3载体中进行核苷酸序列分析。结果 大气层克隆的HspADNA序列与GeneBank公布的序列有15个碱基存在差异。同源95.8%。结论 所克隆的HspA基因可用于重组表达及相关研究。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

目的 获取人幽门螺杆菌（Ｈｐ）热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）的ＤＮＡ（ｈｓｐＡ）,并将它克隆到质粒ＰｉｎＰｏｉｎｔ＾ＴＭ Ｘａ－３中进行核苷酸序列分析。方法 利用ＰＣＲ技术扩增ＨｓｐＡ,并将其它向插入ＰｉｎＰｏｉｎｔ＾ＴＭ Ｘａ－３载体中通过４种荧光染料标记,激光检测的方法进行核苷酸序列分析。结果 ＤＮＡ序列分析表明,所克隆的ＨａｐＡ ＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布的一致。结论 本研究获得了序列正     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究

目的：获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位（HspA）的融合蛋白。方法：PCR扩增ltB和hspA基因，依次构建至表达载体pIM-1，转化大肠杆菌，SDS-PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况。采用GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测重组LTB-HspA融合蛋白LTB组分与GM1神经节苷脂结合活性。结果：重组LTB-HspA融合蛋白表达量最高可达细菌总蛋白的25％。免疫印迹检测结果证实为重组LTB-HspA融合蛋白。GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB-HspA融合蛋白具有与GM1神经节苷脂结合的活性。结论：LTB-HspA融合蛋白的表达研究，为研制幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗打下了基础。     

幽门螺杆菌Lpp20重组蛋白的表达、纯化及其免疫活性初步研究

目的表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)脂蛋白Lpp20基因的重组蛋白,并检测其免疫活性。方法应用PCR技术从H.pylori标准株26695染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段,将其克隆至表达载体pGEX-6P-2上,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21中表达并进行GST亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物重组Lpp20(recombinantLpp20,rLpp20)的免疫反应性。免疫C57BL/6小鼠后,以rLpp20为包被抗原建立间接ELISA法对免疫小鼠血清进行特异性抗体检测;ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4水平;MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应等指标以分析rLpp20的免疫活性。结果扩增的lpp20全长528 bp,与GenBank上公布的H.pylori 26695株lpp20序列作BLAST比较,结果完全一致;成功构建了pGEX-6P-2/Lpp20重组质粒,表达的rLpp20 M_r 43 000,纯化产物可被鼠抗H.pylori抗体识别;以...     

幽门螺杆菌Omp11重组蛋白的表达、纯化和抗原活性鉴定

幽门螺杆菌（Hp）外膜（outer membrane）是革兰阴性细菌表面的一种连续性结构,其作为免疫攻击的潜在靶标在人体保护性免疫反应中具有重要的作用.     

幽门螺杆菌GroEL蛋白重组表达及表达产物小鼠免疫保护作用

目的 检测幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列差异,确定重组表达的GroEL蛋白(r-GroEL)抗原性、免疫反应性以及对幽门螺杆菌感染小鼠的免疫保护性.方法 采用PCR及测序法了解幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列.构建幽门螺杆菌groEL基因pET42a-E.coli BL21DE3原核表达系统,采用SDS-PAGE及凝胶图像分析系统确定rGroEL表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL.采用ELISA和Western blot检测rGroEL的抗原性和免疫反应性,采用幽门螺杆菌全菌为包被抗原的ELISA确定GroEL膜定位.采用幽门螺杆菌小鼠感染模型了解rGroEL免疫保护作用.结果 35株幽门螺杆菌临床菌株groEL基因序列相似性高达99.4％～ 100％.rGroEL表达量可达细菌总蛋白的56％,SDS-PAGE后提纯的rGroEL在凝胶中显示为单一的条带.rGroEL可诱导家兔和小鼠产生高效价IgG抗体,同时也能被幽门螺杆菌全菌抗体(Hp-IgG)或rGroEL-IgG识别并与之结合.GroEL是幽门螺杆菌表面蛋白抗原.50、100或200 μg rGroEL免疫可分别使50.0％ (6/12)、75.0％ (9/12)和91.7％ (11/12)小鼠免于幽门 螺杆菌SS1株的感染,200 μg rGroEL免疫保护率(91.7％)显著高于50μg rGroEL(50.0％)( P＜0.05).结论 幽门螺杆菌GroEL蛋白是序列保守、具有良好免疫原性和免疫保护性的表面抗原,可作为基因工程疫苗候选抗原.     

幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的分离纯化

在对Ｈｐ毒力因子进行的研究中 ,发现ＣａｇＡ基因是Ｈｐ高毒力株的标志基因。其编码产物 细胞毒素相关蛋白Ａ(ＣａｇＡ)是引起人类严重胃部疾患的主要因素之一 ,ＣａｇＡ基因并不存在于所有的Ｈｐ菌株中 ,在中国人中约有 90 %感染者含有此基因。该基因已被克隆和测序 ,含有ＣａｇＡ基因与不含ＣａｇＡ基因的菌株在致病能力上存在显著的差异。目前一致认为含ＣａｇＡ基因的Ｈｐ菌株为高毒株 ,与消化性溃疡 ,萎缩性胃炎及胃癌的发生密切相关。ＣａｇＡ蛋白位于细胞表面 ,是一种亲水性免疫显性蛋白 ,可刺激患者机体产生相应的ＩｇＧ和ＩｇＡ抗…     

重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗鼻腔免疫的实验研究

目的:探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果。方法:以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠。末次免疫7 d后,收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液,用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体。结果:rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高,与对照组相比较差异显著(P<0.01)。20μg剂量组与10μg剂量组相比较,仅血清特异性IgG水平增高,其它黏膜特异性IgA的水平未见增高。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强,卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平。结论:CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂。HprUreB鼻黏膜接种,不仅可诱导血清特异性抗体反应,而且能引起多个黏膜部位的免疫应答,是一种方便、有效、廉价的免疫途径。     

幽门螺杆菌双亚单位基因疫苗的构建及免疫原性研究

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）两个保护性亚单位UreB、HspA融合基因疫苗并观察其免疫原性。方法：从Hp基因组分别扩增出UreB、HspA基因片段,采用重叠延伸PCR方法将两个基因片段构建融合基因,以BglⅡ和XhoⅠ酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,经测序确认后转染COS-7细胞,Western blot检测目的蛋白表达,胫前肌注射免疫小鼠后收集血清检测特异性抗体效价。结果：经测序后证实成功将融合基因构建到真核表达载体中,免疫印记检测到目的蛋白表达,并具有良好的抗原性,免疫小鼠后能够产生特异性抗体。结论：成功构建Hp双价DNA疫苗,免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,为Hp进一步基因疫苗的研究奠定了基础。     

热休克蛋白与肿瘤免疫

热休克蛋白（ＨＳＰｓ）作为分子伴侣参与蛋白的合成,折叠、装配、运输和降解。许多肿瘤细胞表面可以高表达ＨＳＰｓ,它能与癌基因、抑癌基因产物结合现认为ＨＳＰｓ具有伴移抗原肽的作用。肿瘤组织中提取的ＨＳＰ－肽复合物可以作为肿瘤排的,诱导肿瘤特异免疫,产生特异细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）,特异杀伤肿瘤细胞。这种作用在同种间不受ＭＨＣ－１类分子限制,具有很好的临床应用前景。本文主要综述ＨＳＰ－肽复合物与肿瘤免疫     

热休克蛋白与肿瘤免疫

热休克蛋白 (HSPs)作为分子伴侣参与蛋白的合成、折叠、装配、运输和降解。许多肿瘤细胞表面可以高表达HSPs ,它能与癌基因、抑癌基因产物结合。现认为HSPs具有伴移抗原肽的作用 ,肿瘤组织中提取的HSP—肽复合物可以作为肿瘤排斥抗原 ,诱导肿瘤特异性免疫 ,产生特异细胞毒性T细胞 (CTL) ,特异杀伤肿瘤细胞。这种作用在同种间不受MHC 1类分子限制 ,具有很好的临床应用前景。本文主要综述HSP—肽复合物与肿瘤免疫的相关进展。     

热休克蛋白与抗感染免疫

热休克蛋白(heatshockproteins,HSPs)又称为应激蛋白,由多基因家族及相关基因产物诱导产生,参与高度保守的细胞防御机制.作为细胞内分子,HSPs参与蛋白成熟必要的生化途径,对于正常细胞自稳状态的维持起重要作用.除上述分子伴侣功能外,HSPs还具有另一种重要的生物特性--免疫原性.在感染引起的免疫性疾病的发生和发展中,HSPs具有防止感染应激引起的细胞损害和促进受损细胞恢复等重要作用.作为感染过程中体液和细胞免疫的重要靶目标,HSPs用于感染性疾病的疫苗研究日益受到人们的关注.     

热休克蛋白与抗感染免疫

热休克蛋白（ＨＳＰｓ）普遍存在于所有细胞内,在各种有害刺激下,细胞通过改变基因表达的方式,诱导ＨＳＰｓ的产生而启动内源性保护机制。ＨＳＰｓ引起自身免疫反应。在感染引起的免疫性疾病的发生和发展中,ＨＳＰｓ具有防止感染应激引起的细胞损害和促进受损细胞恢复等重要作用。     

幽门螺杆菌cag4蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的:构建幽门螺杆菌cag4蛋白的原核重组体系,表达、纯化融合蛋白。方法:利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。结果:成功扩增了cag4基因基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出pET-28a-cag4融合蛋白;优化了pET-28a-cag4原核表达体系的最适条件;Western bolt分析结果显示表达的基因重组蛋白与目的蛋白相符;酶谱分析显示其具有明显的肽聚糖水解活性。结论:幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

热休克蛋白与免疫应答

近年研究发现,热休克蛋白参与免疫应答过程,在抗原受体成熟,抗原加工,呈递等多方面起作用,并且这种作用具有潜在的临床应用前景,本文综述这一领域的研究现状。     

热休克蛋白70的抗肿瘤免疫效应研究

目的 :研究HSP70诱导的抗肿瘤免疫效应 ,为应用其治疗人类恶性肿瘤提供实验依据。方法 :应用细胞培养、液相色谱法、电泳技术、Western blot法等获得高纯度肿瘤中的HSP70 ,将其应用于同源的 61 5系小鼠 ,观察其抗肿瘤免疫效应。结果 :HSP70免疫后的小鼠能够抵抗同种肿瘤细胞的攻击 ,其中 1 0 μg免疫后的小鼠 1 0 0 %获长期生存 (>90d) ,无一死于肿瘤 ,5μg免疫后的小鼠肿瘤进展受到抑制 (平均生存 2 8 2± 4 8d) ,但无一小鼠获长期生存 ,上述两组与对照组 (平均生存 1 8 3± 3 6d)相比差异均具有显著性 (P <0 0 1 )。HSP70对荷瘤小鼠的治疗研究证明 ,5μgHSP70有一定的治疗作用 ,荷瘤小鼠平均生存 31 3± 2 9d ,而 1 0 μgHSP70治疗组的小鼠生存期 >58 8± 33 7d ,其中 40 %的小鼠所接种肿瘤完全消退 ,获长期生存(>90d) ,与其他组相比 ,差异具有显著性 (P <0 0 1 )。结论 :HSP70可诱发强大的抗肿瘤免疫效应 ,并且有良好的治疗作用 ,对于研究利用HSP70治疗人类的恶性肿瘤有重要的参考意义。