细胞因子对HCV基因疫苗诱生免疫反应的增强作用

目的 探讨细胞因子对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗诱生免疫应答强度的增强作用。方法 将包含ＨＣＶ－Ｃ蛋白的基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建重组质料ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,将此重组质粒单独或与包含鼠ＩＬ－２或ＩＬ－１２基因的表达质粒共免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测ＨＣＶ Ｃ特异性抗体产生情况,以ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ转梁小鼠ＳＰ２／０细胞,表达ＨＣＶ Ｃ抗原为靶细胞,进行     

HCV核心蛋白DNA疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

目的：观察丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体液免疫应答的效力，为研制应用于人类的ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗提供实验依据。方法：将全长ＨＣＶ核心蛋白基因插入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１，构建ＨＣＶ核心蛋白重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＨＣＶｃｏｒｅ，肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＨＣＶ抗体。以此重组质粒转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以ＨＣＶ抗体阳性小鼠血清为捕获抗     

脂质转染剂增强基因疫苗诱导的免疫应答效力

目的 研究脂质转染剂（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）提高丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗的抗病毒免疫应答效力。方法 人工构建包含ＨＣＶ Ｃ基因片段的的真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡＨＣＶ－Ｃ,在证实期可以在真核细胞中表达之后,将期用脂质转剂包裹,形成ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ－ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ脂质混合物,将该混合物或单纯ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ直接注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠股四头肌,以空载体ｐｃＤＮＡ     

双位点核酶细胞内抑制乙型肝炎病毒基因的表达

目的：构建针对乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｃ区基因（２０２９－３１及２０６３－６５位点）的双位点核酶的真核表达载体,观察其在细胞内对ＨＢＶ基因表达抑制作用。方法：利用亚克隆从质粒ｐＧＥＭＲｚ１２３切下ＥｃｏＲ－ＢａｍＨＩ片段,双粘端克隆于真核质粒ｐＢＢＳ２１２中,将该质粒与ｐ１．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）共转染ＨＨＣＣ细胞（人肝癌细胞株）。观察该核酶对ＨＢＶ基因表达的抑制作用。结果：在ＨＨＣＣ细胞中Ｐ１．２     

HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）中片段表面抗原真核表达质粒和Ｅ抗原真核表达闰。方法 将编码ＨＢＶ中片段表面抗原（ｐｒｅＳ２＋Ｓ）的基因片段和Ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ＿的基因片段分别插入真核细胞表达载体（ｐＪＷ４３０３）中,构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物。结果 电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体。经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达ｐｒｅＳ２＋Ｓ和ＨＢｅＡｇ     

显微注射法建立含荧光素酶和HCV-C基因细胞模型

目的 建立带有报告基因的ＨＣＶ５’ＮＣＲ，Ｃ区细胞模型，方法 通过亚克隆技术，重组ＨＣＶ ｃＤＮＡ片段与荧光素酶基因（１ｕｃ）融合的真核表达质粒，经显微注射导入人肝癌细胞Ｈｅｐｇ２，ｇ４１８筛选后检测Ｃ蛋白 表达和荧光素酶活性。结果 成功地将ＨＣＶ５’ ＮＣＲ和Ｃ区ｃＤＮＡ与１ｕｃ融合，并与ｐｃＤＮＡ３载体重组，构了该事例基因的真核表达质粒ｐｃＨＣＶｃｌｕｃ；染ＨｅｐＧ２细胞后获得有效表达，持续１     

核酶对2.2.15细胞中HBeAg表达抑制作用的初步观察

目的：观察针对Ｈ了Ｃ区双位点核酶对２．２．１５细胞中ＨＢｅＡｇ表达的抑制作用。方法：利用亚克隆技术,从质粒ｐＧＥＭ－Ｒｚ１２３切下ＥｃｏＲ１－ＢａｍＨ１片段克隆于真核表达质料ｐＢＢＳ２１２中,将该质料转染２．２．１５细胞,用ＥＬＩＳＡ及免疫组化方法观察该核酶对ＨＢｅＡｇ合成的抑制作用。结果：细胞表达出针对ＨＢＶ Ｃ区核酶,该核酶对ＨＢｅＡｇ的抑制制达４８．６％。结论：该双位点核酶可能通过针对ＨＢＶ     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因—ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＳＶ２ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株—Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５Ｓ细胞。斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５Ｓ细胞可作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ的靶细胞。进一步对Ｐ８１５Ｓ细胞成功地进行５１Ｃｒ标记，以及标记靶细胞５１Ｃｒ最大释放值和自然释放值的测定表明：利用５１Ｃｒ释放法体外检测近交系小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ功能的方法被建立。     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的：探讨用人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）早期基因Ｅ６羧基端基因片段（Ｅ６Ｃ）研制ＤＮＡ疫苗的可行性。方法：采用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＰＶ１６中获得Ｅ６Ｃ端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染ＬＡ７９５小鼠肺腺癌细胞并检测Ｅ６Ｃ的表达。结果：成功构建了真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ,免疫组化结果显示真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ在ＬＡ７９５细胞中获得有效表达。     

乙型肝炎病毒X蛋白单克隆抗体的制备及肝癌组织中相应抗原的检测

应用基因工程技术制备的１７０００乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ蛋白（ＨＢｘＡｇ）免疫动物，成功地制备了抗－ＨＢｘ单克降抗体，以此抗体对原发性肝癌（ＨＣＣ）组织、慢性活动性肝炎（ＣＡＮ）肝组织行相应抗原检测，并同时进行乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）的检测。在ＨＣＣ标本中ＨＢｘＡｇ在癌内及癌周肝组织中的阳性率分别为５６％及４８％，ＨＢｓＡｇ为１６％及７４％。ＨＢｃＡｇ仅见于癌周，阳性率为１８％。在ＣＡＨ标本中，ＨＢｘＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ阳性率分别为６．６％、７３．３％及０。血清ＨＢｓＡｇ阳性ＨＣＣ标本中，ＨＢｘＡｇ的检出率为８２．３％、明显高于血清ＨＢｓＡｇ阴性标本（５４．５％）。结果显示。ＨＢｘＡｇ在ＨＣＣ标本中的表达是ＨＢＶ标志物中最活跃的。ＨＢｘＡｇ的表达不依赖于ＨＢＶ的复制，可能是ＨＢＶＸ基因同宿主细胞基因整合后的产物，ＨＢｘＡｇ在ＨＣＣ标本中的活跃表达为抗－ＨＢｘ抗体作为ＨＣＣ导向治疗载体提供了依据。     

利用PCR技术构建GM—CSF／Fcγ2融合蛋白载体

目的：构建 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术,将人 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ基因与人免疫球蛋白 Ｉｇ Ｇ２ 的 Ｆｃ 段基因联接,构建融合基因ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２;并将此片段定向克隆到真核表达质粒ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２ 载体。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示 Ｐ Ｃ Ｒ扩增出了 １．３ ｋｂ 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体的构建。结论：（１）经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增技术由质粒 Ｐ Ｃ Ｄｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ和 Ｐ Ｓ Ｖ Ｖ Ｎ Ｐ Ｈ Ｖ２ 分别扩增到了所需的ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段和 Ｉｇ Ｇ２ 从绞链区到 Ｃ Ｈ３ 的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 片段。（２）利用 Ｐ Ｃ Ｒ介导,扩增出了融合基因片段ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２。（３）构建了真核细胞表达载体ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２／ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２ 。     

乙型肝炎病毒核心抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞作用的靶细胞的建立

目的建立ＨＢｃＡｇ特异性ＣＴＬ作用的靶细胞系统,为进一步研究ＨＢＶ基因变异对ＣＴＬ细胞毒效应的影响奠定基础。方法采用两种质粒ｐＸＴ１和ＥＢＯ－ｐｌｐｐ构建ＨＢＶＣ基因真核细胞表达载体并转染水生化Ｂ细胞,ＤＮＡ分析和流式细胞仪检测ＨＢＶＣ基因在宿主细胞中的复制、表达。结果在转染重组质植ｐＸＴ１－ＨＢＶｃ和ＥＢ０－ｐｌｐｐ－ＨＢＶｃ的Ｂ细胞中,均能检测到目的基因;分另有８９．８１％和８８．５１％的宿主细胞能检测到ＨＢｃＡｇ;连续培养３周后,分别有８８．３０％和７２．１９％的宿主细胞表达ＨＢｃＡｇ。结论重组逆转录病毒表达载体ｐＸＴ１－ＨＢＶｃ和ＥＢ病毒表达载体ＥＢＯ－ｐｌｐｐ－ＨＢＶｃ转染的永生化人外周血Ｂ细胞能有效地表达靶抗原（ＨＢｃＡｇ）,可作为较为理想的ＨＢＶ特异性ＣＴＬ作用的靶细胞。     

反义基因转移表达及抗乙型肝炎病毒的作用

目的观察重组逆转录病毒载体－包装细胞系统介导反义基因转移表达和抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法将ＨＢＶａｙｗ１４０２－２９０６片段和２８３９－１９８６片段反向插入重组逆转录病毒载体质粒，分别转染ＰＡ３１７包装细胞，分别感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞和２．２．１５细胞。结果转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。ＨＢＶ反义基因重组逆转录病毒感染２．２．１５细胞后第３天，表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）表达量减少，感染后第５天，ＨＢＶ抗原表达抑制率达高峰。ｐｒｅＳ／Ｓ片段反义基因转移后，ＨＢｓＡｇ表达抑制率为７１％，ＨＢｅＡｇ抑制率为２３％；ｐｒｅＣ／Ｃ片段反义基因转移后，ＨＢ－ｓＡｇ表达抑制率为２３％，ＨＢｅＡｇ抑制率为５９％。结论逆转录病毒载体－包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞内转移和表达，并对ＨＢＶ复制和表达均有抑制作用。     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因－ｎｅｏ基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５－Ｓ细胞，斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５－Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５－Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５－Ｓ细胞要作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠Ｈ     

重组质粒DNA—抗原—抗体复合物诱生乙型肝炎表面抗体的研究

本文研究了高编码乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因的重组质粒ＤＮＡ（ｐＣＭＶ－ＨＢｓ）对ＨＢｓＡｇ，抗．ＨＢｓ免疫复合物（ＩＣ）诱生抗－ＨＢｓ的影响，在Ｂａｌｂ／ｃ小鼠中，ＩＣ加ｐＣＭＶ－ＨＢｓ（１００μｇ）免疫组比单独使用ＩＣ或ｐＣＭＶ－ＨＢｓＤＮＡ缚诱生的抗－ＨＢｓ效价高，虽然略低于ＩＣ加氢氧化铝组，但无明显差异，在ＩＣ中加２０μｇｐＣＭＶ－ＨＢｓＤＮＡ，经再次免疫亦可有效地诱生高效价的抗     

丁型肝炎病人肝组织HDAg与HBsAg/HBcAg和HBV DNA表达及关系

目的：探讨丁型肝炎病人肝组织中ＨＤＡｇ与ＨＢｓＡｇ／ＨＢｃＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ表达及关系。方法：应用免疫组化双重染色和原位杂交,检测７９例丁型肝炎病人肝组织ＨＤＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ表达,以５２例乙型肝炎作对照。结果：丁型肝炎ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ检出率（８１％、７１％）较乙型肝炎（９４％、９２％）低（Ｐ〈０．０５或０．０１）。ＨＤＡｇ以肝细胞核表达为主,ＨＢｓＡｇ以肝细胞浆表达     

佐剂CpG ODN对HBV基因疫苗诱导抗体产生的影响

目的 探讨人工合成的ＣｐＧ ＯＤＮ作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生抗ＨＢｓ的影响。方法 构建编码乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原蛋白Ｓ的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,人工合成含ＣｐＧ ｍｏｔｉｆ的硫代磷酸寡核苷酸作为佐剂,以ＢＡＬＢ／ｃ小鼠作为实验动物进行免疫接种,采用ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠的抗ＨＢｓ应答。结果 与生理盐水作为佐剂组相比较,应用ＣｐＧ ＤＯＮ组小鼠产生更     

抗HBeAg单克隆抗体重链可变区基因的PCR法克隆和测序

本文应用ＰＣＲ技术从ＨＢｅＡｇ单克隆抗体鼠─鼠杂交瘤细胞基因组ＤＮＡ中扩增出重链可变区基因（ＶＨ）,并将ＶＨ基因与ｐＵＣ１９载体连接,转化ＪＭ１０９菌,克隆出ＶＨ基因。重组质粒ｐＵＣ－ＨＢｅＡｇＶＨ经荧光核酸测序表明,该ＶＨ基因大小为３２７ｂｐ,编码１０９个氨基酸。     

白细胞介素—2—乙肝病毒前S抗原融合蛋白在真核细胞中的分泌…

为了协同人白细胞介素－２与乙型肝炎病毒前Ｓ抗原的生物学功能，探索能打破持续性感染者对ＨＢＶ表面抗原的免疫耐受，诱导机体对ＨＢｓ－Ａｇ和ｐｒｅＳＡｇ产生体液和细胞免疫应签的基因免疫与治疗药物，用基因重组方法构建了ＩＬ－０２和ＨＢＶ完整ｐｒｅＳＡｇ的真核表达合基因及表达质粒ｐＣＷＩＩＰ。ｐＣＷＩＩＰ转染的Ｃｏｓ－７细胞能分泌表达ＩＬ－２－ｐｒｅＳ融合蛋白，其表达效率与ｐＣＩＩＬ－２转染的细胞表达ＩＬ－     

乙型和丙型肝炎重叠感染患者肝组织免疫组织化学双标记研究

探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）重叠感染患者肝组织中病毒的复制状况和相互关系。方法采用免疫组织化学双标记技术，以抗－ＨＣＶＮＳ３、抗－ＨＣＶＮＳ５单克隆抗体和抗－ＨＢｓ、抗－ＨＢｃ多克隆抗体，检测２５例尸检肝组织中ＨＣＶＡｇ和ＨＢＶＡｇ的分布和表达。结果ＨＢ－ｓＡｇ和ＨＣＶＮＳ３Ａｇ同时阳性１１例，ＨＢｓＡｇ和ＮＳ５Ａｇ阳性１２例，ＨＢｃＡｇ和ＨＣＶＮＳ３Ａｇ及ＨＣＶＮＳ５Ａｇ阳性各１０例。几乎所有单标记染色阳性切片，其双标记染色也阳性。感染ＨＣＶ或ＨＢＶ的肝细胞各呈灶性、散在或弥散混杂分布，在重叠感染肝组织中，与ＨＢＶ复制有关的表达类型，如ＨＢｓＡｇ膜、浆型和ＨＢｃＡｇ浆型以及ＨＣＶＮＳ３Ａｇ和ＨＣＶＮＳ５Ａｇ的检出例数，同单纯感染组相比差异无显著意义（χ２＝０．１５４及０．１９８，Ｐ＞０．０５）。结论乙型和丙型肝炎病毒在重叠感染时，两种病毒在肝组织内可能不存在互相干扰和抑制。