三种不同冷冻保护剂对小鼠附睾冷冻效果的比较

目的 探讨三种不同冷冻保护剂对C57BL/6J小鼠附睾冷冻的效果。方法 性成熟并交配过的6-8周龄C57BL/6J雄鼠附睾，分别用3种不同冷冻保护剂二甲基亚砜 (DMSO)、丙二醇 (PROH)、R18S3进行玻璃化冷冻、复苏和精子采集，观察比较三个实验组的复苏精子形态、存活率以及生殖能力。结果 三组冷冻复苏分离后的精子形态完整，具有镰刀头状结构；荧光染色后PROH组精子存活率为 (88.17±3.43)%，明显高于DMSO组：(61.17±10.65)% 和R18S3组(16.83±6.49)%（P<0.05）；经辅助体外受精后均具有受精能力。获得的胚胎移植后可得到正常子代小鼠 (DMSO : PROH : R18S3 = 13 : 8 : 17）。结论 3种冷冻保护剂均适用于C57BL/6J小鼠附睾冷冻，但PROH冷冻效果较好。     

抗冷冻蛋白Ⅲ对小鼠胚胎冷冻保护的作用

目的将抗冷冻蛋白III(AFPIII)应用于小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻保存,观察其对细胞微丝骨架结构和冷冻复苏后发育潜能是否有保护作用。方法收集小鼠2-细胞期胚胎1 200枚,随机分为新鲜对照组、玻璃化冷冻组和添加AFPIII玻璃化冷冻组(AFPIII终浓度为500 ng/mL),每组400枚,其中200枚胚胎进行复苏后囊胚培养,200枚进行细胞微丝的免疫荧光染色,比较各冷冻组胚胎复苏存活率和其后的囊胚形成率以及各组微丝完整胚胎比率。结果添加AFPIII玻璃化冷冻组胚胎复苏率高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05)。新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组囊胚形成率、微丝完整胚胎比率均高于玻璃化冷冻组,差异有统计学意义(P<0.05);新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AFPIII对小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻有保护作用。     

单胚胎玻璃化冷冻对小鼠胚胎体外发育的影响

目的:比较单胚胎玻璃化冷冻与慢速冷冻对小鼠分裂期胚胎损伤和体外发育的影响,探讨使用玻璃化冷冻保存大量胚胎的可行性。方法:选择8-细胞胚胎随机进行改良的玻璃化和慢速冷冻,复苏后培养至囊胚孵出,计数胚胎复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、细胞团数、孵出率,并进行组间比较分析。结果:玻璃化冷冻组复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、孵出率、细胞团数分别为100%、12.7%、75.7%、66.4%、112,慢速冷冻组分别为87.1%、31.0%、35.5%、58.7%、78,除囊胚孵出率其余各指标两组间差异均具有统计学意义。结论:单胚胎玻璃化法冻存小鼠分裂期胚胎复苏后细胞成活率高,结构完整,更好的保持了胚胎的发育潜能。     

不同胚胎冷冻方法对人类早期胚胎解冻后的复苏效果及临床结局的影响

目的 比较玻璃化冷冻与程序化冷冻对人类早期胚胎解冻后复苏效果及临床结局的影响.方法 辅助生殖技术获取的剩余可利用人类胚胎2 884枚,其中采用玻璃化冷冻复苏666个周期,解冻胚胎1 516枚、复苏1 383枚、移植胚胎1 375枚;程序化冷冻复苏506个周期,解冻胚胎1 368枚、复苏1 090枚、移植1 077枚.比较两种方法的复苏效果及临床结局.结果 玻璃化冷冻组胚胎复苏率、胚胎完整率分别为92.02％、92.11％,高于程序化冷冻组的79.68％、69.63％(P＜0.05);两组种植率、临床妊娠率、周期取消率、多胎妊娠率、早期流产率、新生儿胎龄、早产率、新生儿出生体重、出生缺陷率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 玻璃化冷冻较程序化冷冻有更高的胚胎复苏率及胚胎完整率,胚胎利用率高,两种冷冻方法的临床结局相似,适用于人类胚胎的冷冻.     

三种冷冻保护剂对新生小鼠睾丸组织冷冻效果的比较

目的探讨三种不同冷冻保护剂对新生C57BL／6J小鼠睾丸冷冻的效果。方法5日龄C57BL／6J雄鼠睾丸组织,分别用3种不同冷冻保护剂（二甲基亚砜〈dimethyl sulfoxide,DMSO〉、丙二醇〈propylene Glycol,PROH〉、EFS20／40）进行玻璃化冷冻。复苏冷冻后的睾丸组织,每组一部分进行组织学分析,另一部分进行组织移植,移植后检测关键基因表达水平以及卵胞质内单精注射,并设相应对照组。结果3个实验组睾丸组织形态改变与对照组相比均具有显著性差异（P〈0．01）,其中EFS组分值最低即改变最小;原位移植8周后组织块生长发育,存活率分别为DMSO组16．7％、PROH组13．3％、EFS组23．3％,存在成熟精子;睾丸组织特异性基因pgk-2和TESK1正常表达;卵胞质内单精注射表明移植后睾丸内精子均具有受精能力,胚胎移植后可得到正常子代小鼠（DMSO：PROH：EFS=5：2：8）。结论3种冷冻保护剂均能良好保存睾丸组织结构和功能。其中,EFS方法保存的睾丸组织形态改变最小、功能完善更适于睾丸组织的冷冻。     

玻璃化冷冻法对冻融胚胎移植周期结局的影响

目的:探讨玻璃化冷冻法对冻融胚胎移植周期结局的影响.方法:对324个玻璃化冷冻人卵裂期胚胎复苏周期和146个程序化慢速冷冻胚胎复苏周期进行分析,比较2组冷冻胚胎复苏后的存活率、完整率、种植率、临床妊娠率、孕周、新生儿身高及体质量等指标.结果:玻璃化冷冻组的胚胎完整率、临床妊娠率均高于程序化慢速冷冻组(83.24％ vs...     

玻璃化冷冻方法中冷冻保护剂及制冷速度对家兔卵母细胞纺锤体的影响

目的:探讨玻璃化冷冻方法中冷冻保护剂及制冷速度对家兔第二次减数分裂中期卵母细胞纺锤体的影响.方法:以冷冻环为载体,单用乙二醇(ethylene glycol,EG)或乙二醇与二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)联合作冷冻保护剂,用直投液氮或使用玻璃化冷冻仪高速制冷冷冻家兔卵母细胞;解冻2 h后固定并免疫荧光法染色纺锤丝及染色体;用共聚焦扫描显微镜观察纺锤体形态.结果:在单用EG以及EG和DMSO联合直投液氮的方案中,纺锤体损伤较严重,但在EG和DMSO联合应用并采用玻璃化冷冻仪提高制冷速度的方案中,纺锤体形态正常的比例与对照组相似.结论:玻璃化冷冻方法中采用冷冻保护剂联合及采用玻璃化冷冻仪高速制冷对保持解冻后家兔卵母细胞纺锤体形态效果最好.     

玻璃化冷冻方法三种冷冻载体冻存卵裂期胚胎效果的比较

目的应用冷冻环、冷冻膜和自制麦管片三种冷冻载体,采用玻璃化冷冻方法冻存昆明小鼠卵裂期胚胎,比较三种载体的冻存效果。方法采集通过体外受精在体外培养第2天得到的4-8细胞期的昆明小鼠胚胎247个,对其中177个按载体不同随机分为冷冻环组59个,冷冻膜组59个,自制麦管片组59个;剩余的新鲜胚胎70个作为对照组,比较冻融后鼠胚的复苏率和囊胚形成率。结果冷冻环组、冷冻膜组和自制麦管片组的胚胎复苏率分别为98.3%、98.3%和94.9%,三组比较差异无统计学意义（P〉0.05）;冷冻环组、冷冻膜组和自制麦管片组的囊胚形成率分别是84.5%、86.2%和82.1%,三组比较无统计学差异（P〉0.05）;新鲜对照组囊胚形成率为94.3%,与冷冻环组、冷冻膜组分别比较无统计学差异（P均〉0.05）,与自制麦管片组有统计学差异（P〈0.05）。结论采用玻璃化冷冻方法冻存小鼠卵裂期胚胎,使用冷冻环和冷冻膜作为冷冻载体具有复苏率高、囊胚形成率高的优点,更适合应用于临床。     

胚胎玻璃化冷冻技术在辅助生殖治疗中的应用

目的探讨人类卵裂期胚胎玻璃化冷冻在临床治疗中的应用效果。方法经患者知情同意后,将实施体外受精一胚胎移植术患者第3天移植后剩余的符合冷冻标准的胚胎进行玻璃化冷冻保存。如果新鲜周期妊娠失败,根据患者情况解冻胚胎,观察胚胎复苏后的临床妊娠效果。结果玻璃化冷冻84个周期,解冻胚胎207枚,解冻后存活胚胎198枚,存活率为95．7％;完整存活胚胎187枚,完整存活胚胎率为90．3％;种植胚胎41枚,种植率为19．8％;临床妊娠28倒,临床妊娠率为33．3％。早期流产3例,足月分娩5例,20例继续妊娠。结论玻璃化冷冻法适于人类早期胚胎的冷冻保存,获得了理想的复苏率、种植率和妊娠率。     

人类卵子改良程序化冷冻和玻璃化冷冻的比较研究

【】目的：研究两种冷冻方法对人类卵子冻融结果的影响。方法：分为程序化冷冻卵子与玻璃化冷冻卵子两组,对于卵子冻融后的复苏率、受精率以及优质胚胎率等指标进行比较。结果：程序化冷冻组卵子的复苏率(71.05%,108/152)显著低于(P<0.05)玻璃化冷冻组(81.75%,103/126),但优质胚胎率(41.07%,23/56)显著高于(P<0.05)玻璃化冷冻组(30.23%,13/53),而受精率、卵裂率及囊胚形成率无统计学差异。结论：玻璃化冷冻卵子可以获得较高的复苏率,但使用改良程序化冷冻试剂盒冻融卵子,可能较玻璃化冷冻获得更好发育潜能。     

EDS-40玻璃化冻存小鼠卵母细胞的研究

目的设计研究玻璃化液EDS一40对冻贮小鼠卵母细胞的效果。方法①按随机分组原则，分为实验组和对照组，实验组（a）采用自行设计的EDS一40玻璃化液进行玻璃化冷冻（其配方为：40％乙二醇＋18％葡聚糖），对照组（b）采用国际上已证实效果较好的EFS-40J~璃化溶液进行玻璃化冷冻，对照组（c）采用以PROH为基础的程序冷冻液进行程序冷冻。首先对EDS一40和EFS-40玻璃化溶液，行玻璃化测试；再随机选用小鼠卵母细胞，在室温25℃下分别加入EDS-40和EFS．40玻璃化溶液，玻璃化后装管并迅速投入液氮中。对照组（c）置于程序冷冻仪中进行程序化冷冻。各组均冻存2mo-3mo后，在25℃的水浴中复温后，用培养液反复洗涤后移入培养孔板培养，观察卵母细胞的成活率。将成活的卵母细胞行体外受精，观察其受精率。结果①两种玻璃化溶液能达到玻璃化效果；②EDS一40、EFS一40及对照组冷冻复温后的存活率依次为：79．34％、67．94％、56．34％；⑤EDS一40、EFS-40及对照组冻卵的受精率分别：79．17％、66．29％、51．25％。结论①EDS一40可以用来玻璃化冷冻小鼠卵母细胞；②EDS一40较EFS一40玻璃化溶液冻存小鼠卵母细胞效果更好；③玻璃化技术比传统冷冻法效果更好。     

Wistar大鼠肾结石形成过程的动态观察研究

目的　观察Wistar大鼠肾结石形成的动态过程。方法　2016年3月选取6周龄左右SPF级雄性Wistar大鼠60只,适应性饲养1周后随机分为空白对照组（NC组,n=30）和乙二醇组（EG组,n=30）。NC组大鼠正常饮水,2 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃2周;EG组大鼠饮用1% EG溶液,2 ml 2%氯化铵溶液灌胃2周。连续10周观察两组大鼠一般情况,每周处死3只,每周检测两组大鼠血、尿生化指标,肉眼及解剖显微镜下观察大鼠肾脏解剖情况,并分析两组大鼠肾脏结晶分级及结石形成情况。结果　观察期间EG组大鼠垫料有血尿,造模期间于第8周死亡1只,第9周死亡1只。造模1~2周时两组大鼠进食良好、安静温顺。造模3~8周时,NC组大鼠无特殊表现,EG组大鼠表现为烦躁兴奋、活泼好动。造模9~10周EG组大鼠表现为精神疲倦,针刺反应迟钝,活动度减少,食量减少;NC组大鼠无特殊表现。EG组大鼠造模第2~10周血肌酐、血尿酸均高于NC组（P<0.05）。EG组大鼠第3~8周尿素氮高于NC组（P<0.05）。EG组大鼠第2周、第4~10周尿钙高于NC组（P<0.05）。EG组大鼠第5~10周血钙高于NC组（P<0.05）。EG组大鼠第6~10周血磷、血镁高于NC组（P<0.05）。EG组大鼠第2~8周尿pH值低于NC组（P<0.05）。两组大鼠第1~10周尿比重、尿量比较,差异无统计学意义（P>0.05）。EG组大鼠第3~10周肾体比高于NC组（P<0.05）。造模第1~2周,肉眼观察两组大鼠肾脏无明显差异。造模第3周开始,肉眼观察EG组大鼠部分肾脏较NC组略有增大。造模第6周以后,肉眼观察EG组大鼠肾脏肿大;解剖显微镜下可见晶体以肾盂为中心呈扇形分布。造模第6周以后,肉眼观察NC组大鼠肾脏表面光滑,解剖显微镜下亦未见明显结晶。EG组大鼠肾脏结晶分级高于NC组（Z=-5.195,P<0.001）。EG组大鼠结石检出率高于NC组（χ2=21.172,P<0.001）。结论　采用EG加氯化铵法建立的肾结石模型大鼠在造模第3周开始形成结石,肾结石模型大鼠明显较空白对照大鼠精神疲倦,活动度及饮食量减少,血、尿生化指标明显改变,肾体比明显升高。     

不同浓度冷冻保护剂乙二醇在人扩张囊胚玻璃化冷冻中的应用

目的研究不同浓度冷冻保护剂乙二醇(ethlene glycol,EG)在人扩张囊胚玻璃化冷冻中的应用。方法不同浓度EG 15%,30%,40%,联合15%二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO),0.5 mol/L蔗糖(sucrose),采用两步法,利用改制半麦管为冷冻载体,玻璃化冷冻人扩张囊胚。比较解冻后囊胚存活率,扩张率及孵出率;并比较微吸管吹吸、辅助孵化针刺破胞膜辅助脱水及未辅助脱水对冷冻扩张囊胚的影响。结果由1原核(pronucleus, PN)发育而来的扩张囊胚玻璃化冷冻解冻后囊胚存活率15%EG组明显高于30%及40%EG组(P<0.05)。由2PN 发育成的扩张囊胚玻璃化冷冻解冻后囊胚孵出率15%EG组明显高于30%及40%EG组(P<0.05)。在冷冻过程中给予人工辅助脱水组解冻后囊胚孵出率明显高于未辅助脱水组(P<0.05)。微吸管吹吸组与辅助孵化针刺破胞膜辅助脱水组囊胚孵出率差异无显著性(P>0.05)。结论15%EG为人扩张囊胚玻璃化冷冻中有效和合适浓度。玻璃化冷冻中给予人工辅助脱水,能提高解冻后囊胚的发育潜能。     

结直肠癌化疗联合自体多种免疫细胞治疗疗效观察

目的比较结直肠癌患者自体多种免疫细胞联合化疗与单纯化疗后细胞免疫功能变化和生存期差异。方法83例结直肠癌患者分为化疗组43例,化疗联合自身多种免疫细胞治疗组（联合组）40例;用血细胞分离机采集患者自身外周血单个核细胞（PBMC）,将PBMC按常规方法分别诱导培养CD3AK细胞、CIK细胞、树突状细胞（DC）、7gT细胞和NK细胞;用流式细胞仪检测治疗前后患者外周血的CD3（＋）、CD4（＋）、CD8（＋）、CD19（＋）、CD16（＋）CD56（＋）、CD4／CD8和3,gT细胞比值及PBMC中穿孑L素、颗粒酶B和CD107a阳性表达率。2组患者化疗方案都采用草酸铂＋亚叶酸钙＋5-氟脲嘧啶静脉输注;联合组在化疗基础上接受免疫细胞治疗。结果联合组治疗后的免疫细胞亚群比值和绝对值显著高于化疗组。联合组与化疗组Karnofsky评分差异有统计学意义。联合组患者治疗后PBMC的穿孔素、颗粒酶B及CDl07a均高于治疗前,并且治疗后这3种指标数值均皿著高于化疗组。联合组患者1午、2年和5年生存率分别为70．o％、20．0％和10．0％,高于化疗组（分别为23．2％、7．0％和4．6％）;其中Ⅱ期、Ⅲ期患者的1年、2年和5年生存率及Ⅳ期患者的1午生存率2组间比较差异有统计学意义,而Ⅳ期患者的2年、5年生存率2组间比较差异无统计学意义。结论化疗联合自身综合性免疫细胞治疗进展期结直肠癌能提高患者的免疫功能,延长生存期。     

Ⅱ～Ⅲ期食管癌治疗模式探讨

目的探讨Ⅱ～Ⅲ期食管癌合理的综合治疗模式。方法将115例食管癌患者随机分为三组进行临床研究,A组42例行化疗＋放疗（或手术）＋化疗,B组39例行放疗＋化疗,C组34例行手术＋化疗;放射治疗均采用6MV直线加速器常规外照射,化疗采用DF／CF方案,A组放疗（或手术）前后应用DF／CF方案化疗2～3周期,B、C组放疗或手术后应用DF／GF方案化疗4～6周期,三个组均随访3年。结果A组1、2、3年生存率,B组1、2、3年生存率,C组1、2、3年生存率分别为71.4％、52．4％、42．9％,74．4％、35．9％、23．1％,64．7％、32．4％、17．6％;A组的2、3年生存率明显高于其他二组（P〈0．05）,且无严重不良反应;局部控制率三组比较差异无统计茕意义（P〉0．05）,但A组的远处转移率明显低于B、C组（P〈0．05）。结论化疗＋放疗（手术）＋化疗是Ⅱ～Ⅲ期食管癌较为合理的治疗模式,值得临床进一步研究。     

Comparison of the Developmental Potential and Clinical Results of In Vivo Matured Oocytes Cryopreserved with Different Vitrification Media

Background:

Oocyte vitrification is widely used throughout the world, but its clinical efficacy is inconsistent and depends on the vitrification media. This study compared the developmental potential and clinical results of in vivo matured oocytes cryopreserved with different vitrification media.

Methods:

This retrospective study involved vitrified-warmed oocytes at one in vitro fertilization laboratory. Vitrification media kits comprised the MC kit (ethylene glycol [EG] plus 1,2-propanediol [PROH]), the KT kit (EG plus dimethyl sulphoxide [DMSO]), and the Modified kit (EG plus DMSO and PROH kit). Rates of oocyte survival and subsequent developmental potential were recorded and analyzed. The t-test and the Chi-square test were used to evaluate each method''s efficacy.

Results:

Oocyte survival rate was significantly higher for the Modified kit (92.0%) than for the MC kit (88.2%) (P < 0.05) and the KT kit (77.3%) (P < 0.001). The rate of high-quality embryo development in the Modified kit group (35.8%) was significantly higher than in the MC kit group (29.0%) and the KT kit group (28.3%) (P < 0.001). No significant differences were observed in the clinical pregnancy and implantation rates among the MC, KT, and Modified kit groups (37.2% vs. 30.2% vs. 39.6%; 21.9% vs. 18.8% vs. 27.4%, respectively) (P > 0.05). The high-quality embryo rate per warmed oocyte was significantly higher (23.4%) in the Modified kit group than in the other groups (P < 0.001). The embryo utilization and live birth rates per warmed oocyte were the highest in the Modified kit group, but not significantly (P > 0.05).

Conclusions:

Modified vitrification media are efficient for oocyte vitrification and, with further verification, may be able to replace commercially available media in future clinical applications.     

丙泊酚对百草枯引起的PC12细胞氧化损伤的保护作用

目的：探讨不同浓度丙泊酚对百草枯（Paraquat, PQ）导致的PC12细胞损伤的保护作用。方法以PQ损伤PC12细胞作为自由基损伤细胞的模型,将培养的PC12细胞分成4组：正常对照组、DMSO对照组、PQ组、PQ＋丙泊酚组;PQ＋丙泊酚组再分为丙泊酚12.5、25、50μmol/L 3个亚组组。采用CCK-8法分析细胞存活率,测定乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的变化。结果与对照组比较,PQ组细胞存活率明显降低,丙泊酚可使损伤细胞的存活率增加,差异有统计学意义（P〈0.01）,其提高程度呈剂量效应关系。与对照组比较,PQ组LDH的释放量明显增加、SOD活性显著降低、MDA含量显著增加（P〈0.05）;丙泊酚可显著降低损伤细胞LDH的释放、增加损伤细胞SOD的活性、降低MDA含量,且呈剂量效应关系（P〈0.05）。结论丙泊酚通过降低氧化损伤来减轻PQ诱导的PC12细胞毒性。     

不同时期胚胎线粒体拷贝数与胚胎自身形态学分型的关系研究

目的:探讨人类不同形态学分型的卵裂期胚胎和囊胚与自身线粒体拷贝数的关系。方法:选择在生殖中心因女性双侧输卵管梗阻行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕顺利娩出健康胎儿后,自愿丢弃冷冻的卵裂期胚胎和囊胚用于科学研究。将冷冻的胚胎解冻复苏后,依据胚胎发育的时期,将所有胚胎分为卵裂期胚胎冷冻组（D3冷冻胚胎组,n=63）和囊胚冷冻组（D5冷冻胚胎,n=82）,再根据冷冻胚胎的形态学评分标准,将冷冻卵裂期胚胎分为优质胚胎组（n=38）和较差胚胎组（n=25）,将冷冻囊胚分为优质囊胚组（n=52）和较差囊胚组（n=30）。采用实时PCR检测胚胎线粒体拷贝数,比较不同阶段胚胎和相同阶段不同质量的胚胎与自身线粒体拷贝数的差异。结果:D3冷冻胚胎组线粒体拷贝数明显低于D5冷冻胚胎组（t=9.34,P<0.02）,D3冷冻胚组中优质胚胎mtDNA拷贝数高于质量较差胚胎组（t=6.62,P<0.01）,D5冷冻胚组中优质胚胎mt DNA拷贝数明显高于质量较差胚胎组（t=8.03,P<0.04）。结论:不同时期胚胎mt DNA拷贝数对胚胎的发育潜能有重要影响,mtDNA拷贝数越高,胚胎质量越好。     

两种胚胎冻融方法对累积妊娠率的影响

目的比较玻璃化法和程序法对人第3天卵裂期胚胎冻融移植周期累积妊娠率的影响。方法选取程序化冻融周期92例、玻璃化法冻融周期179例,比较分析这两种冻融方法在存活率、累积临床妊娠率等方面的效果。结果玻璃化法在胚胎复苏存活率(94.3%vs53.9%,P<0.01)、复苏完整胚胎形态(89.4%vs36.3%,P<0.01)、累积临床妊娠率(28.2%vs43%,0.010.05)。结论与程序化法比较,玻璃化法可以提高累积妊娠率,是一种高效胚胎冻融方法 。