一种新型调控基因表达的反义寡核苷酸:LNA

LNA(lockednucleicacid)是新近发现的一种新型调控基因表达的反义寡核甘酸 ,它以RNA为骨架 ,亚甲基键连接核糖环中的 2′ 氧和 4′ 碳。这种锁套式的结构 ,增加了LNA与其互补序列的亲和力并为基因表达的调控和微阵列的研究提供了一个新的研究途径     

人羊膜FL细胞CROC-1基因表达反义阻断后的 生物学特性研究

目的 :ＣＲＯＣ - 1是人细胞中新发现的基因 ,其酵母同源基因ＭＭＳ2是一个抗增变基因。本研究用反义策略建立ＣＲＯＣ - 1基因表达阻断细胞系 ,分析ＣＲＯＣ - 1基因在细胞生理活动中的作用。方法 :1 ＣＲＯＣ - 1反义ＲＮＡ表达质粒构建 :用ＡＣＣＩ酶从ｐＢＳ -Ｃｒｏｃ- 1Ｂ上切出 840ｂｐ长ｃＤＮＡ片断 ,两端填平后分别连上ＳａｌＩＬｉｎｋｅｒ,ＳａｌＩ酶切后将此目的片断连到改建的地塞米松诱导表达载体多克隆位点的ＳａｌＩ切点上 ,通过酶切图谱分析筛选ＣＲＯＣ - 1反义ＲＮＡ表达重组子 ;2 细胞转染及筛选 :反向表达重组子用…     

反义RNA体外抑制丙型肝炎病毒基因表达的研究

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因调控方式及反义RNA对HCV基因表达的体外抑制作用。方法 采用业已建立的HCV基因调控细胞模型，以重组质粒共转染策略，将反义RNA重组质粒与HCV5′非翻译区(5′UTR)调控的报道基因——虫荧光素酶(luc)重组质粒共同转染人肝癌细胞系(HepG2)，并以不表达反义RNA的原核重组质粒和不含有HCV5′UTR的luc重组质粒做为对照。转染细胞经短期培养后制备细胞提取液，荧光检测法检测luc基因的表达。结果 针对HCV5′uTR的反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR调控的luc基因的表达，并具有剂量依赖效应。对照重组质粒转染实验证明，上述抑制作用呈序列特异性。结论 HCV5′UTR具有调控下游目的基因表达的重要功能，反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR介导的病毒基因的表达。     

反义RNA阻断Hep G2细胞FasL的表达及功能研究

应用分子克隆技术将人FasLcDNA片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN ,构建重组质粒pL (hFasL AS )SN ,转染包装细胞PA317后获得FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体假病毒上清 ,经NIH3T3细胞检测其感染滴度后转染肝癌细胞株HepG2细胞并筛选建系 ,命名为HepG2 hFasL AS。半定量RT PCR检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的mRNA明显少于正常HepG2细胞 ;FACS检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的表达与HepG2细胞相比显著下降 ;同时 ,HepG2 FasL AS细胞导致HL 6 0细胞凋亡能力有所下降。表明人FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体能抑制转染细胞FasL的表达并下调其致凋亡功能     

Polo-like激酶1反义RNA对肺癌细胞A549生长的实验研究

目的:探讨Polo-like激酶1(Plk1)基因表达下调对肺癌细胞周期分布及其生长的影响。方法:培养肺腺癌细胞株A549,构建表达Plk1反义RNA的质粒pcDNA3-Plk1,通过脂质体介导转染A549细胞,采用RT-PCR和Western blotting的方法检测Plk1基因的表达,细胞计数、BrdU脉冲标记检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期变化和凋亡,MTT法检测长春瑞宾(NVB)对各组细胞的生长抑制率。结果:A549细胞转染pcDNA3-Plk1后24h,Plk1mRNA及蛋白表达均下降;细胞变圆、漂浮、增殖减慢;S期细胞百分数(BrdU标记指数)显著低于对照组(P<0.05);转染后48hA549细胞出现G2/M期阻滞(P<0.05)并发生凋亡;等浓度化疗药物诺维本对转染pcDNA3-Plk1细胞的抑制率明显高于各对照组(P<0.05),转染pcDNA3与未转染的对照细胞差异无显著(P>0.05)。结论:pcDNA3-Plk1的转染能下调Plk1基因的表达,抑制A549细胞增殖,诱导凋亡,并能增加A549细胞对化疗药物的敏感性。     

个体性反义RNA对乳腺癌细胞突变p53基因表达的特异性封闭作用

目的研究针对p53基因突变的个体性反义RNA对乳腺癌突变p53基因的特异性封闭作用。方法通过免疫细胞化学LSAB法染色、聚合酶链反应-单链构象多态性分析及测序确定人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中p53突变位点,构建针对该突变点的反义表达载体并制备其反义RNA。原位杂交技术检测反义RNA与细胞内突变p53基因的特异性结合;在阳离子脂质体介导下将反义RNA转染细胞;以免疫细胞化学LSAB法染色及细胞生长抑制率观测反义RNA作用时效;Western blot检测p53蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐法检测转染细胞的生长活性;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期分布;原位缺口末端标记法检测转染细胞的凋亡情况。结果人乳腺癌细胞系MDA—MB-231的p53第8外显子（exon8）有突变,据此位点构建反义表达载体[pGEM3zf（＋／-）p53exon8]。原位杂交结果显示反义RNA（ASp53exon8＇RNA）在细胞质内有阳性杂交信号;于转染后48h反义RNA封闭效果最显著,突变p53蛋白（mt-p53）的表达受抑制,细胞增殖能力下降,G2／M期阻滞。结论针对p53基因突变位点制备的个体性反义RNA可特异性封闭乳腺癌细胞突变p53基因的表达。     

表达反义细胞周期蛋白cyclinD1载体对胰腺癌细胞生长和凋亡的 …

观察反义细胞周期蛋白ｃｙｃｌｉｎＤ１对胰腺癌细胞的生长影响。方法采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｍｂｌｏｔ方法检测了５株人胰腺癌细胞中ｃｙｃｌｉｎＤ１的扩增及表达情况。     

反义周期蛋白B1基因抑制HT29细胞的增殖

用ＤＮＡ重组技术将人类ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的全长ｃＤＮＡ，反向插入到真核表达载体ｐＸＪ４１－ｎｅｏ的ＢａｍＨ１位点，得到ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的反义ＲＮＡ表达载体ｐＡＳ－Ｂ１。利用ＤＮＡ磷酸钙共沉淀方法，将ｐＡＳ－Ｂ１转染进ＨＴ２９细胞。在含有Ｇ４１８的培养基中，挑选出独立的细胞克隆。利用ｃｙｃｌｉｎＢ１ｃＤＮＡ作探针，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交鉴定出一株内源性ｃｙｃｌｉｎＢ１ｍＲＮＡ受到抑制的细胞株ＨＴＢ１。比较ＨＴＢ１与对照细胞ＨＴ２９发现，ｃｙｃｌｉｎＢ１的反义ＲＮＡ明显抑制ＨＴ２９细胞的增殖，细胞内３Ｈ－ＴｄＲ参入量减少。流式细胞光度术分析，处于Ｇ１期细胞比率的升高与Ｓ期、Ｇ２＋Ｍ期细胞数量的下降都十分显著。     

反义RNA技术的应用与进展

反义 RNA技术作为反义核酸技术之一 ,已在越来越广泛的领域得到应用。本文在与反义寡核苷酸技术进行比较的基础上 ,系统地介绍了反义 RNA技术方法及在各领域的应用。相信随着对基因功能研究的广泛开展及基因治疗研究的深入 ,反义 RNA技术必将成为一种有力的工具 ,在基因功能研究方面 ,特别是在后基因组研究中做出巨大贡献     

反义人端粒酶RNA对胃癌细胞生长的抑制效应

目的 探讨反义人端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）对胃癌细胞的生长抑制作用。方法 将反义ｈＴＲ真核表达载体经脂质体介导转染入胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化、生长速率及致瘤性。结果 反义ｈＴＲ在潮霉素筛选的阳性克隆中稳定表达,正义ｈＴＲ表达下调,并出现凋亡改变。基因转染细胞体外传代培养的生长速率大多减慢,在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。荷瘤鼠存活时间延长。结论     

反义核酸抑制miR-20、miR-106表达对293T细胞增殖的影响

目的:通过反义核酸技术抑制miR-20、miR-106的表达,检测对293T细胞增殖的影响。方法:应用特异性针对miR-20、miR-106的反义核酸转染293T细胞,用形态学、流式细胞技术研究反义核酸对细胞增殖的抑制作用,用定量PCR和ELISA研究miRNA和相关靶基因的表达。结果:研究发现反义核酸可有效抑制miR-20和miR-106的表达,并明显抑制293T细胞的增殖;研究还表明反义miR-106可明显上调抑癌基因Rb的表达。结论:反义核酸通过抑制miRNA表达,上调抑癌基因Rb的表达,能明显抑制293T细胞增殖。     

靶向MR-1基因shRNA表达载体的构建及其对白血病K562细胞增殖的抑制作用

目的 构建一种靶向MR-1基因的shRNA稳定表达载体,并检验其对白血病K562细胞增殖能力的影响.方法 以带有H1启动子可稳定表达靶基因shRNA的pCD-shRNA为载体,采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pCD-shRNA并回收线性空载体,采用T4 DNA连接酶将MR-1shRNA模板DNA双链与酶切后线性化的载体连接,从而建立稳定表达MR-1-shRNA的载体.将构建的pCD-shRNA-MR-1载体转染人白血病K562细胞,建立稳定沉默MR-1的细胞系,采用细胞计数法和westem blot对MR-1沉默后细胞的增殖能力和信号通路进行检测分析.结果 成功构建了可稳定表达MR-1-shRNA的载体pCD-shRNA-MR-1,经酶切鉴定及基因测序测定,结果表明载体中的MR-1-shRNA与设计序列完全相符,目的基因序列准确无误.将pCD-shRNA-MR-1转染白血病K562细胞,建立了两株稳定沉默MR-1的K562/MR-1细胞株.细胞增殖实验表明,MR-1稳定沉默细胞的增殖能力显著降低;细胞信号通路结果表明,MR-1稳定沉默细胞Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平降低.结论 利用pCD-shRNA质粒构建了一个可表达MR-1-shRNA的表达载体,该载体转染K562细胞后引起细胞增殖能力降低.研究表明MR-1基因在肿瘤细胞增殖过程具有促增殖作用,其机制是降低Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平.     

打点杂交及RNA酶保护分析法检测反义HSP90基因转染细胞中反义RNA的表达

目的：检测HSP90反义核酸转染细胞后反义RNA的表达。方法：采用打点杂交及RNA酶保护分析法。结果：HSP90反义核酸转染细胞AH－SGC7901,AH-SGC7901／VCR,AH－HCC7402及AH－Ec109有HSP90反义RNA的表达。结论：HSP90反义RNA在AH－SGC7901,AH－SGC7901／VCR,AH－HCC7402及AH－Ec109细胞的表达,为进一步研究HSP90在细胞生物学中的作用建立了可靠的细胞模型。     

反义封闭PKARⅠβ基因表达对双龙接骨丸含药血清体外促成骨细胞增殖作用的影响

目的:进一步明确cAMP依赖的磷酸激酶Ⅰ型调节亚基β(PKARⅠβ)在双龙接骨丸含药血清促进体外培养成骨细胞增殖过程中的作用。方法:构建表达 PKARⅠβ基因反义序列的重组子pcDNA-antiPKARⅠβ,脂质体法转导成骨细胞HFOB1.19,MTT法检测其增殖状况。结果:高剂量含药血清处理的反义基因封闭组中,HFOB1.19的增殖能力与空白血清对照组无显著差异(P>0.05)。结论:双龙接骨丸含药血清的体外促成骨细胞增殖作用与PKARⅠβ基因的表达密切相关。     

反义RNA对培养的肾小管上皮

目的:探讨骨调素(OPN)反义RNA对培养的肾小管上皮细胞骨调素表达的影响。方法:脂质体介导将表达OPN反义RNA的逆转录病毒重组载体转染大鼠肾小管上皮细胞系NRK52E细胞,建立稳定表达OPN反义RNA的肾小管上皮细胞克隆,以转染了表达OPN顺义RNA和空白逆转录病毒载体的肾小管上皮细胞克隆为对照,以表皮生长因子(EGF)为刺激剂,通过核酸酶保护分析(RPA),WesternBlot,ELISA和OPN生物活性分析检测上述克隆细胞的OPN表达。结果:OPN反义RNA仅被反义克隆细胞表达,反义克隆、顺义克隆和空白克隆细胞均有OPNmRNA的表达,EGF能增加它们OPNmRNA的表达水平,但不增加反义RNA或顺义RNA的表达水平;加或不加EGF的反义克隆细胞和不加EGF的空白克隆细胞无OPN蛋白的表达,加或不加EGF的顺义克隆细胞和加EGF的空白克隆细胞有OPN蛋白的表达。结论:OPN反义RNA能抑制肾小管上皮细胞OPNmRNA的翻译而抑制OPN蛋白的表达,但不抑制OPNmRNA的转录。