长白山白眉蝮蛇类凝血酶基因特异片段的制备与分挝

目的分离和纯化长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段,为克隆全长类凝血酶cDNA奠定基础.方法应用RT-PCR方法获得长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段,克隆于pGEM-T载体上,进行测序和NCBI数据库同源性分析.结果获得长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段长度为289bp,该片段与其他种蝮蛇类凝血酶DNA片段有同源性.结论本实验克隆了长白山白眉蝮蛇类凝血酶基因片段.根据不同种属蛋白质家族成员的保守性和同源性设计引物可以有效地克隆家族成员的DNA片段.     

长白山白眉蝮蛇类凝血酶基因特异片段的制备与分析

目的：分离和纯化长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段，为克隆全长类凝血酶cDNA奠定基础。方法：应用RT-PCR方法获得长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段，克隆于pGEM-T载体上，进行测序和NCBI数据库同源性分析。结果：获得长白山白眉蝮蛇类凝血酶cDNA片段长度为289bp，该片段与其他种蝮蛇类凝血酶DNA片段有同源性。结论：本实验克隆了长白山白眉蝮蛇类凝血酶基因片段，根据不同种属蛋白质家族成员的保守性和同源性设计引物可以有效地克隆家族成同的DNA片段。     

缓症链球菌致热性外毒素蛋白的生化性质

目的研究缓症链球菌外毒素蛋白的分子量、等电点、氨基酸组成及N-末端序列。方法将纯化的毒素蛋白用SDS-PAGE电泳,据低分子量标准蛋白质算出其相对分子质量;以微型聚丙烯酰胺等电聚焦(miniIEF)法进行此毒素蛋白的等点电测定;采用电印迹将SDS-PAGE电泳胶上的毒素蛋白转移到PVDF膜上,用Beckman344HPLC仪测定外毒素蛋白的氨基酸组成;用自动化蛋白质序列仪测定缓症链球菌外毒素N-末端氨基酸序列。结果缓症链球菌外毒素蛋白的相对分子质量为34000;测定毒素蛋白的等点电为6.2,是一种偏酸性蛋白;外毒素蛋白由17种氨基酸组成,其中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、门冬氨酸、赖氨酸、缬氨酸等氨基酸含量较高;缓症链球菌外毒素蛋白N-末端氨基酸序列为VSNLSRGMGA,本毒素N-末端氨基酸序列与β溶血链球菌外毒素蛋白(SPEA、SPEB、SEPC)N-     

蛇毒酶研究概况

蛇毒中的蛋白类物质是蛇毒主要毒性成分 ,包括蛇毒素和酶两大类。蛇毒中的酶约占蛇毒蛋白组分 50 % ,目前已分离纯化的酶约 4 0多种。有些酶已应用于临床。例如 ,我国学者从长白山白眉蝮蛇毒分离纯化神经生长因子 ( NGF) ,根据血管栓塞性疾病或老年痴呆等疾病的病情 ,配合从蛇毒纯化的类凝血酶 ,以改善中枢神经功能的损伤 ,减少后遗症 [1] 。在科研工作中 ,蛇毒酶更是不可缺少的工具。例如 [2 ] ,核酸结构分析需要蛇毒磷酸二酯酶 ;蛋白质和多肽的一级结构研究需要蛇毒中不同的蛋白酶、肽酶 ;蛇毒中的磷酯酶 A2 ( PLA2 )又常常用于神经生…     

白眉蝮蛇蛇毒糖基化蛋白的质谱分析

[目的]蛋白质组学方法分析和初步鉴定旅顺产白眉蝮蛇（Gloydius blomhoffi Brevicaudus）蛇毒中的糖蛋白。[方法]SDS-PAGE用于白眉蝮蛇粗毒蛋白质组份分离,糖蛋白凝胶荧光染料Pro-Q-Emerald染糖基化蛋白,采用胰蛋白酶酶解蛋白质,用反相C18-HPLC分离肽段混合物,用纳升电喷雾电离串联质谱（nESI-MS/MS）系统进行的质谱数据采集,蛋白质鉴定用Biowroks软件搜索NCBInr数据库完成。[结果]旅顺产白眉蝮蛇蛇毒L-氨基酸氧化酶、金属蛋白酶、谷氨酰环化酶、salmobin、纤溶酶原激活物、contortrixobin、磷脂酶A2,神经增长因子和较小分子量的L-氨基酸氧化酶被初步鉴定为糖蛋白,其匹配的肽段数分别为8、4、7、2、3、3、4、2和5个。L-氨基酸氧化酶的纯化与表征结果验证了其糖基化,并以多种糖基化形式存在。[结论]采用蛋白质组学手段从旅顺产白眉蝮蛇蛇毒中鉴定出了8种糖蛋白,该方法简便、快速、准确。     

江西蝮蛇蛇毒类凝血酶分离纯化及理化、酶学性质的鉴定

本文采用DEAE—纤维素DE—52离子交换层析及SephadexG—150凝胶过滤法,从江西蝮蛇蛇毒中分离、纯化类凝血酶。该酶为糖蛋白,分子量39,200,pI为4.96,酸性氨基酸含量较高。类凝血酶水解苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)的最适pH为8.0,km为3.57×10~(-4)M,其活性可被二异丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)可迅速抑制该酶的酯酶活性。该酶能直接作用于纤维蛋白原使之转变为纤维蛋白引起凝聚,但其凝固速度较牛凝血酶慢。     

从小牛胸腺分离纯化末端脱氧核苷酰转移酶

采用离子交换层析和Oligo(dT)-纤维素亲和层析相结合的方法,从小牛胸腺分离纯化末端脱氧核苷酰转移酶(TdT),500g胸腺TdT的比活性为1076～2030u/mg蛋白,总活性为4400～7296u,聚丙烯酰胺凝胶电泳一条带,SDS-凝胶电泳测其分子量得到7900和23700道尔顿的两个亚基,不含DNA聚合酶。     

长白山白眉蝮蛇毒磷脂酶A2的提纯

应用ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－５０离子交换层析法，从长白山白眉蝮蛇毒中分离出２个具有磷旨酶Ａ２（ＰｈｏｓｐｈｌｉｐａｓｅＡ２，ＰＬＡ２）活性的蛋白质组分。其中之一再经ＤＥＡＥ－ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＡ－５２离子交换层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶过滤进一步纯化，经两种不同类型的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定均为单一条带，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶过滤呈单一对称的峰形。     

江西蝮蛇毒纤溶酶的纯化和性质的研究

江西蝮蛇毒经Sephadex G_(50)分离,试验洗脱液对BAEE的作用检出其中的精氨酸酯酶活性。纤溶酶通过两次DEAE-纤维素离子交换层析得以分离和纯化。聚丙烯酰胺凝胶电泳指出它是均一的。该酶的分子量已由SDS—凝胶电泳所测定约为40,000,等电点在4.0左右。     

人肌肉型醛缩酶的纯化和抗血清制备

以硫酸铵分级和磷酸纤维素亲和层折法分离和纯化了人肌醛缩酶。经醋酸纤维素膜电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定均为一条带。用Swensson法测得酶比活力为48U/mg,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶的亚单位为一条带,亚基分子量约为40,000。纯化的酶免疫鸡产生     

蝮蛇毒磷酸二酯酶抗原的制备及性质

为研究蛇类毒腺细胞分化过程中磷酸二酯酶的作用,需制备特异性和敏感性较高的该酶单克隆抗体用于免疫组化研究.本文所介绍为浙江蝮蛇蛇毒中磷酸二酯酶抗原的提取纯化过程,为制备单克隆抗体提供条件.作者采用离子交换技术和分子筛过滤法相结合的方法提取抗原,具有步骤少、分离效率高的特点.所得抗原经聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳呈单一条带,测定分子量为20900.     

五步蛇蛇毒类凝血酶的分离和纯化

用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析，从五步蛇粗毒中分离纯化出一种促凝组分（类凝血酶），并对其纯度和促凝活性作鉴定。     

Purification and characterization of anti-clotting protein component （ACPF-7221） from venom of Agkistrodon acutus

Background Snake venom contains a number of components with different pharmacological and biological activities, especially in cancer therapy, and has increasingly become a research focus. This study was designed to isolate and purify a novel anti-clotting protein component from the venom of Agkistrodon acutus, and to explore its physico-chemical properties and biological activity. Methods The venom of Agkistrodon was isolated and purified by ion-exchange chromatography on diethylaminoethyl （DEAE）-Sepharose Fast Flow, molecular sieve filtration through Sephadex G75, SP-Sepharose Fast Flow and molecular sieve filtration through Sephadex G50. We detected the activated partial thromboplastin time （APTT） of the eluant to select the anti-clotting protein component of interest. The molecular weight was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrphoresis （SDS-PAGE） and liquid chromatography. Its protein content was detected by bicinchoninic acid （BCA）. Results SDS-PAGE vertical gel electrophoresis showed that the anticoagulant factor is a tripolymer composed of three proteins whose molecular weights are 25 KDa, 30 KDa and 50 KDa. The factor contains about 65% percent protein. Conclusions A novel anti-clotting protein component was purified by ion-exchange chromatography and molecular sieve filtration from the venom of Agkistrodon acutus and was found to be composed of three kinds of proteins.     

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的：从蝮亚科尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)并对其理化性质进行研究。方法：应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFLE，用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定其相对分子质量，用皮内出血实验测定其出血活性。结果：从短亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶，它的相对分子质量为25000，没有出血活性，在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白，相对活性为粗毒的3．2倍。结论：从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为25000的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性，而无出血活性的单一的纤维蛋白溶解酶。     

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶酶的分离纯化及氨基酸序列测定

目的:从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出高纯度的纤溶酶并对其进行初步性质研究和氨基酸序列分析。方法:采用DEAE-Sepharose FF离子交换和两次Superdex75PG凝胶过滤,从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出可直接溶解纤维蛋白原的蛋白酶。结果:分离到的纤溶酶相对分子质量为25kD,HPLC分析纯度在97%以上,氨基酸序列分析其N末端为MSTEF QRYME IVVNHS MVKKY NGDSD KIKAW。结论:采用此工艺可从尖吻蛇毒中分离出高比活的纤溶酶,为进一步研究其药理作用奠定了基础。     

Purification of rat liver microsomal glutathione transferase

Summary The rat liver microsomal glutathione transferase was activated by N-ethylmaleimide, solubilized by Triton X-100 and purified by chromatography on hydroxyapatite and CM Sephadex C-50. A 28-fold purification resulted in a 38 % yield. The purified protein moved as a band with an apparent molecular weight of 14000 on sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis and appeared to be nearly homogeneous. The N-terminal amino acid of the purified enzyme was alanine, identified by the dansyl method. Optimum pH and temperature were 6.8 and 30°C, respectively.     

尖吻蝮蛇毒引起类DIC病因的研究

本文借助 DEAE-sephadex A-50和 Sephadex G-75柱层析从尖吻蝮蛇毒(AAV)内分离并纯化出一种类凝血酶(TLE).这种 TLE 以1.5U/Kg 体重注入麻醉狗的静脉后,观察到血凝筛选试验 Fgn、BPC、PT、TT 和血清 FDP 全部异常;但凝血因子Ⅱ(Quick 二期法)、AT-Ⅲ以及纤维结合蚤白(Fn)含量仍在正常范围内.这提示实验狗血循环内未有凝血酶形成的证据,从而说明 AAV-TLE是 AAV 中毒患者并发类 DIC 综合征的主要病因.     

长白白眉蝮蛇类凝血酶的研究Ⅰ：纯化方法的研究

采用四种纯化方法,对长白白眉蝮蛇类凝血酶的纯化途径进行研究。结果,阴阳离子交换柱、分子筛柱层析法周期较长,收率较低。羟基磷灰石柱法。对类凝血酶有较好的分离效果,但要求样品量小且纯度较高。亲和层析法分离类凝血酶,具有操作简便、纯化周期短、回收率高、处理样品量大等特点。     

江浙蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化及性质研究

目的:江浙蝮蛇毒纤溶酶的分离纯化及部分生物化学和药理性质的研究.方法:应用DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱和HiPrep Sephacryl S 100柱分离纯化纤溶酶,以高效液相色谱仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度、相对分子质量,应用等电聚焦电泳测定等电点,然后测定氨基酸组分及部分药理性质.结果:分离得到相对分子质量为59 100,等电点为4.98, SDS-PAGE为一条带,高效液相色谱分析为单一峰的纤溶酶.该组分属于金属蛋白酶类.氨基酸组成分析表明它含较多的酸性氨基酸.高浓度的纤溶酶对肿瘤细胞CEN2有抑制作用,有微弱的出血毒性.结论:分离纯化得到了一种有微弱出血毒,具有较强抗凝活性的单一组分的酸性金属蛋白酶.