幽门螺杆菌外膜36kDa蛋白重组表达、纯化及初步鉴定

[目的]构建幽门螺杆菌（H．pylori）NCTC11637菌株36kDa（OMP36）外膜蛋白基因原核表达系统，探索研制H．pylorl疫苗的新途径。[方法]培养和收集H．pylori NCTC11637菌株，提取基因组DNA，PCR扩增目的基因片断。将其克隆到T载体并测序，再将目的基因克隆入PET32a（＋），构建重组表达载体PET32a—OMP36。转化E．coli BL21后舢诱导表达，经SDS-PAGE鉴定、镍亲和层析纯化、Western blot检测表达蛋白。[结果]测序分析表明。插入的基因片断为987bp，表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为36kDa。并显示具有良好的抗原性。SDS—PAGE检测表明，表达量占细菌总蛋白的37％。镍亲和层析纯化率约92％。Western blot检测表达蛋白具有良好的抗原活性。[结论]成功克隆了外膜蛋白OMP36kDa的编码基因，其表达产物0MP36有望成为新的Hp疫苗候选分子，为H．pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据GiUiam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物。用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1320bp的DNA，克隆至原核载体PET28a，构建了表达载体PET-OTG，并获表达。表达产物经镍(Ni2 )柱亲和层析纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western—blot)分析鉴定。并用间接ELISA进行抗原性分析。结果SDS—PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达，在相对分子质量约52kDa处有表达目的条带。经 Ni^2 层析柱纯化得到目的蛋白，包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白，达电泳纯。Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别，用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性，能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性。有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。     

幽门螺杆菌塑性区hp4565基因的克隆表达 及其功能初探

摘要:目的　为克隆表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）临床株的塑性区hp4565基因,并制备抗体,以探讨其生物学功能。方法　以标准株NCTC shfi470的hp4565基因组全长设计引物,以H.pylori临床株为模板,PCR扩增临床株中hp4565基因,经原核表达后,选定最适条件大量诱导表达并经Ni2+-NTA柱纯化的目的蛋白。用MTT法检测重组蛋白对胃上皮细胞GES-1增殖影响,定磷法检测重组蛋白ATP酶活力。用纯化蛋白为抗原免疫家兔后制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果　成功克隆表达了hp4565基因,全长942 bp,编码313个氨基酸,原核表达后SDS-PAGE电泳显示有41 kDa的融合蛋白,Western blot鉴定是预期HP4565蛋白。纯化后获得较高纯度的重组蛋白,MTT法结果显示HP4565蛋白在低浓度（≤40 mg/L）时对细胞增殖无明显影响;蛋白浓度在60 mg/L以上时,细胞增殖随着培养时间的延长和浓度的增加呈现逐渐降低的趋势;重组蛋白具有一定的ATP酶活力,免疫家兔制备的多克隆抗体效价为1∶1.6×105。结论　成功克隆表达了H.pylori临床株塑性区hp4565基因,得到纯度较高的蛋白和滴度较高的抗体,重组蛋白对胃上皮细胞增殖有一定影响,并具有一定的ATP酶活力。     

幽门螺杆菌omp22基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及活性鉴定

[目的]优化幽门螺杆菌omp22基因工程菌(pMAL-c2X-omp22-TB1)的表达条件,并对目的蛋白进行纯化和免疫活性鉴定. [方法]在不同诱导时机、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间下诱导pMAL-c2X-omp22-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,采用SDS-PAGE方法对表达产物分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性OMP22蛋白进行分离、纯化,对纯化蛋白做Westem blot分析. [结果]工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.3mmol/L)诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的25%以上;经纯化得到了较高纯度(>90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性. [结论]建立了从TB1(pMAL-c2X-omp22)可溶性表达产物中纯化较高纯度OMP22融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌高效表达生产工艺的研究打下了基础.     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

幽门螺杆菌ureI和lpp20乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定

目的 以幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI和外膜脂蛋白lpp20为目的 基因.分别构建乳酸乳球菌表达重组载体pNZS112/ureI和pNZ8112/lpp20,为H.pylori乳酸乳球菌活菌口服疫苗的研制奠定实验基础. 方法 根据幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI和脂蛋白Lpp20的全基因序列,利用PRIMER5.0各设计一对引物,进行PCR扩增,获得ureI和lpp20目的 基因片段,将其与分泌表达载体pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体,并进行重组疫苗菌稳定性检测. 结果以H.pylori标准株基因组DNA为模板分别扩增出特异的ureI和lpp20基因片段,大小分别为588 bp和528 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20. 结论 PCR扩增得到了大小约为588 bp和528 bp的H.pylori ureI和lpp20目的 基因片段;并成功构建了幽门螺杆菌ureI及lpp20基因乳酸乳球菌表达重组载体.     

PTD-Lmp-3融合蛋白的纯化、表达和鉴定

目的构建融合蛋白PTD-Lmp-3的表达质粒,并进行诱导表达、纯化及鉴定。方法利用基因重组技术构建pET43.1a-PTD-Lmp-3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达融合蛋白,经Ni2＋-NTA层析纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白。结果成功构建了表达质粒pET43.1a-PTD-Lmp-3,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,经IPTG诱导表达的总菌体蛋白在融合蛋白的相应位置PTD-LMP-3约为22 kD,可溶性分析发现融合蛋白主要以上清形式存在,纯化后得到了目的蛋白。Western blot鉴定显示表达蛋白具有抗原性。结论成功构建了PTD-Lmp-3的重组表达载体,使融合蛋白在大肠埃希菌BL21（DE3）中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白,为进一步研究奠定了基础。     

日本血吸虫乳酸脱氢酶原核表达、纯化及鉴定

目的原核表达日本血吸虫乳酸脱氢酶（SjLDH）,对表达产物进行纯化及生物活性鉴定。方法将SjLDH编码序列克隆入pET-28a原核表达载体并转染大肠埃希菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后亲和层析法对表达产物进行纯化,并用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白印迹（Western blot）、酶联免疫吸附实验（ELISA）、酶活性染色及活性测定进行鉴定。结果成功构建pET28a-SjLDH重组质粒并在大肠埃希菌中获得可溶性表达,亲和层析纯化表达产物。SDS-PAGE及Western Blot结果显示,表达及纯化产物分子量约36kDa,与SjLDH理论分子量相符。ELISA结果表明,重组蛋白具有良好的免疫活性,酶活性染色表明重组蛋白具有乳酸脱氢酶活性,活性单位为379U/mg。结论成功进行SjLDH的原核表达并获得纯化的重组蛋白,重组蛋白具有良好的免疫原性及酶活性,为研究SjLDH的功能奠定了基础。     

布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定

[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序，并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序，目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接。构建重组质粒PGEX-4T-1／bp26，在大肠杆菌中表达该蛋白。用western—blot鉴定重组表达的GST—bp26蛋白。[结果]成功构建了PGEX-4T-1／bp26原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因，布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达，它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。