幽门螺杆菌外膜36kDa蛋白重组表达、纯化及初步鉴定

[目的]构建幽门螺杆菌（H．pylori）NCTC11637菌株36kDa（OMP36）外膜蛋白基因原核表达系统，探索研制H．pylorl疫苗的新途径。[方法]培养和收集H．pylori NCTC11637菌株，提取基因组DNA，PCR扩增目的基因片断。将其克隆到T载体并测序，再将目的基因克隆入PET32a（＋），构建重组表达载体PET32a—OMP36。转化E．coli BL21后舢诱导表达，经SDS-PAGE鉴定、镍亲和层析纯化、Western blot检测表达蛋白。[结果]测序分析表明。插入的基因片断为987bp，表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为36kDa。并显示具有良好的抗原性。SDS—PAGE检测表明，表达量占细菌总蛋白的37％。镍亲和层析纯化率约92％。Western blot检测表达蛋白具有良好的抗原活性。[结论]成功克隆了外膜蛋白OMP36kDa的编码基因，其表达产物0MP36有望成为新的Hp疫苗候选分子，为H．pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

幽门螺杆菌omp22基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及活性鉴定

[目的]优化幽门螺杆菌omp22基因工程菌(pMAL-c2X-omp22-TB1)的表达条件,并对目的蛋白进行纯化和免疫活性鉴定. [方法]在不同诱导时机、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间下诱导pMAL-c2X-omp22-TB1的表达,测定目的蛋白的表达量.在优化条件下诱导工程菌表达,采用SDS-PAGE方法对表达产物分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性OMP22蛋白进行分离、纯化,对纯化蛋白做Westem blot分析. [结果]工程菌培养2 h时加入IPTG(终浓度为0.3mmol/L)诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的25%以上;经纯化得到了较高纯度(>90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫原性. [结论]建立了从TB1(pMAL-c2X-omp22)可溶性表达产物中纯化较高纯度OMP22融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌高效表达生产工艺的研究打下了基础.     

梅毒苍白密螺旋体多表位抗原基因的构建、表达及免疫反应性的鉴定

目的为梅毒检测试剂提供特异性强、灵敏度高的新型多表位重组抗原。方法PCR扩增Tp17和Tp0453基因的优势抗原表位,连接后插入pQE32质粒中构建多表位嵌合重组体pQE32/Tp0453-17,IPTG诱导表达,免疫印迹法检测表达产物的免疫反应性。结果成功构建了多表位嵌合重组质粒pQE32/Tp0453-17,经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Tp0453和Tp17基因,片段长约1180 bp,其测序结果与GenBank上登录序列完全一致;SDS-PAGE分析表达产物发现,融合基因表达的重组蛋白Mr约为52×103,表达产物占全菌总蛋白的19.3%,并且在细胞内主要以包涵体形式存在;用Western印迹法检测显示,该重组蛋白能与梅毒患者的阳性血清反应,具有良好的抗原性。结论成功表达了具有良好免疫反应性的多表位嵌合重组抗原,为新型梅毒快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的实验基础。     

布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定

[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序，并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序，目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接。构建重组质粒PGEX-4T-1／bp26，在大肠杆菌中表达该蛋白。用western—blot鉴定重组表达的GST—bp26蛋白。[结果]成功构建了PGEX-4T-1／bp26原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因，布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达，它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。     

人源S100A1蛋白的表达纯化与鉴定

目的 构建pBV220-S100A1表达栽体,表达并纯化人源S100A1蛋白,为进一步研究人源S100A1蛋白相关的生物学功能及应用于临床诊断奠定基础.方法 采用全基因合成法合成人源S100A1基因;通过GeneBank查询人源S100A1蛋白的氨基酸序列,进行序列优化设计,同时引入Ecor Ⅰ 和BamH Ⅰ 酶切位...     

幽门螺杆菌flaB基因克隆及序列分析

目的：将幽门螺杆菌（Helicobacter，pylort，Hp）鞭毛蛋白B亚单位基因（月2B）克隆到质粒载体pNEB193上，并进行序列分析，为Hp疫苗的构建奠定基础。方法：用PCR方法扩增Hp月2B基因，并将其定向克隆入质粒pNEB193上，然后进行序列分析。结果：PCR扩增获得长度为1545bp的月2B基因片段，并成功克隆入pNEB193，序列分析结果显示扩增的月2B基因序列与Genebank公布的月2B基因序列基本一致。结论：本研究获得了月2B阳性克隆子，为Hp重组疫苗的研究奠定了基础。     

MAGE-A4重组蛋白的原核表达与纯化

目的 构建MAGE-A4的原核表达质粒并表达纯化相应蛋白,为恶性肿瘤的早期诊断和基因治疗疫苗的研制奠定基础.方法 根据目的基因序列合成目的基因并与原核表达载体连接,以构建原核表达质粒pET30a(+)/MAGE-A4,将酶切鉴定及测序正确的重组质粒转入E.coli BL21,经IPTG诱导表达并行可溶性分析,Western Blot鉴定重组蛋白特异性后,通过亲和层析法纯化重组蛋白.结果 成功构建pET30a (+)/MAGE-A4原核表达质粒,诱导表达得到重组蛋白MAGE-A4,主要以可溶性形式表达,纯化后获得纯度较高的蛋白.结论 成功构建pET30a(+)/MAGE-A4原核表达质粒并表达纯化出具有生物学活性的重组蛋白MAGE-A4.     

Barrett食管与幽门螺杆菌感染关系的研究

目的探讨Barrett食管(BE)与幽门螺杆菌(Hp)感染的关系.方法经胃镜及组织学检查,选取BE患者32例作为研究组,单纯反流性食管炎(RE)及正常人各30例作为对照组,比较组间Hp 感染情况及前两组Hp感染与炎症分级间的关系.结果在食管部位,Hp阳性率研究组明显高于两对照组(P<0.01);在胃窦部,Hp阳性率无组间差异(P>0.05).在BE组,Hp阳性率中、重度炎症均高于轻度炎症(P<0.05).在RE组,Hp阳性率在轻、中、重度炎症间无差异(P>0.05).结论 Hp感染是引起BE的重要原因之一并可能与其炎症轻重相关,而且Hp可能并不依赖于食管反流而引起BE.     

结核分支杆菌MPT83蛋白基因在大肠杆菌表达载体中的克隆、表达与鉴定

[目的]从分支杆菌培养物中提取DNA,扩增结核分支杆菌MPT83蛋白基因,并在大肠杆菌中进行表达、克隆和鉴定. [方法]从分支杆菌培养物中提取总DNA,扩增MPT83因并克隆入T载体,将目的基因插入表达载体pET-32a( )中,转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamHⅠ HindⅢ双酶切进行鉴定. [结果]经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,5 h后表达量即达到高峰;Western blotting分析表明,融合蛋白能够被分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带.表明MPT83基因原核表达载体构建成功. [结论]结核分支杆菌MPT83蛋白基因在大肠杆菌表达载体中的克隆、表达与鉴定,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础.     

食物及营养素摄入水平与幽门螺旋杆菌感染风险分析

目的探讨各类食物及营养素摄入水平与幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染风险的关系,为Hp感染的膳食预防提供理论指导。方法采用1:1匹配病例对照研究的方法,随机选择山东滨州地区某医院Hp感染者441例和正常对照人群441名,利用食物频率表收集其过去6月内的食物摄入种类及平均每次的食物消费水平,并将其折算成21种营养素的日均摄入量。根据肉及水产品类、蔬菜水果类、奶类、蛋类及各类营养素摄入量的不同,采用四分位数法对其进行分组。采用条件Logistic回归法分析各类食物和营养素的摄入水平与Hp感染的关系。结果 Hp感染者肉及水产品类、蛋类、奶类和蔬菜水果类的摄入量均显著低于对照组;经多因素条件logistic回归分析,与最低摄入量组比较,肉及水产品类(≥45.35 g/d)和奶类(≥21.53 g/d)的摄入均与Hp感染呈负相关(均P <0.05),蔬菜水果类的摄入量超过509.45g/d时,与Hp感染呈负相关(OR=0.69,95%CI:0.52-0.93,P=0.015);当蛋类的摄入量控制在50.00⁶8.98 g/d时,可能为Hp感...     

淋球菌临床分离株PI基因序列的测定与分析

目的：分析比较4株临床分离的淋球菌和2株标准菌株外膜蛋白IP基因及蛋白质序列，初步探索我国淋球菌的变异情况，为淋球菌多态性研究、IP基因的表达和疫苗研制提供依据。方法：构建pBS-T-IP克隆重组子并进行测序，用hlastn和CLUSTAL W分析基因和蛋白质序列的相似性，并与已发表的序列进行比较，预测并分析所得IP基因的loop(表面暴露区域)结构。结果：在GenBank中搜索到相似性大于98％的序列，6条序列分别属于PIA和PIB两个亚型，其中IP4的序列与GenBank中的相应序列有18个位点的差异，可能为我国特有的流行株。位于7个loop结构中的变异位点占3条PIA蛋白间总变异的67％，占3条FIB蛋白间总变异的84％，变异程度较高。结论：成功克隆了临床分离的淋球菌株和标准菌株的IP基因并进行序列分析，为深入研究我国流行的淋球菌菌株的多态性、IP基因的表达和疫苗研制奠定了基础。