重组人白细胞介素—2／粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的：研究重组人白细胞介素-2/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法：常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得副合蛋。结果：获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论：此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

孕妇血中GM-CSF、IL-2和IL-6的含量及临床意义

目的探讨GM-CSF、IL-2和IL-6在孕妇血中含量及其临床意义.方法采用ELISA法检测健康妇女和孕妇血中GM-CSF、IL-2和IL-6含量.结果孕妇血中3种因子含量高于健康妇女(P<0.01).结论孕妇血中GM-CSF、IL-2和IL-6含量显著增加,是母体维持胚胎正常发育所必须的细胞因子.     

SA/hIL-15融合蛋白的制备及生物学活性鉴定

目的 制备链亲和素(SA)/人白细胞介素-15 (hIL-15)融合蛋白SA-hIL15和hIL-15-SA,并鉴定其生物学活性.方法 构建原核表达质粒pET24a-6His-SA-hIL-15和pET32a-hIL-15-SA-6His,转化大肠杆菌BL21(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性.CCK-8检测融合蛋白PHA刺激的人外周血淋巴细胞增殖的活性,流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的B16.F10细胞锚定修饰率.结果 成功构建了两种重组融合蛋白的表达质粒并在大肠杆菌实现了高效表达,目标蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%.经纯化、复性的SA/hIL-15融合蛋白具有双重活性,即:能促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的hIL-15活性,和SA介导的高效结合至表面已生物素化的B16.F10肿瘤细胞的功能(表面锚定修饰效率大于95%).SA-hIL-15双功能融合蛋白促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖活性高于hIL-15-SA双功能融合蛋白.结论 SA/hIL-15双功能融合蛋白的制备为hIL-15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制打下了基础.     

大鼠骨髓造血干细胞体外定向诱导、扩增树突状细胞及其功能鉴定

目的：以大鼠骨髓造血干细胞为来源，建立体外诱导、扩增树突状细胞(dendritic cells，DC)的方法，并进行表型鉴定及功能检测。方法：从大鼠骨髓细胞中分离出造血干细胞，加入rGM-CSF、rIL-4和nrhTNF-α培养12天获得大量DC，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁珠分离纯化后的DC，进行形态学观察、表型检测及刺激T细胞增殖能力分析。结果：大鼠骨髓造血干细胞经诱导培养12天后，倒置显微镜和电镜下显示典型的DC形态和超微结构；流式细胞术分析显示细胞表面抗原高表达，其中OX62为62．19％；MHCⅠ为70．40％；MHCⅡ为78．28％；CDSO为55．58％；CD86为68．38％，是典型的大鼠DC表型特征，同种混合淋巴细胞反应结果显示，DC具有高效的刺激T淋巴细胞活化增殖的能力。结论：大鼠骨髓造血干细胞可成功诱导为具有典型形态特征及功能的DC，为进一步研究其在肿瘤免疫治疗中的应用打下基础。     

链霉亲和素-人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的制备与活性鉴定

目的:制备链霉亲和素(SA)连接的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)融合蛋白(SA-hGM-CSF),并对其生物学活性进行鉴定。方法:在NCBI数据库中查找SA和hGM-CSF序列,将序列合成后连接入Pet28表达载体中,构建SA-hGM-CSF-Pet28重组表达载体,在BL21(DE3)表达感受态中利用IPTG诱导剂诱导表达,经His镍柱纯化,尿素梯度复性,聚丙烯酰胺凝胶电泳法和蛋白质印迹法(WB)鉴定融合蛋白,通过TF-1细胞检测融合蛋白的生物学活性。结果:SA-hGM-CSF融合蛋白可在BL21(DE3)中高效诱导表达,经His镍柱纯化后该融合蛋白纯度较高。经尿素梯度复性后,细胞学实验验证该融合蛋白具有生物学活性。结论:成功表达具有生物活性的融合蛋白SA-hGM-CSF,该结果为SA-hGM-CSF表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研究提供了实验基础。     

重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白的纯化及复性研究

目的研究重组人白细胞介素-2/ 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(IL-2/GM-CSF)融合蛋白纯化及复性的最佳条件。方法常规方法提取包涵体,用本室专利技术提纯,复性后样品经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,获得融合蛋白。结果获得具有生物活性的融合蛋白,其纯度达到95%。结论此工艺操作简便,纯化效果好,获得率高。     

IL-2-PE66~(4Glu)融合蛋白生物学活性测定

ＩＬ－２－ＰＥ６６４Ｇｌｕ是由白介素２同改构的绿脓杆菌外毒素通过基因融合构成的嵌合蛋白。我们研究了它对ＣｏｎＡ诱导的小鼠脾母细胞和ＰＨＡ激活的人外周血淋巴细胞的细胞毒活性，结果显示其半数抑制剂量（ＬＤ５０）分别是５０ｎｇ／ｍｌ和２０ｎｇ／ｍｌ，而对ＩＬ－２Ｒ细胞则无明显的作用；同时，探讨了ＩＬ－２的浓度、ＭＴＴ浓度及作用时间对实验结果的影响     

孕妇血中GM—CSF，IL—2和IL—6的含量及临床意义

目的：探讨GM－CSF，IL－2和IL－6在孕妇血中含量及其临床意义。方法：采用ELISA法检测健康妇女和孕妇血中GM－CSF，IL－2和IL－6含量。结果：孕妇血中3种因子含量高于健康妇女（P＜0．01）。结论：孕妇血中GM－CSF，IL－2和IL－6含量显著增加，是母体维持胚胎正常发育所必须的细胞因子。     

反义bcl-2的表达诱导癌细胞凋亡致敏树突状细胞的免疫应答

目的 观察树突状细胞（DCs)对反义bcl-2的逆转录病毒表达载体诱导的凋亡胆管癌细胞获取抗原后，抗肿瘤免疫应答及对胆管癌细胞的特异性免疫杀伤效果。方法 用粒－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）加白介素－4（IL－4）从人外周血分化，诱导DCs，反义bcl-2的逆转录病毒表达载体在体外诱导培养的人胆管癌细胞凋亡，将DCs，T淋巴细胞和凋亡胆管癌细胞区培养，同时设计不同类型肿瘤细胞（坏死胆管癌细胞及培养胆管癌细胞）作对照，7d后，分离，富集DCs，T淋巴细胞进行免疫应答及肿瘤细胞杀伤试验。结果 DCs高表达共刺激分子B7和CD1a，表面具有典型不规则突起，反义bcl-2表达诱导癌细胞凋亡形成的凋亡小体被DCs捕捉，吞噬，负载抗原的DCs可以有效提呈胆管癌细胞抗原，有强烈的免疫应答，刺激的细胞毒T淋巴细胞（CTLs)特异性地杀伤胆管癌细胞。结论 反义bcl-2的逆转录病毒表达载体诱导癌细胞凋亡可以致敏rhGM-CSF加rhIL-4从人外周血单核细胞诱导，扩增出的DCs并产生显著的杀伤胆管癌细胞的免疫反应，可望成为特异性免疫治疗肿瘤的一条新途径。     

小鼠骨髓和脾来源树突状细胞的分离与扩增培养

目的：探索树突状细胞（ＤＣ）及其前体的分离纯化及其体外扩增的方法。方法：无菌制备ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨髓和脾细胞；先后用红细胞裂解液、抗鼠ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ细胞单抗（ＭｃＡｂ）和补体溶液，依次去除红细胞，Ｔ、Ｂ细胞，粒细胞和单核巨噬细胞等混杂细胞而获得纯化的ＤＣ及其前体；又在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭＣＳＦ）和白细胞介素（ＩＬ４）协同诱导下培育，ＤＣ前体分化发育成ＤＣ或郎罕细胞（ＬＣ）并扩增，同时阻抑巨噬细胞发育生长。结果：ＤＣ／ＬＣ细胞数增加，其形态在光镜下多为特征性星形，也有梭形和多角形；扫描电镜下观察其绝大多数为特征性星形，且有１～４级不等的树突状突起，其纯度高达９５％以上。ＤＣ／ＬＣ在功能上明显刺激同种异体混合淋巴细胞反应（ＭＬＲ）。结论：①结果所得细胞的形态和功能符合ＤＣ／ＬＣ；②建立连续排异结合ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ４联合诱生培育的方法，可获得大量高纯度的ＤＣ／ＬＣ。     

小剂量环孢素A治疗溃疡性结肠炎对肠黏膜中NFAT活性及GM-CSF表达的影响

目的:研究小剂量环孢素A(CsA)治疗的溃疡性结肠炎(UC)患者肠黏膜中核转录因子(NFAT)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的变化,及其对黏膜炎症的影响. 方法: UC患者14例经CsA治疗,采用凝胶电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测肠黏膜NFAT治疗前后活性的变化,半定量RT-PCR法检测肠黏膜中GM-CSF mRNA的改变,治疗前后对肠黏膜炎症程度进行评估. 结果: UC患者治疗后肠黏膜NFAT活性下降(0.80±0.31 vs 0.50±0.20, P＜0.05), GM-CSF mRNA表达也有降低(1.09±0.07 vs 0.49±0.03, P＜0.01), 肠黏膜炎症程度也下降(P＜0.05). 结论: 小剂量CsA治疗UC有效,其机制与调控NFAT的转录活性有关,并进一步降低激活因子GM-CSF的表达.     

联合应用hIL-2和hGM-CSF基因瘤苗抗肿瘤作用的研究

目的：探讨联合应用人白细胞介素2（hIL-2)和人粒细胞巨呼细胞刺激因子（hGM-CSF)基因瘤苗抗肿瘤作用。方法：经逆转录病毒载体将hIL-2基因及hGM-CSF基因导入大鼠Walker瘤细胞WRC256中，制备瘤苗接种荷瘤大鼠。结果：经PCR－Southerm Blot检测证实hIL-2基因及hGM-CSF基因已成功导入WRC256细胞基因组中，经生物学活性检测证实转基因细胞具有分泌hIL-2及hGM-CSF活性。转基因瘤苗经60Gy X线灭活，接种荷瘤Walker瘤模型，两种瘤苗确可诱导有效抗肿瘤反应，但与单独应用一种瘤苗相比较，联合应用无相加或协同作用。结论：两种瘤苗可诱导有效抗肿瘤反应，但联合应用无相加或协同作用。     

Th1、Th2细胞因子含量变化在胃癌病人免疫偏移中的意义

①目的探讨不同临床分期胃癌病人外周静脉及脾静脉血中Th1、Th2细胞因子变化与人体细胞免疫功能的关系.②方法应用ELISA方法检测33例胃癌病人、10例良性胃疾病病人(对照组)外周静脉及脾静脉血中Th1细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Th2细胞因子白细胞介素4(IL-4)的含量.③结果胃癌病人外周静脉及脾静脉血中GM-CSF含量低于对照组(t=2.38、2.42,P<0.05),而IL-4含量高于对照组(t=4.11、18.94,P<0.01);胃癌病人脾静脉血中IL-4含量高于外周静脉血(t=30.30,P<0.01).各期胃癌病人中,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期病人外周静脉及脾静脉血中GM-CSF含量均低于Ⅰ期胃癌病人,而IL-4含量则高于Ⅰ期胃癌病人(F=9.29～27.81,q=4.57～30.26,P<0.01).④结论胃癌病人Th1、Th2细胞因子的失衡可能是导致胃癌病人免疫偏移的原因之一.     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子双体融合分子的三级结构模建

目的：验证重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＧＭＣＳＦ） 双体融合分子（Ｇ２）较ＧＭＣＳＦ单体分子具有高活性的结构机制。方法：利用ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ软件，采用同源性模建结合手工拼接的方法模建出Ｇ２ 融合分子的空间三级结构，并将其与ＧＭＣＳＦ单体的结构相比较。结果：模建出的Ｇ２ 融合分子前后两个结构单元在空间位置上相对独立，二者各自的三级构象及二级结构组成均与ＧＭＣＳＦ非常相似。另外，从受体结合位点的分析结果来看，Ｇ２ 分子在结构上有能力同时结合两分子的ＧＭＣＳＦ 受体。结论：Ｇ２ 融合分子中的两个ＧＭＣＳＦ结构单元在结构上基本保持了ＧＭＣＳＦ 单体分子的三级结构，其空间结构允许两分子的ＧＭＣＳＦ受体同时结合，引发受体间的交联，从而产生高活性。     

rHuEPO、rHuGM-CSF对大鼠芥子气全身中毒疗效的初步评价

目的：评价重组人红细胞生成素（rHuEPO），重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（rHuGM－CSF）,对SD大鼠芥子气全身中毒的治疗作用。方法：本实验以SD大鼠为动物模型，4mg/kg体重芥子气皮下注射为中毒剂量。治疗组动物在中毒后0.5h即皮下注射治疗药物，其中rHuEPO的剂量为300IU/kg体重，第1天和第3天各1次；rHuGM－CSF的剂量为15μg/kg体重，连续应用5d。通过观察1周内动物腹泻率，死亡率，体重变化，血常规指标变化，骨髓细胞增生程度和细胞学分类等来评价药物疗效。结果：和中毒对照组相比，药物治疗组的腹泻率，死亡率，动物体重，血常规指标以及骨髓细胞学分类等均无显著差异。但治疗组在中毒后第8天的血常规中红细胞（RBC）和血红蛋白（HGB）已上升到和正常对照组无明显差异，而中毒对照组却仍然显著低于正常对照组。另外，虽然统计学上无显著差异，但骨髓细胞分类显示治疗中单核细胞系比例和红细胞系比例也较中毒对照组有升高趋势。结论：SD大鼠芥子气中毒后，只应用rHuEPO和rHuGM－CSF进行药物治疗，虽然能一定程度上刺激骨髓红细胞系和单核细胞系的生长，但对其他细胞系的刺激作用不明显，而且反而可能由于其副作用使动物的腹泻率和死亡率升高。因此在芥子气全身中毒的综合治疗方案中，rHuEPO和rHuGM－CSF只能起辅助治疗作用。     

重组人粒细胞集落刺激因子在造血系统疾病中的应用

对因急性白血病（ＡＬ）、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤（ＭＭ）联合化疗及其他药物所致中性粒细胞缺乏症１９例患者予以重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）治疗，中性粒细胞绝对数（ＡＮＣ）达显效、有效分别为１３例（６８．４２％），２例（１０．５２％），总有效率７８．９４％；所需中位时间分别为８，１４天。治疗后ＡＮＣ增值１．５７～１１３６０倍，白细胞（ＷＢＣ）、ＡＮＣ达显效、有效时间明显缩短（Ｐ＜０．００５）。随着ＡＮＣ增值，患者感染、使用广谱抗生素及化疗间歇时间均缩短，对患者及时进行化疗、安全渡过化疗后骨髓抑制期，进一步杀灭体内残存肿瘤细胞及缩减整体医疗费用具有重要意义。     

抗PIWIL2蛋白多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备兔抗人PIWIL2(P-element-induced wimpy testis like 2,或称HIWI2)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,初步探讨其在人正常及肿瘤组织中的分布.方法:人工合成特异性PIWIL2多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)为载体构建多肽免疫原,致敏大白兔,制备兔抗人PIWIL2多克隆抗体.亲和层析法纯化抗体,ELISA和Western印迹鉴定特异性,人组织芯片行PIWIL2的免疫组化研究. 结果:通过构建PIWIL2多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,制备出兔抗人PIWIL2蛋白多克隆抗体.ELISA及Western印迹证实兔抗人PIWIL2抗体可特异性识别PIWIL2多肽.人组织芯片免疫组化染色显示,PIWIL2在肿瘤细胞的表达具有组织特异性,大多数正常和癌组织的平滑肌细胞胞质中呈阳性染色. 结论:成功制备出兔抗人PIWIL2多克隆抗体,为后续研究奠定了基础.     

结节病和特发性肺纤维化患者支气管肺泡灌洗液中IL-6和GM-CSF测定分析

目的:研究间质性肺疾病支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素-6(IL-6)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平及临床意义.方法:应用酶联免疫法(ELISA)检测12例结节病(Sar)及14例特发性肺纤维化(IPF)患者和10例健康人BALF及血清中IL-6和GM-CSF的水平,并与BALF的细胞学成分及临床数据进行相关分析.结果:Sar组和IPF组BALF中IL-6和GM-CSF水平均显著高于对照组( P<0.05,P<0.01),而血清中则无显著差别或测不到.IPF组BALF中IL-6与BALF中淋巴细胞百分比呈正相关,Sar与IPF组BALF中的GM-CSF则与BALF中肺泡巨噬细胞(AM)的百分比呈正相关( P<0.05,P<0.01).结论:IL-6与GM-CSF在间质性肺疾病的发病过程中起一定作用.