凝血酶工艺优化和稳定性的研究

目的进行凝血酶工艺优化和稳定性的研究。方法选用Ca2＋和凝血活酶联合激活系统激活、DEAE-Sephadex A-50吸附法等技术提取出粗凝血酶,采用离子交换层析法,从粗凝血酶中纯化得到凝血酶纯品,对两者纯化效果进行比较。结果优化后的工艺比原生产工艺有明显提高。结论优化工艺应把生产凝血酶时温度控制在25℃,pH=7,从猪血浆的吸附到凝血酶半成品,应在4h内完成,这样才能获得较高纯度的凝血酶。     

牛凝血酶的分离纯化

目的:以牛血为原料对凝血酶进行分离纯化.方法:采用DEAE离子交换纤维素柱层析和SephadexG-200分子筛层析从牛血浆中纯化得到牛凝血酶.结果:所得凝血酶制品比活为39.8U/mg蛋白,活性回收率为34.3%,纯化倍数为7.6.结论:与传统方法相比,本实验方法得到的凝血酶保持了较高的活力和回收率,具有方法简便、效果较好的特点.     

癌症患者血浆和组织浸液凝血酶调节蛋白的检测及临床意义

目的 :研究癌症患者血浆和组织浸液凝血酶调节蛋白 (TM)的浓度变化及其意义。方法 :用 ELISA法检测 188例癌症患者血浆 TM和 2 4例癌组织及其邻近正常组织浸液的 TM浓度。结果 :癌症患者血浆 TM水平[(33.4 7± 14 .2 5 ) μg/ L]明显高于对照组 [(2 0 .4 0± 7.2 2 ) μg/ L,P<0 .0 1],癌症转移组 [(4 1.6 8± 16 .96 ) μg/ L]明显高于对照组 (P<0 .0 1) ,术后组患者 TM[(18.4 5± 9.96 ) μg/ L]比术前组 TM[(2 8.2 9± 11.74 ) μg/ L]明显回落 (P<0 .0 1) ,术后复发转移组 TM水平 [(34.5 0± 12 .5 7) μg/ L]明显增加。肺癌、胃癌和胰腺癌三种转移性癌均明显高于各自的非转移性癌 (P<0 .0 5～ 0 .0 1) ,而非转移的胃癌、胰腺癌、食道癌、大肠癌和喉癌与对照组比较均无明显差异(P>0 .0 5 )。癌组织浸液 TM[(6 47.71± 317.5 1) μg/ L]显著低于其邻近正常组织 [(14 5 5 .6 3± 772 .2 2 ) μg/ L,P<0 .0 1],而其血浆 TM则明显高于对照组。结论 :癌症患者血浆 TM水平升高与癌的扩散转移有关 ,其水平可作为判断病情进展和转移的一个敏感指标。     

采用低离子介质制备液体型凝血酶试剂稳定性观察

目的采用自备低离子缓冲液稀释凝血酶,探讨制备稳定的凝血酶时间（TT）测定试剂。方法将国产凝血酶冻干粉用自备低离子缓冲液溶解、稀释并标化。分装后置-20℃保存。观察低离子液体型TT试剂在-20℃冷存的稳定性和解冻后在全自动凝血分析仪工作环境下（15℃）的稳定性。并与进口冻干试剂进行平行试验。结果低离子液体型TT试剂在-20℃能保存6个月以上,解冻后在15℃环境中能稳定8 h。结论用低离子缓冲液和国产凝血酶制备的标准化TT试剂在低温下能长期保存,在全自动凝血分析仪工作环境下的稳定性和重复性符合TT实验要求。     

凝血酶试剂仪器工作环境稳定性分析

目的探讨凝血酶试剂在仪器工作环境中(15℃)的放置时间长短对检测结果的影响.方法将干粉凝血酶试剂溶解后放置于检测仪器试剂位置,放置不同时间后测定病人标本凝血酶时间.结果凝血酶试剂溶解后在15℃环境中放置10小时后对测定结果影响有显著差异(p<0.01).结论凝血酶试剂溶解后在仪器工作环境能稳定8h,若要较长时间保存应冷冻保存(-20℃).     

不同溶剂溶解凝血酶对凝血酶促凝活性的影响

目的比较凝血酶在不同溶剂中的凝血活性。方法用9种不同的溶剂稀释凝血酶并分为两种浓度、一种为低浓度,另一种为高浓度,低浓度凝血酶和高浓度凝血酶分别在CA1500全自动凝血仪上对同一枸橼酸抗凝血浆进行凝血酶时间（thrombin time,TT）和纤维蛋白原（fibrinogen,Fbg）测定。结果 TT和Fbg均提示：凝血酶在水溶液中的促凝活性最强。0.9%NS和5%葡萄糖溶液具有抑制凝血酶凝血活性的作用,且浓度越高抑制作用越强,以5%GNS对凝血酶的凝血活性抑制作用最强。结论凝血酶作为外用止血时,采用日常生活中极为常见的蒸馏水及纯净水稀释,可能会提高其止血效果     

明胶海绵吸附凝血酶对脑水肿影响的实验研究

目的：观察手术应用明胶海绵吸附凝血酶对脑水肿的影响。方法：将大鼠皮层切除明胶海绵吸附凝血酶置入受损处。24h后取脑，干-湿重法测定脑组织的含水量，结果：在同侧基底节，明胶海绵吸附上凝血酶引起明显脑水肿。水蛭素能减轻脑水肿。结论：手术应用明胶海绵吸附凝血酶止血可导致脑水肿形成。     

凝血酶影响血管内皮细胞通透性的实验研究

目的 :评价凝血酶对血管内皮细胞通透性的影响及其机制。方法 :在体外培养血管内皮单细胞层 ,并测定凝血酶引起的血管内皮单细胞层电阻变化。结果 :凝血酶能够迅速降低血管内皮单细胞层的电阻 ;而肌球蛋白轻链激酶抑制剂 ML- 7能够抑制凝血酶引起的血管内皮单细胞层电阻变化。结论 :凝血酶可以升高血管内皮细胞肌球蛋白轻链的磷酸化水平 ,从而导致血管内皮细胞通透性增高。     

直接凝血酶抑制物的测定及其临床意义

目的采用稀释血浆凝血酶时间法（稀释纠正法）检测血浆中特异性凝血酶抑制物，为抗血栓形成治疗提供有效的实验室监测试验。方法延长的凝血酶时间（TT）用正常人混合血浆作1：4稀释后作TT测定。结果稀释纠正法测的直接凝血酶抑制物（direct thrombin inhibitors，DTIs）浓度与TT有良好的相关性（r=0．9569），可测最低DTIs浓度为8．0×10^-3μg／ml，测得凝血酶抑制药物阿加曲班治疗患者DTIs血浆浓度为118．2±20．78×10^-3μg／ml，不明原因轻度出血异常、急性白血病患者也存在不同程度的DTIs。结论稀释纠正法‘丌测定对DTIs有较高的特异性和敏感性，是凝血酶抑制物类药物治疗血栓性疾病有价值的实验室监测指标。     

蕲蛇酶(凝血酶样酶)溶液及注射液的稳定性研究

+本文报道温度及pH对蕲蛇酶(凝血酶样酶)溶液及注射液活性的影响。经50,60,80,100±0.5℃恒温水浴中温孵1h后测定凝血酶活力及pH的变化,以判定蕲蛇酶的稳定性。结果50℃热处理酶活力未变,60℃以上酶活力逐渐降低,80,100℃酶活力减少50％～78％。热处理后对pH影响不大。以1:nol/L HCl或Dnol/L NaOH调整蕲蛇注射液的pH至1～12,分别测定凝血酶活力,共最适pH为6,pH在5～8范围内酶活力较稳定,在此范围以外酶活力均受影响同。当调回到pH6时,除ph1,12外,仍表现出很强的酶活力。     

凝血酶与出血性脑组织损伤的相关性动物实验研究

目的 观察大鼠脑内注入凝血酶或全血后神经细胞凋亡和脑组织水肿的动态改变，并观察凝血酶特异性抑制剂（水蛭素）能否减轻凝血酶对脑组织的损伤。方法 成年168只SD大鼠随机分为5组，即凝血酶组、脑出血组、凝血酶加水蛭素组、脑出血加水蛭素组和生理盐水对照组，分别向大鼠右侧基底节区注入凝血酶、全血、凝血酶加水蛭素、全血加水蛭素和生理盐水，于注射后6、24、72h，7d取脑组织，检测脑组织水含量（干湿重法）、神经细胞的凋亡情况（Tunel法）。结果 与生理盐水对照组比较，凝血酶组和脑出血组的脑组织水含量及凋亡细胞数明显增加。时效学研究显示脑出血组脑组织水肿和神经细胞凋亡开始于术后6h，72h达高峰，7d后下降；凝血酶组开始于术后6h，24h达高峰，72h下降。与生理盐水对照组比较，脑出血组术后6h凋亡细胞数无统计学差异（P〉0、05），凝血酶组注入凝血酶后6h凋亡细胞数有明显增加（P〈0、05）。水蛭素干预后脑出血组和凝血酶组的脑组织水含量和神经细胞凋亡数明显降低（P〈0、05）。结论 大剂量凝血酶诱导的组织水肿和细胞凋亡在24h达高峰，脑出血后组织水肿及细胞凋亡均于72h达高峰可能与脑出血后凝血酶逐渐由血肿释放有关，水蛭素能显著减轻脑组织水肿和神经细胞凋亡。     

凝血酶水溶液稳定剂的初步研究

凝血酶水溶液稳定剂的研究结果表明，室温保存１３ｄ活性下降率为５０．２％，保存２４ｄ完全失活，３７℃保存５ｄ活性下降率为５７．１％，保存１０ｄ完全失活，在凝血酶水溶液中加上稳定剂Ａ和海藻糖，其稳定性大有提高，室温保存３５ｄ活性下降率为３５％，３７℃保存１０ｄ活性下降率为２９．６％，提示：加入稳定剂Ａ和海藻糖可提高凝血酶水溶液在室温和３７℃下的稳定性。     

凝血酶预处理减轻凝血酶所致的脑水肿

目的:探讨凝血酶预处理对脑水肿的影响,检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在脑组织内的表达并分析其与凝血酶所致脑水肿的关系.方法:建立大脑皮质内血肿模型.选择健康成年SD大鼠40只,随机分为作为对照的未预处理组(ST组)和小剂量凝血酶(1 U)预处理组(TT组).观察不同时相脑组织含水量及钠含量的变化及TNF-α在脑组织内的表达.结果:ST组脑组织含水量和钠含量明显高于TT组,且第1天高于第3天.TT组与ST组脑组织内TNF-α阳性表达与含水量的变化相一致.结论:凝血酶预处理可以减轻凝血酶所致的脑水肿;TNF-α的表达与凝血酶所致的脑水肿有关.     

舒糖宁袋泡药茶的工艺优化及急性毒性实验

目的：优化舒糖宁袋泡茶的提取工艺，并考察成药的急性毒性。方法：以出膏率为指标，正交试验法筛选提取溶剂量，溶液pH值和提取液中醇浓度三因素对收率的影响。同时，采用Bliss概率法测定袋泡茶的LD50。结果：根据优化工艺得到的最佳提取条件。溶剂量为药材10倍量，醇浓度为10%和pH调为3.0时撮效率最高，经优化工艺制备的药物的LD50为52.2g/kg，是成人用量的130倍，结论：经提取工艺优化后制得的舒糖宁袋泡茶更为安全可靠。     

凝血酶致大鼠肺微血管通透性及血浆VEGF含量改变的实验研究

目的复制凝血酶诱导大鼠急性肺损伤模型,验证凝血酶的炎症效应,并评估血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在凝血酶炎症效应中的作用.方法 72只SPF级SD大鼠以1%戊巴比妥钠溶液(60 mg/kg)麻醉后随机分为3组,每组24只.正常对照组C组,予生理盐水2 ml/kg尾静脉注射;凝血酶0.5 U/kg(T1组)和1 U/kg(T2组)处理组,于处理后0.5、2、6、12 h 4个时相点采集标本,每时相点6只.检测大鼠肺湿/干比,荧光素钠法检测肺微血管通透性变化,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血清中VEGF浓度,及病理学观察.结果与C组比较,T1、T2组0.5、2 h两个时相点肺湿/干比、肺组织中荧光素钠浓度均显著增高(P＜0.01),血清VEGF浓度检测显著增高(P＜0.01);6 h及12 h两时相点与对照组比较无显著差异.结论凝血酶可引起大鼠肺微血管通透性的可逆性改变,这种炎症效应可能与VEGF释放的变化有关.     

压电石英晶体传感器检测血浆凝血酶时间的实验研究

目的建立一种检测血浆凝血酶时间（TT）的压电石英晶体传感器。方法采用AT切向、基频10MHz的银膜石英晶体作为压电元件;探讨反应体系密度和黏度与晶体振荡频率变化的关系,观察血浆凝集过程中晶体振荡频率的变化规律,确定判断血浆凝集反应起点和终点的方法。结果（1）反应体系加入凝血酶试剂启动凝血反应后,晶体振荡频率呈阶梯状快速下降,接着频率瞬时上升,然后再缓慢降低达到平稳,频率阶梯下降的起点为血浆凝集反应的起始点,频率从快速上升变为下降的转折点为血浆凝集的终点,计算两点之间的时间即为血浆凝血酶时间。（2）该方法的检测结果与STAGO血凝仪磁珠检测法的相关性好（γ=0．964）,批内CV=2．26％,批间CV=7．53％。结论压电石英晶体传感器检测血浆凝血酶时间,血浆凝集反应起点和终点确定方便、可靠。且操作简单、快速、成本低廉,检测结果准确,是一种敏感性高、重复性好的血浆凝血酶时间检测新方法,可用于临床栓测。     

原发性肝癌患者血浆P-选择素、凝血酶调节蛋白测定的临床意义

目的：检测原发性肝癌患血浆可溶性P－选择素（sP-selectin sP-sel)、凝血酶调节蛋白（TM）水平，并探讨其临床意义。方法：采用酶联免疫吸附夹心法（ELISA），检测30例原发性肝癌患术前和术后血浆sP-sel和TM水平，结果：术前患血浆sP-sel和TM含量明显高于对照组（P＜0．01），术前较术后高（P＜0．05）。结论：血浆 sP-sel和TM含量测定对原发性肝癌的辅助诊断有一定的参考价值。     

采用膜分离法从猪血中分离纯化凝血酶的工艺研究

目的 从猪血中分离纯化凝血酶.方法 根据猪血凝血酶原及其凝血酶的分子量,采用膜分离技术分离纯化猪血凝血酶.结果 采用膜分离技术分离纯化猪血凝血酶,其比活力与活力回收率分别比有机溶剂沉淀法提高了78.5U/pro.mg(6.0倍)和37.1%.结论 膜分离法是分离纯化猪血凝血酶较理想的方法,适宜中、小企业生产.     

凝血酶研究概况

早在19世纪末期,凝血酶就被一苏格兰的生理学家发现并命名,直到1951年凝血酶被纯化出来,并对其进行测序之后,人们对凝血酶的研究和了解才越来越深入。凝血酶的生理功能与其丝氨酸蛋白酶的活性有关,能裂解纤维蛋白原而形成纤维蛋白凝块,从而促进血液凝块的形成。20世纪中期,人们就开始将凝血酶应用于临床,由于其疗效显著,应用也越来越广泛。后来美英日等国从牛血浆中分离出凝血酶应用于临床,并证明将动物凝血酶应用于人体未出现凝血酶抗原性,口服和局部外用时未产生抗体的过敏反应和其他不良反应等,因而目前所使用的凝血酶制剂大多来源于动物血浆,传统的凝血酶分离纯化技术也趋于成熟。