铅硒联合作用对原代培养海马神经元影响

目的观察铅、硒对原代培养的海马神经元生长及存活的影响，研究硒对铅的神经细胞生长抑制的拮抗作用。方法建立新生Wistar大鼠海马神经元原代无血清培养技术，通过PbCl2，Na2SeO3单独及联合作用，观察神经细胞的生长和存活情况。结果10^-5mol／L铅明显抑制了原代培养的海马神经元突起生长，引起神经元存活率下降；单独硒（2×10^-6mol／L）有明显促进海马神经元突起生长的作用．尤其在神经元突起生长早期；但对海马神经元存活率的影响不明显。铅和硒共同孵育时，培养早期硒能拮抗铅对神经元突起延伸的抑制．但随着培养时间延长，这种拮抗作用消失；从神经元存活率来看，在实验剂量下，未见硒能拮抗铅对神经元存活的抑制作用。结论铅具有抑制神经元生长和存活的毒性。本实验剂量下的硒在细胞培养早期有促进神经元突起生长和拈抗铅对神经元生长和存活的抑制作用。     

不同神经发育阶段铅暴露对大鼠海马神经元数目的影响

目的:探讨不同神经发育阶段铅暴露对海马神经元数目的影响。方法:将Wistar大鼠随机分为孕期染铅组、断乳后染铅组和对照组,处理组经水给予PbCl2400μmol/L,对照组自来水。至观察终点采用免疫组化法检测海马CA3区神经元数目。结果:仔鼠出生第1天,孕期染铅组与对照组神经元数目均数分别是315.52±42.12、435.25±25.38,明显低于对照组(P<0.05);至2月龄,孕期染铅组仔鼠神经元均数仍显著低于对照组(P<0.05),而出生断乳后染铅组神经元均数与对照组相比,差别无统计学意义P﹥0.05,其均数分别是45.00±7.83、58.25±7.85和58.74±4.92。结论:孕期铅暴露可导致仔鼠海马神经元数目减少,而出生后铅暴露则对海马组织神经元数目没有明显影响。     

铅对海马神经元单环磷酸腺苷水平的影响

目的　通过放射免疫的方法 ,研究铅暴露对体外培养的海马神经元单环磷酸腺苷 (cyclicadenosinemonophosphatec,cAMP)水平的影响。 方法　在体外培养 3d的原代胚鼠海马神经元中 ,加入不同浓度的氯化铅 (分别为 10 -4mol/L、10 -6mol/L、10 -8mol/LPb2 + )暴露 2 1d ,收集海马细胞并超声粉碎后 ,用放射免疫的方法测海马细胞cAMP水平。结果　铅抑制体外培养的海马神经元腺苷酸环化酶活性 ,降低cAMP水平。 1× 10 -8mol/LPb2 + 暴露即能抑制海马细胞腺苷酸环化酶活性。铅暴露程度越高 ,cAMP降低越明显 ,两者成负相关。结论　铅暴露后海马神经元cAMP水平下降可能是铅影响学习记忆的机制之一。     

蛋氨酸胆碱对染铅大鼠海马神经元影响

目的 探讨蛋氨酸胆碱对刚断乳SD大鼠铅染毒后海马神经元形态及超微结构损伤的改善作用。方法 40只SPF级SD雄性大鼠随机分为5组:空白组、染铅组、蛋氨酸胆碱组、铅+低、高剂量蛋氨酸胆碱组,4和8周后分别麻醉动物,尾尖采血,原子吸收法测血铅含量;心脏灌注内固定,取海马做石蜡切片、硫堇染色观察海马神经元形态结构,戊二醛再固定,透射电镜观察超微结构。结果 铅染毒4、8周后,染铅组大鼠血铅含量分别升高至(274.85±19.51)、(294.32±11.00)μg/L,与染铅组比较,铅+高剂量蛋氨酸胆碱组血铅含量(187.25±16.02,192.68±14.17)μg/L明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);硫堇染色和透射电镜结果显示,4周时海马神经元无明显改变;8周时CA1区神经元有缺失、坏死,细胞数量由每3个视野(光镜400×)(306.00±43.05)个减少至(234.86±20.88)个,且超微结构发生改变,蛋氨酸胆碱干预后形态和结构均得到改善,且存在剂量-效应关系。结论 铅对海马神经元形态和结构损伤出现较晚,蛋氨酸胆碱可改善铅染毒大鼠海马神经元的形态和结构损伤。     

铅致原代培养海马神经元凋亡及Bcl-2、Bax、p53和NOS1基因表达的影响

目的观察铅对原代培养海马神经元的致凋亡作用并初步探讨其机制。方法原代培养乳大鼠海马神经元,不同浓度的醋酸铅(50、100和200μg/ml)染毒后,Giemsa染色观察铅诱导海马细胞凋亡的形态学改变,流式细胞仪检测铅诱导海马神经元的凋亡率,免疫细胞化学染色观察各浓度组细胞Bcl-2、Bax和p53表达,激光扫描共聚焦显微镜定量分析各浓度组神经元胞浆中游离Ca2+的平均荧光强度。结果Giesma染色观察发现一定浓度醋酸铅作用于海马神经元后出现凋亡的形态学改变,且与剂量相关;流式细胞术检测结果铅浓度分别为50、100、200μg/ml作用细胞24h后,可致海马神经元凋亡率增加,与对照组相比均有统计学意义(P<0.01);免疫细胞化学染色结果表明Bcl-2蛋白表达随染铅剂量增大而减少,染色强度逐渐降低,Bax、p53表达随染铅剂量增大而上调,与对照组相比,细胞积分光密度(IOD)值有统计学意义(P<0.01);激光共聚焦显微镜检测结果显示随着醋酸铅剂量的增大,细胞内液Ca2+浓度也随着增大,醋酸铅3个浓度组的平均荧光强度均显著高于正常对照(P<0.01),并有剂量反应关系。结论铅可诱导海马神经元不同程度的凋亡,提示细胞内Ca2+浓度升高可能与铅致海马神经元损伤和诱导其凋亡有重要关系。推测铅在一定浓度范围内可能影响海马神经元在学习记忆等功能的正常发挥。     

吡虫啉对原代培养的大鼠海马神经元的影响

吡虫啉是一种新型的高效硝基亚甲基类内吸杀虫剂 ,作用于昆虫神经系统的烟碱型乙酰胆碱受体 (ｎＡｃｈＲ) [1 ] 。吡虫啉对实验动物的急、慢性毒性研究已有报道[2 ] ,但其对神经系统的影响国内尚未见报道。为探讨吡虫啉对中枢神经系统的作用 ,我们研究了吡虫啉对原代培养的大鼠海马神经元的影响。一、材料与方法1 材料 :吡虫啉 (99% ,国家农药质量监督检验中心 ) ,二甲亚砜 (ＤＭＳＯ ,ＡＲ ,天津化学试剂一厂 ) ,ＤＭＥＭ培养液及新生牛血清 (济南爱博公司 ) ,乳酸脱氢酶 (ＬＤＨ)、总蛋白测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所 )。其他试剂…     

牛磺酸拮抗铅对原代培养皮层神经元的影响

目的:研究牛磺酸拮抗铅对原代培养的皮层神经元生长及存活的影响。方法:通过建立新生大鼠皮层神经元原代培养,用不同浓度醋酸铅染毒和给予牛磺酸干预,观察神经细胞的生长和存活情况。结果:终浓度为10-8mol/L的醋酸铅即可抑制神经元突起生长,导致细胞生长活力下降,终浓度为1.6×10-3mol/L的牛磺酸能够抑制这种损害作用,促进神经元生长。结论:牛磺酸能够拮抗铅抑制神经元生长和存活的毒性。     

锌对原代培养海马神经元MT mRNA表达的影响

目的　为探讨神经元锌内稳态机制。方法　采用实时荧光定量RT PCR法检测 :原代培养大鼠海马神经元 10 0 μmol L锌诱导后 ,不同时间点 (0、2、4、6和 8h)MT1 MT2 MT3mRNA的表达 ;及 0、5 0、75、10 0、12 5、15 0 μmol L锌诱导 4h后 ,各浓度组MT1 MT2 MT3mRNA的表达。 结果　基础状态下 ,MT的三个异构体在海马神经元内的表达峰度为 :MT3>MT1>MT2 ;在 0～ 10 0 μmol L范围内 ,MT1、MT2mRNA的表达随锌浓度增加而显著增加 ,锌浓度进一步增加时 ,MT1、MT2mRNA的表达进入平台期 ;MT3mRNA的表达随锌浓度的升高而下降 ;锌可显著上调MT1和MT2mRNA表达 ,峰值时间点在 6h左右 ;锌可使MT3mRNA的含量降低约6 0 %。结论　除MT3mRNA外 ,MT1和MT2mRNA在神经元内也有表达 ;象神经胶质细胞一样 ,神经元同样可通过增加MT1和MT2mRNA的表达以维持锌内稳态     

低剂量铅对海马神经元神经细胞黏附分子表达的影响

目的研究低剂量铅对原代培养的海马神经元神经细胞黏附分子(NCAM)表达的影响。方法将孕18dWistar大鼠麻醉后剖腹取出胎鼠,建立原代培养的海马神经元,与不同剂量的氯化铅(PbCl2)共孵育后,应用免疫印迹法技术检测培养第1至7天海马神经元NCAM的表达。结果正常条件下培养的海马神经元,第1天NCAM的表达极其微弱,积分吸光度值为14,NCAM表达的高峰时间在培养第3～5天,积分吸光度值为2542～2580;随培养时间的延长,NCAM表达逐渐降低。在铅的作用下,NCAM的表达在培养早期(第2～4天)受到抑制,且呈现明显的剂量效应关系,随时间延长,抑制程度逐渐减弱;培养至第5天,铅的抑制作用消失,10-2、10-3及10-4mmol/LPbCl2剂量组NCAM的表达甚至超出了对照组;此后,所有组的NCAM表达出现下降趋势,铅对NCAM表达的抑制又表现出剂量效应关系。结论低剂量铅暴露显著抑制了原代培养的大鼠海马神经元NCAM的表达,并造成了海马神经元NCAM表达时程上的延迟。     

铅对原代培养大鼠海马细胞周期阻断作用

低水平的慢性铅暴露对婴幼儿脑中枢神经系统不可逆的损害以及对学习记忆能力的影响是一个备受关注的问题。海马是铅脑损害的主要靶区,是大脑学习和记忆的关键部位^[1].     

铅硒共同孵育对神经细胞粘附分子表达影响

目的研究铅硒共同孵育对海马神经元存活率、轴突长度及神经细胞粘附分子(NCAM)蛋白表达的影响。方法取出生24 h Wistar乳鼠,建立原代培养的海马神经元,通过氯化铅和硒蛋氨酸染毒后,用四甲基偶氮唑盐比色法测定神经元存活率,用Image pro-plus软件测定突起长度,并用蛋白质印迹法测定NCAM蛋白表达量。结果在培养第2 d,铅硒共同孵育组中神经元轴突长度比氯化铅组增长约6～17μm,差异有统计学意义(P<0.05);随着硒蛋氨酸剂量的增加,NCAM表达量也随之增加,在次高剂量组达最高(蛋白印迹的平均灰度比值为2.00),较氯化铅组增加了23.82%,然后依次为中剂量组(1.96)、低剂量组(1.89)、次低剂量组(1.80)和高剂量组(1.75),且NCAM140表达量明显高于NCAM180。结论硒可促进轴突的向外生长,并增加海马神经元NCAM的表达。     

双苯氟嗪对铅致海马神经元损伤的保护作用

目的 观察双苯氟嗪（Dipfluzine，Dip）对铅致原代培养海马神经元损伤的保护作用，并探讨其作用机制。方法 以原代培养的海马神经元作为研究对象，用醋酸铅造海马神经元损伤模型，通过测定细胞存活率，乳酸脱氢酶（LDH）泄漏率和胞内游离钙浓度（[Ca^2＋]i），观察Dip对铅致原代培养海马神经元损伤的保护作用。结果 Dip1．0和10μmol／L可显著提高铅损伤海马神经元存活率，降低LDH泄漏率，对铅诱导的海马神经元[Ca^2＋]i升高有明显的抑制作用（P〈0．01）；Dip0．1μmol／L亦可抑制铅诱导的海马神经元[Ca^2＋]i升高（P〈0．05）。结论 Dip对铅致原代培养海马神经元损伤具有保护作用，其机制可能与其抑制铅诱导的胞内钙超载有关。     

低水平铅暴露对仔鼠海马基因表达影响

目的采用基因芯片方法,筛查低水平铅暴露对仔鼠海马基因表达的影响。方法建立出生前后低水平铅暴露大鼠的动物模型,即妊娠期和哺乳期给予母鼠0.2%醋酸铅溶液自由饮水,仔鼠断乳时测定其血铅水平,鉴定模型成功后提取仔鼠海马总RNA,采用[α-³³P]dATP标记的基因芯片检测铅对仔鼠海马基因表达谱的影响。结果实验组血铅水平(3.41±0.27)μmol/L高于对照组(0.29±0.06)μmol/L,P<0.05。基因芯片筛查发现有130个基因出现2倍以上的表达变异,其中120个上调,10个下调,多为已知功能基因,上调的包括跨膜信号传递系统的系列基因、神经代谢和发生相关的基因、神经传导相关的基因及炎症因子基因等,下调的包括与凋亡和细胞应激相关的基因。结论出生前后低水平铅暴露引起断乳期大鼠海马基因表达谱的变化,可能是发育期铅暴露影响学习记忆等海马主要生理功能的物质基础。     

慢性铅暴露对大鼠GAP-43蛋白表达和学习记忆影响

目的 探讨发育期慢性低浓度铅暴露对大鼠学习记忆及脑海马神经生长相关蛋白(GAP-43)表达影响.方法 30只孕鼠随机分为3组,自受孕1 d起,分别给予蒸馏水,0.05%,0.2%醋酸铅饮水,断乳后仔鼠自行饮用含铅水,至出生后28 d;生后56 d用水迷宫方法测试仔鼠学习记忆行为改变;蛋白印迹实验(Western blot)方法检测脑海马GAP-43蛋白表达.结果 发育期慢性低浓度铅暴露可致大鼠空间学习记忆能力下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);生后1、3、7、14、21、28 d,0.05%,0.2%醋酸铅组脑海马GAP-43表达量分别为(0.258±0.089)、(0.832±0.021)、(0.806±0.047)、(0.933±0.010)、(0.593±0.004)、(0.437±0.015)和(0.115±0.010)、(0.590±0.018)、(0.680±0.027)、(0.703±0.004)、(0.450±0.014)、(0.325±0.007),均明显低于对照组(P<0.05).结论 铅致仔鼠空间学习能力下降,与脑海马GAP-43蛋白表达水平下降有关.     

铅对原代培养海马神经细胞DNA损伤作用

目的 通过检测细胞生长抑制和凋亡相关的DNA损伤蛋白在大鼠原代培养海马细胞中的表达与原代培养海马细胞DNA损伤的相关性,探讨铅的神经毒理作用机制。方法 原代培养的海马神经细胞,于培养7 d全量更换培养液后加入不同浓度醋酸铅0.2、1.0、10μmol/L,置于37℃、5%CO₂培养箱继续培养24 h;蛋白免疫印迹(west-ern blot)方法检测生长抑制DNA损伤诱导因子(GADD 153)表达;彗星实验检测大鼠海马原代培养神经细胞DNA损伤程度。结果 与对照组比较,随着染铅浓度增高,原代培养的海马神经细胞中的DNA的尾距(OTM)和彗尾值增大,0.2、1.0μmol/L染铅组GADD 153蛋白表达较弱,染铅浓度为10μmol/L时,表达明显增加。结论 细胞DNA损伤与GADD 153蛋白表达呈一定相关性。     

铅对海马神经细胞Brn-3a表达的影响与致凋亡作用

目的　探讨体外条件下铅对神经细胞内转录因子Brn 3a的表达和致凋亡作用。方法　采用海马神经细胞体外培养建立细胞模型 ,醋酸铅的染毒浓度分别为 0 1、1、10、10 0、10 0 0 μmol L ,对照组给予等量培养液。染毒后 2 4h及 4 8h时MTT法测定各组细胞的存活率 ;免疫组织化学法测定Brn 3a的表达以及TUNEL法检测神经细胞凋亡。结果　引起海马神经细胞存活率明显下降的醋酸铅的最低浓度是 10 μmol L ,醋酸铅浓度越高 ,细胞存活率越低。1μmol L醋酸铅可引起Brn 3a阳性细胞积分光密度显著下降 (P <0 0 5 ) ,10 μmol L醋酸铅可引起Brn 3a阳性面积比的显著下降 (P <0 0 1)。 1μmol L是醋酸铅引起培养海马神经细胞凋亡的最低浓度 ,各组细胞凋亡程度呈现明显的浓度依赖效应。结论　铅对发育期海马组织的损害至少部分是与铅所致神经细胞凋亡相关联的 ,并且铅导致培养海马神经细胞Brn 3a的表达下降很可能是铅诱导神经细胞凋亡的原因之一     

宫内低水平铅暴露对新生儿神经行为及体格发育影响

目的 探讨宫内低水平铅暴露对新生儿神经行为及体格发育的影响,为采取有效措施提供依据.方法 以2011年2月-2012年7月在辽宁省沈阳市奉天医院分娩的307名新生儿为研究对象,采用石墨炉-原子吸收光谱法测定新生儿脐带血中铅的含量;采用新生儿20项神经行为检查方法评价神经行为发育情况,并测量新生儿出生时身长、体重、头围、胸围.结果 新生儿脐血铅水平呈偏态分布,范围3.0～ 126.0μg/L,几何均数为33.04 μg/L;不同脐血铅水平新生儿出生时身长、体重、头围、胸围差异无统计学意义(均P＞0.05);神经行为发育评分比较,高铅组新生儿总分[(38.17±1.361)分]及主动肌张力得分[(7.31±0.613)分]均低于中铅组[(38.38±1.106)、(7.49 ±0.579)分]和低铅组[(38.66 ±0.995)、(7.64±0.508)分],差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 宫内低水平铅暴露可对新生儿神经行为发育产生不良影响.     

铅对大鼠海马生长抑素神经元及其基因表达的影响

研究铅对大鼠海马不同亚区生长抑素 (SS)神经元及其基因表达的影响 ,Wistar大鼠采用饮水加2 0 0 0 μg ml醋酸铅 (PbAc)方法染毒 3个月后 ,用原子吸收分光光度法测定血液和海马铅的含量 ,并通过免疫组化和原位杂交技术检测海马SS和SSmRNA阳性神经元蛋白和基因表达。结果显示 ,染铅组大鼠血液和海马铅含量分别为 (1 30 0 5± 1 4 2 1 )mg L和 (1 0 1 1 62± 59 54)ng L ,较对照组的 (5 54± 0 76)mg L和 (1 81 98±47 2 7)ng L明显增高 ,差异有显著性 (P <0 0 5) ;染铅组大鼠海马CA1 区SS和SSmRNA阳性神经元数目分别为 (2 3 2 7± 4 58)和 (37 60± 9 69) ,较对照组的 (40 38± 7 61 )和 (53 48± 1 0 2 2 )明显减少 ,差异有非常显著性(P <0 0 1 ) ;染铅组大鼠海马CA3 区SS和SSmRNA阳性神经元数目为 (1 2 1 6± 3 40 )和 (1 6 1 8± 6 1 9) ,较对照组的 (1 7 68± 5 86)和 (2 5 93± 7 47)明显减少 ,差异有显著性 (P <0 0 5)。提示染铅后大鼠海马各区SS阳性神经元的蛋白、基因表达能力是降低的