终末糖基化产物、高脂诱导内皮细胞凋亡的作用途径及葛根素的保护作用*

[目的]探讨葡萄糖和高脂诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用途径及葛根素的保护作用。[方法]采用终末糖基化产物、高脂共同诱导内皮细胞凋亡建立模型,并用葛根素进行干预。采用免疫细胞化学法检测Gaspase3阳性细胞数。流式细胞分析仪检测终末糖基化产物及高脂预处理后内皮细胞凋亡百分率。[结果]中浓度终末糖基化产物（AGE50ug／mol）以及氧化低密度脂蛋白（ox—LDL50mg／L）36h作用于人脐静脉内皮细胞与正常水平的内皮细胞相比,凋亡细胞数量显著增加P〈0．05,葛根素预处理12h后显著降低高糖诱导的凋亡率P〈0．05。[结论]葛根素可以抑制高糖高脂诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,这在防治糖尿病及动脉粥样硬化并发症的过程中起到一定作用。     

丹酚酸B对AGEs诱导高脂内皮细胞凋亡的保护作用

目的：探讨丹酚酸B对糖基化终末产物（AGEs）诱导高脂内皮细胞凋亡的保护作用。方法：以AGEs和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）联合作用诱导人脐静脉内皮细胞凋亡,通过hochest 33258染色,观察不同浓度丹酚酸B（10-4、2×10^-4mol/L）作用不同时间（12、24、36、48、72h）,对内皮细胞凋亡的影响。结果：研究表明丹酚酸B能够明显抑制AGEs诱导高脂内皮细胞凋亡,并有一定剂量效应性和时间效应性。结论：提示丹酚酸B对防治糖尿病合并动脉粥样硬化具有一定作用。     

JNK信号通路在同型半胱氧酸诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

目的研究JNK信号通路在同型半胱氨酸（Hcy）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡中的作用。方法在人脐静脉内皮细胞培养基中加入不同浓度Hcy培养24h，以及加入SP600125预处理再加入10．0mmol／L的Hcy作用2h。用TUNEL法检测HUVECs凋亡情况。用Western-Blot法检测不同组HUVECs表达P-JNK的蛋白含量。结果用0．3mmol／L的Hcy干预后，HUVECs凋亡和JNK表达开始高于对照组（均P〈0．01）。100mmol／L最显著（均P〈0．01），呈浓度依赖关系；而SP600125两种浓度对HUVECs凋亡和JNK表达均有抑制作用，其中10．0umol／L更显著（P〈0．01）。结论Hey能够诱导HUVECs凋亡和上调JNK的表达，而SP600125具有明显的抑制作用，这可能是其促进动脉粥样硬化形成的重要机制之一。     

胰高血糖素样肽-1对高糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及相关机制

目的：探讨胰高血糖素样肽-1（glucagon—like peptide-1,GLP—1）对高糖诱导人脐静脉内皮细胞huma numbilica lvein endothelial cells,HUVECs）凋亡的影响及相关机制。方法：HUVECs加入不同处理因素后分组,分别培养48h后,MTT检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞早期凋亡率;Westernl印迹测定细胞P-Akt,p-eNOS水平;NO试剂盒检测NO浓度。结果：高糖（33mmol／L）培养48h后HUVECs细胞活力下降p〈0．05）,细胞凋亡率增加（p〈0．01）,细胞p-Akt,p-eNOS,NO水平均下降（P〈0．05）;高糖条件下加人GLP．1（3nmol／L）培养48h,与高糖组相比较,HUVECs细胞活力增加（P〈0．01）,细胞凋亡率减少（p〈O．05）,细胞p-Akt,p-eNOS,NO水平均增／JH（V〈0．05）;P13K抑制剂wortmannine（100nmol／L）可以阻断GLP-1的抗凋亡作用及其对P—Akt蛋白、p-eNOS蛋白及NO水平的影响;eNOS抑制剂L—NAME（100umol／L）仅能阻断GLP-1的抗凋亡作用及对NO水平的影响,不影响p-Akt蛋白的表达。结论：GLP．1可改善高糖诱导的HUVECs凋亡,该抗凋亡作用可能与P13K／Akt／eNOS通路的上调相关。     

小檗碱抑制D-半乳糖致大鼠蛋白糖基化的实验研究

目的：采用D-半乳糖诱导大鼠糖基化模型，观察小檗碱（Berberine，Ber）对蛋白糖基化反应的抑制作用。方法：D-半乳糖（150mg／kg，i．P．）给药8周，诱导糖基化模型大鼠，并于第2周开始给予小檗碱高（30mg／kg）、中（150mg／kg）、低（75mg／kg）剂量处理6周。测定红细胞醛糖还原酶活性、糖化血红蛋白含量和血清果糖胺、晚期糖基化终末产物含量。结果：小檗碱高、中剂量明显降低D-半乳糖引起的模型大鼠血糖升高（P〈0．01，P〈0．05）。降低红细胞醛糖还原酶的活性，并显著抑制糖基化产物的形成（P〈0．01，P〈0．05）。结论：小檗碱对D-半乳糖诱致的大鼠糖基化反应具有明显的抑制作用。     

白藜芦醇对高糖高脂处理的原代人脐静脉血管内皮细胞E-选择素表达及NO分泌的影响

目的：探讨白藜芦醇对高糖、高脂培养人原代脐静脉血管内皮细胞E-选择素mRNA表达及胰岛素刺激的一氧化氮（NO）分泌的影响。方法：原代培养人脐静脉内皮细胞,以0．1μmol／L白藜芦醇预处理4h后,以高糖（33．3mmol／L葡萄糖）＋高脂（棕榈酸0．5mmol／L）DMEM培养基培养24h,以RT—PCR法检测培养细胞E-选择素的表达。部分细胞经100nmol／L胰岛素刺激25min后,以硝酸还原酶法检测培养上清NO的含量。结果：与正常对照组相比．高糖高脂培养使内皮细胞E-选择素的表达升高,同时胰岛素刺激的NO分泌降低。而白藜芦醇预处理可以明显降低E-选择素的表达,并明显促进胰岛素对内皮细胞NO分泌的刺激作用。结论：白藜芦醇可以改善高糖、高脂诱导的血管内皮细胞胰岛素刺激的NO分泌作用,并可降低E-选择素表达,保护内皮细胞的功能,从而可能在糖尿病动脉粥样硬化的防治中具有广阔的前景。     

抑肽酶对内皮细胞β-链蛋白保护作用的实验研究

目的体外观察人肿瘤坏因子α（TNFα）对内皮细胞细胞连接蛋白β-链蛋白的影响及抑肽酶的保护作用，探讨抑肽酶抑制体外循环术后系统性炎性反应的机制。方法将体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分为空白组，TNFα组，抑肽酶＋TNFα组。采用免疫细胞化学法观察人脐静脉内皮细胞连接蛋白β-链蛋白（β-catenin）的表达。用细胞培养小室测定中性粒细胞跨迁单层融合的人脐静脉内皮细胞的迁移率。结果250KIU／ml抑肽酶可显著减少β—catenin的丢失（P〈0．05）；250KIU／ml抑肽酶对中性粒细胞跨迁活化的单层人脐静脉内皮细胞有显著影响（P〈0．05）。结论抑肽酶对内皮细胞细胞连接具有保护作用；抑肽酶可能通过保护内皮细胞细胞连接来抑制体外循环术后系统性炎性反应。     

内毒素对鼠肺／肠微血管及体外培养内皮细胞通透性的影响及凋亡在其中的作用

目的观察内毒素（LPS）对鼠肺和肠微血管及体外培养内皮细胞通透性的影响及凋亡在其中的可能作用。方法（1）观察内毒素血症时大鼠肺、肠组织微血管通透性的改变。（2）观察LPS对体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）通透性的影响。（3）观察LPS对体外培养HUVEC凋亡的影响，从而探讨凋亡在内皮细胞通透性改变中的作用。结果（1）在大鼠内毒素血症模型中，5ms／ks和10mg／kg LPS均可造成肺、回肠组织伊文氏兰含量增加（P〈0．01或0．05）。（2）100μg／ml LPS可显著增加体外单层HUVEC对牛血清白蛋白的通透性（P〈0．05或0．01）。（3）LPS可引起的体外培养内皮细胞的凋亡。结论（1）LPS能迅速提高体内肺微血管内皮细胞通透性，而LPS作用后6h肠微血管通透性开始增加。（2）LPS可剂量依赖性的引起体外培养脐静脉内皮细胞通透性升高。（3）细胞凋亡可能是引起内毒索血症时内皮细胞通透性的原因之一。     

氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖及IL18分泌的影响

目的探讨氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖及白介素18（IL18）分泌的影响，以阐明其在动脉粥样硬化发生中的作用。方法体外培养人脐静脉内皮细胞株，3～6代用于实验。实验分空白对照组和不同浓度ox-LDL组。将不同浓度的ox-LDL（10、20、50、100、200mg／L）与内皮细胞共同孵育12、24、36、48h。采用细胞酶联免疫吸附分析（ELISA）检测培养上清液中IL18含量；采用四唑盐比色法检测各孔的吸光值（0D），以评价增殖效果。结果10mg／L ox-LDL促进内皮细胞增殖，20～200mg／Lox-LDL呈剂量依赖性抑制内皮细胞增殖（P〈0．05，P〈0.01）。正常内皮细胞不分泌IL18。ox-LDL诱导HUVECs分泌IL18，呈浓度依赖性，100mg／L浓度时IL18分泌达高峰。ox-LDL诱导HUVECs分泌IL18亦呈时间依赖性，与12h比较，24、36、48h均有统计学意义（P〈0.05，P〈0.01）。结论ox-LDL诱导HUVECs分泌IL18，抑制HUVECs增殖，这可能与ox-LDL致动脉粥样硬化作用机制有关。     

游离脂肪酸及葡萄糖对鼠主动脉内皮细胞的影响及作用机制

目的探讨高糖高游离脂肪酸（freefattyacids,FFAs）对内皮细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法原代培养大鼠主动脉内皮细胞（rataortaendothelialcell,RAEC）,采用不同浓度的葡萄糖（5．5mmol／L,30mmol／L）及棕榈酸（200μmol／L、400μmol／L、600μmol／L）单独或联合作用于细胞24h、48h、72h。免疫组织化学染色方法鉴定内皮细胞并测定IL-8、Bcl-2、BAX表达水平：MTT比色法检测细胞增殖率。结果FFAs及葡萄糖单独及联合应用均可导致细胞出现凋亡形态学变化,增殖呈剂量-时间依赖性（P〈0．05）,且联合组明显低于单独培养组（P〈0．01）;干预后IL-8、BAX表达增加,Bcl-2蛋白表达逐渐减弱,Bcl-2／BAX比值逐渐减小,联合培养组表达更为明显。结论高浓度FFAs及高糖具有抑制内皮细胞生长、促进其凋亡的作用,其作用机制可能是通过葡萄糖及棕榈酸酯参与P13K／AKT等途径激活氧化应激诱导细胞凋亡。     

血管内皮生长因子拮抗缺氧诱导的血管内皮细胞凋亡及其机制研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)和缺氧对血管内皮细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2与Apo-1/FasmRNA表达的影响,探讨VEGF用于预防经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)后再狭窄的机制。方法将体外培养的人脐静脉内皮细胞(hUVEC)分成对照组、缺氧处理组、缺氧 VEGF处理组,12h后采用原位末端标记法、流式细胞术观察各组细胞的凋亡发生情况,通过RT-PCR法观察各组细胞中凋亡相关基因Bcl-2与Apo-1/FasmRNA表达的变化。结果与对照组和缺氧 VEGF处理组比较,缺氧处理组凋亡细胞及FasmRNA表达明显增加,Bcl-2mRNA表达明显下降,而VEGF能拮抗上述作用。结论VEGF能拮抗缺氧诱导的内皮细胞凋亡,其抗凋亡的机制可能与上调Bcl-2mRNA表达与下调Apo-1/FasmRNA表达有关。从而为VEGF预防再狭窄进一步提供了理论依据。     

光气对小鼠肺上皮细胞和内皮细胞凋亡的诱导作用

OBJECTIVE: To study apoptosis of pulmonary epithelial cells and endothelial cells in mice with pulmonary edema induced by phosgene exposure. METHODS: Thirty-two mice were divided into normal group and phosgene group with 16 mice in each group. The mice in phosgene group were exposed to phosgene (11.9 mg/L) for 5 min and those in the control group to air. Four hours after exposure, alveolar type II cells were isolated and cultured to observe their apoptosis by electron microscope and flow cytometry. The lung tissues were also taken for DNA gel electrophoresis and TUNEL assay. RESULTS: Apoptotic bodies were observed in alveolar type II cells under electron microscope in phosgene group, which had higher cell apoptosis rate than the control group [(40.26+/-7.74)% vs (1.58+/-1.01)%, P<0.001] as determined by flow cytometry. Ladder-like DNA fragmentation pattern was observed in DNA gel electrophoresis in phosgene group with apoptosis of the pulmonary epithelial and endothelial cells observed by TUNEL. CONCLUSIONS: Phosgene can induce pulmonary epithelial and endothelial cell apoptosis in mice, suggesting that the mechanism of phosgene-induced pulmonary edema involves apoptosis of the lung cells.     

光气对小鼠肺上皮细胞和内皮细胞凋亡的诱导作用

目的 研究光气对肺水肿小鼠肺上皮细胞和内皮细胞凋亡的诱导作用。方法 将32只BALB/C小鼠随机分成正常对照组(16只)和染毒组(16只)2组。正常对照组小鼠以空气为对照,染毒组小鼠给予11.9mg/L剂量的光气,时间为5min。染毒后4h,取小鼠分离、培养肺Ⅱ型细胞用于电镜观察和流式细胞仪检测细胞凋亡,取小鼠肺脏进行DNA琼脂糖凝胶电泳和TUNEL染色检测肺组织凋亡。结果 光气染毒肺水肿小鼠电镜下原代肺Ⅱ型细胞出现凋亡小体;流式细胞术显示肺Ⅱ型细胞凋亡率(40.26±7.74)显著高于正常对照组(1.58±1.01,P<0.001);DNA琼脂糖凝胶电泳出现"DNA梯状改变";TUNEL染色检测到肺上皮细胞和血管内皮细胞凋亡。结论 光气染毒可造成肺水肿小鼠肺脏细胞发生凋亡,提示光气造成小鼠肺水肿的发生机制存在细胞凋亡的诱导作用。     

体外循环血清孵育及NAC干预对血管内皮细胞凋亡的影响

目的 观察体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)血清对培养血管内皮细胞凋亡的影响及N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)的干预作用.方法 采用CPB血清致伤培养血管内皮细胞模型,以TUNEL方法及流式细胞术观察培养血管内皮细胞凋亡的改变.结果 CPB血清可致培养血管内皮细胞凋亡明显增加,0.1、1 mmol/L NAC减少CPB血清诱致的培养内皮细胞凋亡,10、100 mmol/L NAC加重CPB血清诱致的培养内皮细胞凋亡.结论 CPB血清诱致培养血管内皮细胞凋亡增加,低浓度NAC对CPB血清诱致的内皮细胞凋亡有保护作用,高浓度NAC加重CPB血清诱致的内皮细胞凋亡.     

腺病毒介导MnSOD基因转染对香烟烟雾提取物致内皮细胞氧化损伤及凋亡的影响

目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)对内皮细胞氧化损伤及凋亡的影响,腺病毒介导锰超氧化物岐化酶(MnSOD)基因转染内皮细胞后,能否部分抑制CSE致内皮细胞的氧化损伤及凋亡。方法体外培养人脐静脉内皮细胞株(ECV304),质粒转染MnSOD基因后将内皮细胞分为3组:对照组、空质粒组及MnSOD组,同时分别给予0%、5%及10%CSE刺激。收集不同CSE浓度刺激后的培养上清液和细胞爬片,TBA法检测上清丙二醛(MDA)浓度,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果(1)CSE刺激对照组内皮细胞,可致MDA浓度增加和细胞凋亡,存在CSE浓度和时间依赖性。(2)与空质粒组比较,CSE刺激后MnSOD组MDA含量和凋亡减少,有统计学意义(P<0.05)。结论(1)CSE能导致内皮细胞氧化损伤及凋亡。(2)腺病毒介导MnSOD基因可以部分抑制香烟烟雾提取物致内皮细胞氧化损伤及凋亡。     

原花青素B2保护血管内皮细胞延缓凋亡及机制研究

目的 以H2O2诱导人内皮细胞凋亡为模型,观察原花青素B2 (GSPB2)延缓人内皮细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 用0.5 mmol H2O2预处理细胞,分别加入不同浓度的GSPB2(5.0、10.0、20.0 μmol/L)保护细胞,TUNEL法检测细胞凋亡;Western blotting检测凋亡相关分子Caspase-3、Bax、Bcl-2以及影响凋亡的相关分子PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达;Transwell小室检测各组细胞迁移情况.结果 0.5 mmol H2O2致人内皮细胞凋亡明显增加(P＜0.01),GSPB2能明显减轻H2O2所致的人内皮细胞凋亡(P＜0.05),10 μmol/mL的GSPB2就能接近恢复到H2O2未处理的对照组水平.进一步研究发现:Caspase-3、bax蛋白表达上调,Bcl-2表达下调;PI3K、p-Akt、Akt表达上调.结论 不同浓度的GSPB2对H2O2诱导的血管内皮细胞具有保护作用,而且表现为浓度依赖性和时间依赖性,其机制与相关分子PI3K、p-Akt、Akt有关.     

葛根素对过氧化氢诱导平滑肌细胞凋亡的保护作用

目的探讨葛根素对过氧化氢(双氧水)H2O2诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞凋亡保护作用的机制。方法在过氧化氢(双氧水)H2O2诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞凋亡模型的基础上,以噻唑兰(MTT)法测定细胞存活率;用流式细胞术和Hoechst33258荧光染色法观察细胞受损和凋亡;用DNA琼脂糖凝胶电泳法观察细胞凋亡过程中DNA断裂程度;用免疫细胞组织化学染色法检测细胞内Caspase-3的表达。结果过氧化氢(双氧水)H2O2诱导无血清培养的平滑肌细胞凋亡,葛根素可显著降低平滑肌细胞的凋亡,减少凋亡细胞DNA断裂,平滑肌细胞坏死减少,对Caspase-3的表达有明显抑制作用。结论葛根素对过氧化氢(双氧水)H2O2诱导血管平滑肌细胞凋亡有保护作用,其机制可能与抑制Caspase-3有关。     

双自杀基因系统诱导乳腺癌细胞凋亡的体内外实验研究

目的探讨VEGF启动子驱动的双自杀基因体系对人乳腺癌细胞MCF-7靶向治疗作用以及该体系能否诱导体内外MCF-7细胞的凋亡。方法选择表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞，用重组腺病毒Ad—VEGFP—CD／TK感染之，荧光显微镜观察其感染效率。R．T—PCR．方法检测受感染细胞目的基因的表达，给予前药GCV和5-FC后于倒置显微镜观察，采用流式细胞仪检测细胞内DNA含量的变化。建立荷人乳腺癌的裸鼠动物模型，观察各治疗组的治疗效果，应用透射电镜观察移植瘤细胞超微结构。结果携带双自杀基因和报告基因（GFP）的重组腺病毒载体，感染复数为100时，95％以上的受感染MCF-7和乳腺上皮细胞中有GFP表达。RT—PCK检测发现MCF-7细胞有目的基因的表达。而乳腺上皮细胞无表达。倒置显微镜下观察用药组细胞出现凋亡征象；用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中，治疗组裸鼠移植瘤的生长明显受到抑制，其余各组肿瘤生长情况无明显差别；在透射电镜下可见治疗组多量的凋亡细胞。结论体内外实验均表明VEGF启动子可调控双自杀基因体系靶向性诱导人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡。     

抗VEGF抗体对骨肉瘤OS-732细胞血管生成及其肿瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的：探讨阻断血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)的血管生成作用对骨肉瘤OS-732细胞及血管内皮细胞增殖、凋亡的影响。方法：应用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,通过解剖显微镜血管计数,光镜HE染色,原位末端标记及PC-NA免疫组化检测观察VEGF抗体对骨肉瘤血管生成及肿瘤增殖,凋亡状态的影响。结果：VEGF抗体组肿瘤区血管数目及瘤细胞数显著低于PBS对照组,肿瘤细胞凋亡指数显著高于PBS对照组,增殖指数两组差异不明显,同时VEGF抗体组凋亡的微血管内皮细胞增多,增殖期微血管内皮细胞少见。结论：VEGF抗体能显著抑制骨肉瘤OS-732血管生成,抑制内皮细胞增殖,促进内皮细胞凋亡,可能是VEGF抗体发挥抗血管生成作用的途径之一,并可能通过抑制血管形成而促进肿瘤细胞凋亡,最终达到抑制瘤细胞生长的作用。