CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的:构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法:采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体,PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP-CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果:PCR法获得了约1 810bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论:构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。     

CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的：构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法：采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体, PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP -CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果：PCR法获得了约1 810 bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论：构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

脂多糖对人胃癌细胞环氧化酶-2基因启动子活性的影响

目的 研究炎症状态下人胃癌细胞中环氧化酶- 2( COX-2)基因启动子活性.方法 采用免疫组织化学染色方法观察人胃癌组织中COX-2的表达情况.构建人COX-2基因启动子重组质粒pGL3-COX-2-promoter,采用脂质体介导转染法将重组质粒和内参质粒pRL-TK共转染胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823.以不同质量浓度的脂多糖(LPS)工作液刺激细胞,于干预后不同时间点收集细胞,利用双荧光报告系统进行双荧光素酶报告基因活性检测,Western blotting检测COX-2蛋白的表达.结果 免疫组织化学染色观察发现,胃癌癌细胞胞质及癌旁黏膜上皮细胞的胞质中均有COX-2蛋白表达.在相同时间点,SGC-7901和BGC-823内COX-2基因启动子活性随LPS质量浓度的上升而增高(P＜0.05);高浓度(10 μg/mL)LPS刺激6h后COX-2基因启动子活性达到峰值,随后逐渐降低(P＜0.05).Western blotting检测结果显示:在10 μg/mL LPS干预下,SGC-7901和BGC-823内COX-2蛋白表达随LPS干预时间的延长而呈现上升趋势.结论 炎症刺激可激活人胃癌细胞COX-2基因启动子的表达活性.     

在神经干细胞中Sox2直接调节Olig2的转录活性

目的 研究Sox2对Olig2直接转录调节.方法 荧光素酶报告基因法(Luciferase assay)检测Sox2对 Olig2基因启动子激活作用;染色质免疫共沉淀法(CHIP assay)验证体外培养的神经干细胞中Sox2与Olig2基因启动子DNA的结合位点.结果 在神经干细胞中,Sox2转录因子与Olig2基因启动子DNA存在结合(-1232--977, ATG为+1),并能在体外激活Olig2的转录.结论 Sox2可直接调节Olig2基因的转录活性,参与干细胞向少突胶质分化潜能的维持.     

人源DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其活性检测

目的:利用PCR扩增人源DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体并对其活性进行检测。方法:运用PCR技术以人非小细胞肺癌细胞A549基因组DNA为模版扩增出目的片段,将PCR产物用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,然后进行转化、菌落PCR及测序验证等。将构建成功的pGL3-proDNMT1-luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc共转入H1299细胞中检测DNMT1启动子活性。结果:成功扩增出长度为1634 bp的目的片段,并成功构建出DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体,启动子具有活性。结论:DNMT1启动子的成功克隆为进一步研究其分子调控机制和生物学意义奠定了基础。     

含人P21启动子双荧光素酶基因载体的构建

目的构建带有EGFP标记含人P21启动子的双荧光素酶报告基因载体。方法从人血白细胞DNA中克隆P21启动子,用于控制firefly荧光素酶的表达;renilla荧光素酶基因和EGFP基因用IRES连接,在CMV启动子控制下表达;上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序的方法进行鉴定正确后转染至293FT细胞观察EGFP表达。结果经酶切、测序证实成功构建了带有EGFP标记的含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体,并成功表达EGFP。结论含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体成功构建,为下一步的药物筛选打下基础。     

Hes1基因启动子的克隆及活性研究

目的:获取人Hes1基因的启动子并对其进行活性分析。方法:以人Hela细胞基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增Hes1基因5’侧翼序列,将扩增的片段与pMD18-T载体连接,然后利用双酶切进行鉴定,并送测序;将测序正确的启动子插入pGL3-Basic,双酶切并测序鉴定。将测序正确的重组DNA质粒瞬时转染宫颈癌细胞,运用双荧光素酶报告基因检测系统检测其启动子的活性。结果:PCR扩增到的人Hes1基因启动子与基因库的序列完全一致,双荧光素酶报告基因检测系统显示其在宫颈癌细胞中具有启动子活性。结论:成功得到人Hes1基因启动子并且其具有活性。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

131I-CD133mAb诱导CD133+HepG2肝癌干细胞间质-上皮逆转分化

目的 研究131I-CD133mAb可诱导CD133+ HepG2肝癌干细胞间质-上皮逆转分化(mesenchymal-epithelial transition,MET)及可能分子机制.方法 ①用免疫磁珠分选法分选HepG2人肝癌细胞,采用流式细胞术检测分选前后CD133的表达率,体外成球和体内成瘤实验鉴定其干细胞特性.②氯胺T法制备131I标记CD133mAb并用γ免疫计数器检测标记率、放化纯度.用不同剂量(0、2.4、4.8、9.6 MBq)的131I-CD133mAb作用CD133+ HepG2细胞,用Transwell侵袭实验检测侵袭能力,Western blot检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平.结果 流式细胞术显示分选前后CD133 表达率分别为(7.21±0.05)％和(95.26±0.05)％.CD133+细胞体外成球和体内成瘤能力强于CD133-细胞.γ免疫计数器检测131I-CD133抗体标记率为86.97％,放化纯度为98.84％.Transwell侵袭实验示131I-CD133mAb各处理组(2.4、4.8、9.6 MBq)24 h细胞穿过Matrigel胶的细胞分别为(107.7±3.2)、(76.3±2.5)、(44.0±3.0)/视野,显著少于对照组(0 MBq,P＜0.01).Western blot结果显示,与对照组(0 MBq)相比,131I-CD133 mAb(2.4、4.8、9.6 MBq)处理组N-cadherin和Vimentin的蛋白表达量降低(P＜0.01),E-cadherin的蛋白表达量增加(P＜0.01).结论 在体外131I-CD133mAb作用于人肝癌CD133+ HepG2细胞可诱导间质-上皮逆转分化.     

人胎盘CD133^＋、CD133^-细胞组份中高增殖潜能集落形成细胞及其表型特征的初步探讨

目的研究人胎盘CD133^＋、CD133^-细胞亚群中高增殖潜能集落形成细胞（HPP—CFC）频率及表型特征。方法采用机械法制备人胎盘组织（PT）游离细胞悬液,用Histopaque-1077分离出单个核细胞（MNCs）,经磁式分选（MACS）分离纯化CD133^＋和CD133^-细胞。将分选的CD133^＋和CD133^-细胞分别使用H4435培养基培养4wk后观察HPP—CFC集落形成能力,用流式细胞仪（FCM）对分选的细胞组份和HPP—CFC进行表型分析。结果培养4wk后,PT—CD133^＋、CD133^-细胞生成的HPP—CFC集落分别为32．4±11．2／5×10^3,2．0±2．3／5×10^3,前者细胞中HPP—CFC数量明显高于后者（P〈0．01）;PT—CD133^＋、CD133^-细胞培养至28d时CD133^＋CD34^＋,CD133^＋CD34^-和CD133^-CD34^＋亚型均比培养前减少。结论人胎盘组织CD133^＋与CD133^-细胞群中均存在HPP—CFC,但CD133^＋细胞群中的HPP—CFC明显多于CD133^-细胞群,说明胎盘CD133^＋细胞群中存在更多的早期HSPC。     

干细胞表面标志物CD133在肝癌组织中的表达及其临床意义

目的：研究干细胞表面标志物CDl33在肝癌组织中的表达及其与临床特征的关系，并探讨与预后的相关性．方法：用免疫组织化学Envision两步法检测52例肝细胞癌组织中CD133及Ki-67的表达，对照组6例为正常肝组织．对临床病理学指标和术后生存率进行比较分析．结果：52例肝癌组织中CD133表达的平均染色强度为1．07±0．32．按照Edmondson病理分级：Ⅰ-Ⅱ级肝癌组织的CD133平均染色强度为0．67±0．18，Ⅲ～Ⅳ级为1．17±0．24，2组间差异有统计学意义（F=62．96，P〈0．05）．TNM临床Ⅰ～Ⅱ期肝癌组织中CD133的平均染色强度为0．71±0．20，Ⅲ～Ⅳ期为1．19-t-O．29，2组间差异有统计学意义（F=57．13，P〈0．05），但CD133的表达与患者年龄、性别、肿瘤的大小无关．Ki-67在肝癌组织阳性表达率为57．7％，Ki-67的表达与肝癌的分化和临床分期相关（F=8．56，7．45，P〈0．05）；CD133与Ki-67的表达呈正相关（F=18．37，P〈0．05）；CD133阴性患者平均生存率较阳性患者显著延长（P〈0．05）．结论：CD133可能与肝癌的发生、发展相关，有望成为判断患者预后的指标之一．     

CD133、TROP-2在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究初探

目的:探讨肿瘤干细胞标志物CD133?人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigens 2,TROP-2)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及意义?方法:用免疫组化?免疫荧光法检测CD133?TROP-2在NSCLC中的表达,激光共聚焦显微镜观察其定位和共定位?结果:①CD133?TROP-2在NSCLC组织中的阳性表达率分别为30.00% 和41.25%,均明显高于癌周正常肺组织及肺良性病变组织(P < 0.01);②细胞分化程度越低,CD133表达阳性率越高(P = 0.024);③CD133?TROP-2在有淋巴结转移组的阳性表达率高于无淋巴结转移组(P < 0.05),TROP-2的阳性表达率随着TNM分期的升高而升高(P < 0.05);④CD133?TROP-2在NSCLC中的表达具有密切相关性(P < 0.001),且两种蛋白有共定位现象?结论:CD133?TROP-2的阳性表达均与NSCLC的侵袭?转移密切相关,初步证实二者在NSCLC组织中存在共定位关系,CD133联合TROP-2或许能成为 NSCLC 的肿瘤干细胞筛选标记物?     

CD133+细胞在局部晚期结肠癌中的异常表达

目的 探讨CD133+肿瘤细胞对结肠癌患者预后的影响。方法 收集有完整随访资料的104例IIIB期(T3-4N1M0)结肠癌根治术后石蜡包埋组织标本及临床资料,采用免疫组化方法检测癌组织及邻近癌旁相对正常组织中CD133抗原的表达情况,分析其与患者临床特征和预后的关系。结果 肿瘤组织中的CD133+肿瘤细胞比较少见而且分布不均匀。CD133染色见于结肠癌细胞膜的腺腔面及基底,在癌巢"出芽"处及有腺管结构的低分化腺癌也可见CD133染色。生存分析显示CD133及T分期都是IIIB结肠癌的独立预后因素。肿瘤组织中CD133+细胞＜5%的患者5年生存率较高（77.4%）,≥ 5％则为45.2%。CD133的表达与其他临床病理参数均无相关性。结论 CD133+肿瘤细胞是IIIB期结肠癌患者5年生存率的独立预后因素, CD133+肿瘤细胞促进了IIIB期结肠癌的进展。     

肝细胞癌组织中三磷酸腺苷结合盒转运体G2和CD133蛋白的表达

目的:检测人肝细胞癌(HCC)组织中干细胞标志物三磷酸腺苷结合盒转运体G2(ABCG2)和CD133蛋白的表达.方法:采用免疫组织化学法检测48例HCC及癌旁正常肝组织中ABCG2和CD133蛋白的表达,并分析其表达情况与临床病理特征的关系.结果:ABCG2蛋白阳性表达率在HCC和癌旁肝组织中分别为47.9%(23/4...     

CD133 CD10在子宫内膜息肉中的表达

目的:通过研究CD133、CD10在子宫内膜息肉中的表达情况,为子宫内膜息肉提供更多的诊断方法,从而降低子宫内膜息肉的误诊率和漏诊率。方法:选取经宫腔镜及病理诊断为子宫内膜息肉患者120例子宫内膜息肉标本作为实验组,同时选取30例因阴道不规则出血行诊刮术,经病理证实为增生期子宫内膜的同期患者子宫内膜标本作为对照组,采用免疫组织化学的方法检测CD133、CD10的表达情况。结果:CD133在子宫内膜息肉组中的阳性表达率(69.16%)高于增生期子宫内膜组(26.67%),差异具有可比性(P<0.05);CD133在伴有分泌功能的子宫内膜息肉组中阳性表达率(83.05%)高于以增生期为主的子宫内膜息肉组(55.74%),差异具有统计学意义(P<0.05)。CD10在子宫内膜息肉组中的强阳性表达率降低,与对照组比较,差异具有可比性(P<0.05)。结论:CD133在子宫内膜息肉中的表达率增高,特别是在伴有分泌功能的子宫内膜息肉中呈高表达;CD10在子宫内膜息肉中表达率降低,两种因子可能与子宫内膜息肉的发病机制及组织结构有关,可以进一步研究将其作为诊断子宫内膜息肉的重要参考指标。     

单克隆抗体CD133在内皮祖细胞表达的实验研究

目的 研究CD133在内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）表面表达，为内皮祖细胞的鉴定提供依据。方法 取兔髂骨骨髓，经密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell，MSC），在血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等诱导条件下定向向内皮祖细胞分化，流式细胞仪检测不同时间内皮祖细胞CD133表达。结果 定向诱导分化细胞形态学呈现“鹅卵石”样或“铺路石”样外观，流式细胞仪检测发现细胞表达CD133，并随时间推移表达逐渐下降。结论 内皮祖细胞高表达CD133与培养时间密切相关。     

肾透明细胞癌CD133的表达及其体外对α-干扰素和5-氟尿嘧啶处理效果的影响

目的:观察肾透明细胞癌中是否存在类似肿瘤干细胞(TSC)特性的细胞,并探讨这部分细胞对干扰素及化学治疗肾透明细胞癌疗效的影响。方法:选用高转移性肾透明细胞癌细胞株RCC05-TXJ、低转移性肾透明细胞癌细胞株RCC05-ZYJ、临床原位肿瘤样本培养的低代数非转移性肾透明细胞癌细胞(来自男、女性患者各1例)。采用流式细胞术及免疫组化法检测上述4种细胞干细胞标志物CD133的表达情况;采用α-干扰素、5-FU分别处理4种细胞,用MTT法检测药物处理前后细胞存活率。结果:流式细胞术检测结果发现转移性的RCC05-TXJ及RCC05-ZYJ细胞有CD133表达,男、女性原位癌细胞CD133几乎不表达;免疫组化结果显示RCC05-TXJ及RCC05-ZYJ在细胞膜上局部表达CD133,男、女性肾透明细胞癌细胞几乎不表达CD133;化疗药和干扰素干预组RCC05-TXJ、RCC05-ZYJ均出现撤药后24 h细胞存活率明显反弹现象,而男、女性原位癌细胞在撤药后细胞存活率持续降低。结论:肾透明细胞癌中存在少数CD133阳性具TSC特性的细胞,这些细胞可能是影响干扰素及化疗效果的原因之一;针对这部分细胞的治疗有望成为今后临床药物治疗的新方向。