氢醌刺激后人肝细胞蛋白质谱表达的变化

目的研究氧醌(HQ)刺激后L-02型人肝细胞蛋白质谱的表达变化。方法传代培养的L-02型肝细胞分为空白对照组和染毒处理组。处理组经HQ(1×10-4mol／L)染毒培养24 h,对照组不做处理。提取蛋白同时进行双向凝胶电泳,图谱经PDQuest软件分析寻找差异点。实验独立进行3次,每次处理组和对照组各设3块胶作为组内重复,切取重复性较好的差异点做MALDI-TOF质谱鉴定,得到PMF通过Mascot在美国国家生物信息检索中心(NCBI)人类蛋白质数据库搜索。结果每块胶检测到约1 000个蛋白点,对照组和处理组凝胶匹配率组内达90％以上,组间80％以上,3次实验各发现17、18、24个蛋白点表达改变,变化倍数≥2。重复性较好的4个蛋白点经MALDI-TOF质谱鉴定为Rho GDP解离抑制蛋白、6-磷酸葡萄糖内酯酶、erbB3结合蛋白EBP1和核纤层蛋白,其功能与信号转导、细胞骨架及能量代谢有关。结论1×10-4mol／L的HQ处理24 h可引起L-02型人肝细胞蛋白质谱表达改变。     

利用蛋白质组学技术研究氢醌刺激后人胚肺成纤维细胞蛋白质表达改变

目的　研究氢醌 (HQ)对人胚肺成纤维细胞 (HLF)蛋白质表达的影响 ,以阐明氢醌引起细胞应答反应的分子机制。方法　细胞受HQ刺激后 ,加入裂解液 ,取上清丙酮沉淀 ,蛋白定量。双向凝胶电泳分离蛋白质组成分 ,胶体考马斯亮兰显色 ,Imagemaster2 0进行图像分析后选取差异点 ,胶内酶解后MALDI TOF进行肽指纹图谱鉴定。结果　图像分析结果显示 ,对照组HLF细胞检测到 4 90± 2 8个蛋白点 ,HQ染毒组为 4 38±2 3个。氢醌刺激后 15个蛋白斑点发生变化 ,初步鉴定了其中 8个蛋白斑点 ,包括一些氧化应激和细胞骨架相关蛋白。结论　氢醌可引起HLF细胞蛋白表达改变。     

三氯乙烯药疹样皮炎差异血清蛋白的筛选及鉴定

目的 筛选并鉴定三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)暴露者、TCE药疹样皮炎急性期及恢复期差异血清蛋白.方法 收集TCE暴露者血清(Ⅰ组)、TCE药疹样皮炎急性期患者血清(Ⅱ组)和TCE药疹样皮炎恢复期患者血清(Ⅲ组)各5份,各组血清样本等量混合,去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白后经除盐处理并定量.采用双向凝胶电泳技术对上述3组混合血清分别进行蛋白分离,银染后扫描成像,用ImageMaster Platinum 2D 5.0软件进行分析,筛选差异蛋白,并应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定.结果 经去除高丰度蛋白和除盐处理后获得了分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,处理后血清蛋白检出量增至(300±12)个.经MALDI-TOF-MS鉴定得到5个差异蛋白,分别为:补体4b、载脂蛋白A-Ⅰ、载脂蛋白C-Ⅲ、载脂蛋白C-Ⅱ和转甲状腺素蛋白.补体4bⅢ组相对Ⅰ组表达量为1.352 88,表达上调.Ⅱ组相对Ⅰ组血清中载脂蛋白C-Ⅱ相对表达量为1.512 14,表达上调;载脂蛋白A-Ⅰ、载脂蛋白C-Ⅲ和转甲状腺素蛋白相对表达量分别为-1.601 17、-1.034 49、-1.313 35,表达有所下调.结论 筛选的差异蛋白功能与机体免疫及肝功能异常有关,为阐明TCE致TCE药疹样皮炎作用机制及筛选相关生物标志物提供了重要信息.     

三氯乙烯对肝细胞一氧化氮和诱导型一氧化氮合酶表达水平的影响

[目的]研究三氯乙烯（TCE）染毒对L-02肝细胞一氧化氮（NO）合成和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达水平的影响。[方法]用TCE不同浓度（0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mmol／L）和1.0mmol／LTCE不同染毒时间（0、1、2、6、12、24h）染毒肝细胞。按试剂盒说明检测细胞培养液中NO浓度;提取肝细胞RNA,用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测肝细胞iNOS mRNA相对表达量。用全自动生化分析仪测定TCE染毒肝细胞后培养液中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）活性。[结果]不同浓度TCE染毒肝细胞24h后,各染毒组和对照组比较,NO和iNOS mRNA表达水平均明显升高;用同一浓度TCE（1.0mmol／L）染毒不同时间,≥2h染毒时间引起NO合成和iNOS mRNA表达水平升高。TCE各剂量组染毒后ALT、AST和LDH高于对照组。[结论]TCE染毒肝细胞可诱导肝细胞iNOS mRNA表达水平升高和NO合成增加,并对肝细胞有一定的损伤作用,提示TCE的肝细胞损害作用可能与NO产生有关。     

低剂量三氯乙烯诱导人正常肝细胞损伤耐受差异表达基因的研究

目的寻找低剂量三氯乙烯(TCE)诱导人正常肝细胞(L02)损伤耐受差异表达的基因。方法参照本实验室用MTT法所得的TCE对L02毒性剂量-效应关系,选择5μmolL的三氯乙烯为低剂量,40μmolL为高剂量,按以下方式对细胞进行染毒:空白对照、低剂量、高剂量、损伤耐受组(先用低剂量刺激24小时,再用高剂量刺激6小时),然后用荧光差异显示PCR(FluoroDDPCR)寻找不同方式刺激差异表达的基因,并对差异表达基因进行克隆、鉴定。结果按方法所示的方式处理细胞,处理完毕后提取各组细胞总RNA,进行荧光差异显示PCR,找到51个差异条带。对其中的11个差异条带进行克隆鉴定同源性比较,发现其中9个已知基因,2个新基因。结论用荧光差异显示PCR方法寻找TCE诱导L02损伤耐受过程差异表达的基因,通过鉴定基因,为进一步研究TCE诱导L02的损伤耐受的机理提供科学依据。     

蛋白质组学在肝细胞癌诊断研究中的进展与展望

近些年研究发现,对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)进行蛋白质组学研究有助于寻找新的能更早期、更准确、更直接地反映HCC病情的蛋白肿瘤标志物或蛋白质组模式。笔者从血清、组织和细胞阐述该领域的最新研究进展与发展前景。     

职业性三氯乙烯药疹样皮炎患者血清蛋白质差异表达分析

目的 比较职业性三氯乙烯药疹样皮炎(OMDTE)患者发病急性期与治愈后的血清蛋白质表达谱.方法 患者血清经前处理后,双向凝胶电泳分离蛋白质,软件分析凝胶图像,基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱鉴定差异表达蛋白斑点.结果 与治愈后的血清蛋白质表达谱比较,在发病急性期发现41个明显差异表达的蛋白斑点,鉴定出31个蛋白.上调的蛋白有S100钙结合蛋白A8、钙网蛋白、血清淀粉样蛋白A、亮氨酸氨基肽酶、谷胱甘肤过氧化物酶等;下调的蛋白有视黄醇结合蛋白、乙酰辅酶A羧化酶、羧肽酶N等;涉及的功能通路包括炎症反应、氧化应激、视黄醇代谢、脂肪酸代谢、激肤和过敏毒素的调节等.结论 OMDTE患者在发病急性期血清蛋白质存在明显的差异表达,鉴定的差异表达蛋白质不仅为其发病机制研究提供候选靶标,并且可能作为生物标志物应用于早期诊治.     

三氯乙烯对L-02肝细胞Rho GDIα、ANXA3及GLO1表达的影响

目的 研究三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)处理L-02肝细胞后,Rho鸟苷二磷酸分离抑制因子(Rho GDI α)、膜联蛋白A3(ANXA3)及乙二醛酶Ⅰ(GLO1)的表达变化.方法 以40 μmol/LTCE对L-02肝细胞进行染毒处理,DMSO做溶剂对照.分别采用蛋白质印迹(Western blot)法和实时荧光定量反转录一聚合酶链反应(real-time quantitative RT-PCR)法检测Rho GDIα、ANXA3及GLO1在蛋白质和mRNA水平的表达变化.结果 Western blot法分析结果 显示,TCE处理后Rho GDI α、ANXA3和GLO1蛋白表达水平均上调,差异有统计学意义(P<0.05);实时荧光定量RT-PCR结果 显示,TCE处理后ANXA3和GLO1 mRNA表达的相对值分别为2.786±0.492和1.893±0.402,而Rho GDIα的mRNA表达的相对值为0.563±0.106,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 TCE刺激后,RhoGDI α、ANXA3和GLO1蛋白分别在蛋白质和转录水平发生了相应变化,为进一步研究和揭示TCE致肝细胞损伤的分子机制奠定了基础.     

终末期肾病患者血清蛋白质组二维电泳图像与正常血清蛋白图谱比较研究

目的建立和优化终末期肾病患者血清蛋白质组研究的双向电泳及相关技术,并与正常血清蛋白图谱比较。方法以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向,对终末期肾病患者血清蛋白质样品制备、上样量、IPG胶条、等电聚焦等进行条件优化。质谱鉴定有差异表达的其中4个蛋白点。结果成功获得终末期肾病患者血清蛋白质组电泳图谱,与正常者相比存在表达有明显差异的蛋白点。结论成功建立了终末期肾病患者血清蛋白质组研究的双向电泳技术平台。     

应用双向电泳对HBV相关性肝细胞癌肝组织蛋白质组的初步研究

目的　应用双向凝胶电泳技术 (two -dimensionalgelelectrophoresis ,2 -DE) ,分离乙肝病毒相关性肝细胞癌 (hepatocellu larcarcinoma ,HCC )的癌组织和癌周组织总蛋白质 ,分析二者之间蛋白质组的差异。方法　以固相pH梯度等电聚焦为第一向 ,垂直板SDS -PAGE为第二向分离肝组织总蛋白质 ,银染显色 ,扫描仪获取凝胶图像并对其进行软件分析。结果　癌组织、癌周组织(肝硬化组织 )、癌周组织 (慢性肝炎组织 )图谱蛋白质点数存在差异 (P <0 0 5 ) ;在与癌组织蛋白质组的差异分析中 ,肝硬化组织和慢性肝炎组织之间存在显著差异 (P <0 0 1)。结论　癌组织与癌周组织的蛋白质组具有差异 ,对这些差异蛋白质点的进一步分析有助于研究HBV相关性HCC的癌变机制及肿瘤标记。     

三氯乙烯诱发L-02肝细胞毒的双向电泳分析及质谱鉴定

目的分析三氯乙烯对L-02肝细胞蛋白质表达的影响。方法利用噻唑蓝比色法和锥虫蓝拒染法,确定三氯乙烯的剂量一反应关系,建立L-02肝细胞染毒模型,提取细胞总蛋白,双向电泳分离蛋白质组成分,找出三氯乙烯处理后表达有差别的蛋白斑点。用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱进行鉴定。结果当三氯乙烯浓度达到30μmol／L时。L-02肝细胞增殖抑制率明显升高。选用40μmol／L三氯乙烯染毒的L-02肝细胞及其对照细胞进行双向电泳。获得分辨率高、重复性好的电泳图谱。结果表明,三氯乙烯染毒的L-02肝细胞蛋白点表达量升高2倍以上的有37个,蛋白点减少至1／2以下的有15个。利用质谱技术对差异蛋白点进行鉴定,肽质量指纹图谱初步鉴定了4个蛋白,肽质量指纹图谱和串联质谱进一步确定了11个蛋白。结论三氯乙烯能引起L-02肝细胞蛋白表达改变。     

日本血吸虫成虫性别差异蛋白的筛选及鉴定

目的 筛选和鉴定日本血吸虫成虫性别差异蛋白.方法 自日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.japonicum)尾蚴感染的2只家兔颈动脉灌注生理盐水冲虫,分别收集雌雄成虫各约200条.提取雌、雄成虫的水溶性和脂溶性蛋白各300μg,采用双向凝胶电泳技术分别进行分离.银染后扫描成像,用ImageMaster Platinum 2D 5.0软件进行分析,筛选差异蛋白,并予质谱鉴定.结果 雌虫和雄虫的水溶性蛋白分别检出(255±10)、(224±12)个蛋白点,疏水蛋白分别检出(200±11)、(132±8)个蛋白点;鉴定的6个差异蛋白质中,5个雌性表达上调的差异蛋白为硫氧还蛋白,铁蛋白-1重链,泛素结合酶样蛋白Mms2-泛素复合体可溶性结构B链,热休克蛋白10和胞浆脂肪酸结合蛋白突变体H,1个雄性表达上调的差异蛋白为48 kDa组胺受体亚基肽4.结论 获得了日本血吸虫成虫性别差异蛋白质.     

三氯乙烯药疹样皮炎患者免疫相关基因的表达水平

目的 探讨三氯乙烯(TCE)药疹样皮炎患者外周血免疫相关基因Foxp3、GATA3、CTLA4、T-bet的mRNA表达.方法 选取TCE药疹样皮炎患者8例为病例组,8例健康人为对照组,抽取两组对象的外周血,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术检测外周血免疫相关基因Foxp3、GATA3、CTLA4、T-bet的mRNA的表达水平.结果 与对照组比较,病例组Foxp3、GATA3、CT-LA4基因mRNA表达水平分别升高115％、97％和241％,差异有统计学意义(P＜0.01);与对照组比较,病例组T-bet基因mRNA表达水平下降47％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 TCE药疹样皮炎的部分免疫相关基因表达水平发生明显改变,这些基因可能在TCE引起的变态反应中发挥重要作用.     

三氯乙烯诱发小鼠及人外周血有核细胞DNA链断裂

为研究三氯乙烯（ＴＣＥ）的遗传毒性，应用单细胞凝胶电泳法（ＳＣＧＥ）测定了ＴＣＥ诱导人和小鼠外周血有核细胞ＤＮＡ链断裂的能力。小鼠ＴＣＥ染毒剂量为５．８ｍｍｏｌ／ｋｇ时，可见其断裂的ＤＮＡ片断在电场中迁移形成的“彗星”影像长度显著增加，并表现出明显的剂量－效应关系；ＴＣＥ职业暴露人群的外周血有核细胞ＤＮＡ有轻微损伤，但与对照组的差异无显著性，可能与调查对象接触ＴＣＥ时间较短有关。ＳＣＧＥ有可能成为评价化学毒物诱导ＤＮＡ损伤的敏感的、低损害的检测技术。     

三氯乙烯变态反应病人外周血凋亡基因表达水平的研究

目的:探讨三氯乙烯(TCE)变态反应病人外周血凋亡基因BAX、BAD、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的mRNA表达水平变化情况。方法:抽取健康人(对照组)和三氯乙烯变态反应病人(病例组)抗凝外周全血,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)技术检测外周血中BAX、BAD、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的mRNA的表达水平。结果:TCE变态反应病人(病例组)BAX、BAD、Bcl-2基因mRNA表达水平与对照组相比较,分别升高85%1、39%、227%(P<0.01);病例组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因mRNA表达水平也比对照组分别升高130%、231%2、49%(P<0.01)。结论:三氯乙烯病人外周血凋亡基因表达水平明显高于对照组,提示这些凋亡基因可能与TCE引起的变态反应存在一定的关联。     

三氯乙烯染毒对豚鼠肝功能与凋亡基因表达的影响

目的探讨使用三氯乙烯(TCE)染毒对豚鼠肝功能和肝细胞凋亡基因(BAX、BAD、Bc1-2)表达的影响。方法将24只豚鼠随机分为3组,采用豚鼠最大值法(GPMT),设立TCE实验组、阴性对照组、阳性对照组,用皮内注射的方式分别注射TCE、橄榄油、2,4-二硝基氯苯(DNCB),实验结束后观察动物皮肤改变,应用自动生化分析仪检测动物肝功能指标,用荧光定量PCR检测肝细胞凋亡基因表达水平。结果 TCE实验组和阳性对照组动物出现明显皮肤损害。TCE实验组动物血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活力明显高于阴性对照组(P0.05或P0.01)。肝细胞BAX、BAD的mRNA表达水平比阴性对照组显著升高,Bc1-2表达水平下降(P0.05或P0.01)。结论三氯乙烯可诱导豚鼠产生明显的皮肤变态反应,引起实验动物肝功能指标改变和肝细胞凋亡基因表达水平明显改变。     

Comparative proteomic analysis on human L-02 liver cells treated with varying concentrations of trichloroethylene

To determine the differential proteomic expressions in human L-02 liver cells induced by varying concentrations of trichloroethylene (TCE), comparative proteomic analysis was performed on human L-02 liver cells which were treated with varying concentrations of TCE. According to the result of MTT test, we designed four different groups, in which the cells were treated with 0 microM (control group), 3, 10 or 40 microM TCE for 24 h, respectively. Comparative analysis of approximately 800 spots resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) in the soluble proteomes of L-02 cells from the four different groups resulted in 10 differential proteins. To identify the differential spots, matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) was carried out; if the results from the tool were insufficient, tandem MS (MALDI-TOF-TOF-MS) was then performed. The raw data of peptide mass fingerprints (PMFs) and MS/MS spectra were searched against the IPI human data base for exact matches. Then western blot was employed to verify the result of proteomic analysis, the following result confirmed that the results of proteomic analysis were reliable. These results might provide an insight into the underlying mechanism of TCE intoxication and find biological markers for diagnosis and therapy of TCE-induced diseases.