应用cDNA-SRAP研究大黄不同功效组分型特异表达基因

目的:探讨生态环境和遗传背景相同条件下3种不同化学变异类型大黄在基因表达水平上的差异,揭示大黄种内变异的分子机制.方法:采用cDNA-SRAP生物信息学方法,对不同化学变异类型大黄地下组织特异表达的基因进行分析和功能预测.结果:共获得5条差异表达基因片段和4条表达量有明显差异的公共条带,其中4条功能已知,分别与植物生长发育及光信号转导、植物抗病性及水分运输相关,5条功能未知.结论:克隆了不同化学变异类型大黄特异表达的基因,为筛选优良变异类型、品种选育、功能基因组的研究提供参考.     

金银花及部分中药材黄酮合成酶Ⅱ基因多态性分析

目的揭示金银花及部分中药材黄酮合成酶Ⅱ(flavone synthasesⅡ)(FSⅡ)基因多态性,分析FSⅡ基因在种内及其不同品种、种间及科属间的差异。方法以相同生长环境下的金银花栽培品种及近缘种为材料,通过RT-PCR扩增基因编码区,测序比对,并将结果与GENBANK上大豆、甘草等部分中药材的相同基因片段进行比对。结果 FSⅡ基因编码区存在变异,部分变异会引起FSⅡ蛋白改变。结论金银花FSⅡ基因在本文所分析的编码区序列有多态性,基因在种内有一定差异,科属间差异大,与遗传学亲缘远近相关。     

红树林植物杯萼海桑法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的 对杯萼海桑Sonneratia alba萜类化合物生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因的编码cDNA序列进行克隆,为研究杯萼海桑萜类化合物生物合成与基因调控奠定基础.方法 结合杯萼海桑根的转录组注释,根据编码区序列设计引物,通过PCR方法克隆杯萼海桑FPS (SaFPS)基因的编码区cDNA.结果 PCR扩增了一个长1 029 bp的基因片段,该片段编码由342个氨基酸组成的SaFPS.同源性比对结果显示基因编码蛋白与甘草的FPS具有氨基酸一致性达86％.其具有异戊烯基转移酶的2个典型保守功能域.进化树分析结果显示,与甘草Glycyrrhiza uralensis、苜蓿Medicago truncatula、羽扇豆Lupinus albu具有较近的亲缘关系.实时荧光定量PCR结果显示SaFPS基因在花中表达量较高,果实、茎、叶中表达量相对较低.结论 首次从红树林植物杯萼海桑中克隆FPS基因获得其编码区序列,SaFPS基因具有组织表达特异性.本研究为分析基因表达特性及其在生物合成中的功能奠定基础.     

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性与甘草酸含量的相关性分析

目的:揭示甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的多态性,并阐述HMGR基因多态性与甘草酸含量的相关性.方法:以甘草酸含量差异显著的甘草个体为材料,通过RT-PCR法扩增其HMGR基因编码区;与载体pMD19-T连接后克隆测序;通过多重比对进行HMGR基因多态性分析,及与甘草酸含量之间的关联分析.结果:HMGR基因编码区多态性包括整码突变、碱基置换突变、拷贝数多态性及等位基因杂合;HMGR编码氨基酸序列中存在以下4种类型变异,即-HSL,-HSV,GALLV,GALSV,其中-HSV型为甘草中普遍存在类型,-HSL型为甘草酸低含量甘草的特有类型,GALSV型为甘草酸高含量甘草特有类型.结论:甘草HMGR基因编码区具有丰富的多态性,和甘草酸含量之间具有相关性.     

基于β-AS基因的甘草道地性形成机制研究

目的:对甘草道地性形成机制进行探索.方法:在GenBank中检索β-香树酯醇合成酶(β-AS)基因,进行序列比对并找出序列保守区,用primer premier 5.0软件设计引物,对3个不同产地甘草材料的β-AS基因进行扩增、测序,用MegAlign软件进行序列分析并构建系统树.在表达差异实验中,对来自3个产地的9份甘草材料进行总RNA提取,逆转录得到cDNA,以甘草18S基因为内参,PCR扩增后进行相对表达量分析.结果:在序列多态性实验中,9个样品的β-AS序列经比对分析共发现108处变异位点,内含子变异位点数高于外显子变异位点数两倍.在表达差异实验中内蒙组、甘肃组和宁夏组的甘草β-AS基因平均相对表达量有显著性差异.结论:不同产地甘草β-AS基因多态性的差异以及表达量的差异,可能是导致甘草道地性形成的原因之一.     

甘草质量差异研究概况

甘草是我国大宗常用药材,其来源广泛,研究不同来源甘草间质量差异意义重大.作者对不同植物来源、不同产地、不同变异类型、不同生产方式、不同栽培条件等甘草间质量差异的研究进行了综述.不同来源甘草间质量差异显著,甘草药材质量参差不齐.     

金银花HQT基因变异类型与其绿原酸含量相关性

目的揭示金银花HQT基因的变异情况,并阐述HQT基因变异类型与绿原酸含量的相关性。方法以不同产地及品种的金银花为材料,通过RT-PCR法扩增其HQT基因编码区,直接测序,通过多重比对进行HQT基因变异类型分析,进而对其与绿原酸含量之间的相关性进行分析。结果 HQT基因编码区变异包括碱基置换突变、插入/缺失突变,部分变异会引起HQT蛋白的改变,并影响绿原酸的表达量。结论金银花HQT基因编码区具有丰富的变异,与忍冬种间分类及绿原酸含量之间具有一定的相关性。     

丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析

目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析.方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平.结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53;实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到最高值.结论:从丹参毛状根中克降得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因.     

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性对其编码酶催化效率的影响

目的:利用GC-MS方法分析甘草不同3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因型表达蛋白的催化效率,为揭示甘草HMGR多态性在优质甘草药材形成中的作用奠定基础.方法:以从甘草中克隆的4种HMGR基因突变型构建表达载体,转化Escherichia coli BL21,进行诱导表达、检测、纯化及体外酶促反应,采用TLC及GC-MS对反应产物进行定性及定量分析.结果:L/V型突变(-HSL,-HSV)催化活性近似,GA插入型突变(GALLV,GALSV)催化活性近似,但插入型突变的催化活性显著高于前者,是前者的2倍左右.结论:甘草功能基因HMGR基因多态性可能是甘草优质药材形成的分子基础.     

阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆及分析

目的 克隆阳春砂萜类生物合成途径上游关键酶--3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC:1.1.1.34)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达.方法 用基于RT-PCR的方法从阳春砂叶片中获得编码HMGR的cDNA全长序列,克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异.结果 获得了全长2 023 bp的编码阳春砂HMGR的cDNA序列,命名为AvHMGR(GenBank登记号:FJ455511).AvHMGR编码的蛋白与其他植物来源的HMGR有很高相似性,含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序,N-端有两个跨膜结构域.保守功能结构域的分析结果表明AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族.AvHMGR在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达.结论 从阳春砂中克隆了AvHMGR基因,为进一步鉴定基因功能、探明阳春砂萜类生物合成的基因调控机制打下基础.     

硅对盐胁迫下甘草非药用部位总黄酮、总皂苷积累动态的影响

目的：明确甘草非药用部位总黄酮、总皂苷的积累动态及外源硅对其非药用部位总黄酮、总皂苷积累的影响效应,为甘草药用资源的综合利用提供理论依据。方法：采用盆栽试验栽培甘草植株,在其生长周 期内动态采集甘草非药用部位,采用UV-Vis法测定甘草非药用部位中总黄酮、总皂苷含量。结果：甘草叶中总 黄酮、总皂苷含量显著高于茎中。甘草茎中总黄酮含量在生长周期呈“V”型变化规律,而叶中总黄酮含量呈倒 “V”型。不同浓度外源硅明显提高了不同采样时期甘草茎、叶中总黄酮、总皂苷含量,且这种促进效应的大小 因采样时期、采样部位和硅浓度不同而异。综合而言,0.6 g/kg外源硅对总黄酮、总皂苷积累的促进作用最强。 结论：硅对盐胁迫下甘草非药用部位茎、叶中总黄酮、总皂苷的积累有明显的促进作用。     

不同来源乌拉尔甘草产量和有效成分含量比较

目的：比较不同来源乌拉尔甘草的产量、甘草酸和甘草苷含量。方法：田间观察记录甘草地上部分生长发育特性,刻度尺测量甘草根长和根粗,称重法测量甘草干物重,高效液相色谱法测定甘草酸和甘草苷含量。结果：--年生甘肃民勤栽培乌拉尔甘草的产量最高,其次是内蒙古杭锦旗乌拉尔甘草,民勤野生乌拉尔甘草的干重最低,仅为栽培甘草的80％多;甘草酸含量也是甘肃民勤栽培乌拉尔甘草的最高,达到1．79％;甘草苷含量则是民勤野生乌拉尔甘草最高为O．8％多。结论：甘肃民勤栽培乌拉尔甘草产量和甘草酸含量较高,可以作为选育高产、高甘草酸含量甘草品种的育种材料。     

中西药物对肺腺癌放射增敏基因表达谱初步研究

目的:利用基因芯片技术研究扶正增效方、甲硝唑对肺腺癌放射增敏基因表达谱,筛选出中西药物对放射增敏的差异表达基因及其共同表达基因。方法:捉取中西药物加放射组癌组织及单纯放射组癌组织RNA,分别用Cy5-dCTP或Cy3-dCTP标记,再与38500点人基因芯片杂交,筛选中西药物加放射组与单纯放射组差异表达基因。结果:中药加放射组与单纯放射组差异表达基因857条,上调349条,下调508条,其中39条GeneBank中登录,差异显著基因中15条表达上调,21条表达下调,分别为凋亡、转录调节、信号转导、细胞周期、DNA损伤与修复、免疫等相关基因;差异极显著基因1条,为THRA。西药加放射组与单纯放射组差异表达基因47条,已知显著差异基因3条,分别为DNA损伤与修复、转录调节、信号转导等相关基因。只有RARA基因在中西药放射组出现差异表达。结论:中西药物放射增敏存在不同的基因表达谱,说明中西药物放射增敏基因机制不尽相同,筛选出的特异表达基因和共同表达基因为进一步研究放射增敏药物开发和建立放射增敏动物模型具有重要意义。     

密度对甘草苗生长及甘草酸含量的影响

目的：通过对甘草密度效应的研究,揭示由各种密度所形成的群体个体之间相互作用的规律。方法：对不同密度条件下的甘草个体和群体的物候特性、生长状况、生物量积累和分配、甘草酸含量等进行研究。结果：密度对甘草的物候特性及生长状况有一定的影响。在一定密度范围内,甘草株高速生期的起止时间随密度增大逐渐提前,速生期持续时间逐渐缩短。甘草个体生物量随着密度的增大而减少,而群体生物量则随着密度的增大而增加。甘草单株根、茎、叶生物量分配比例分别为65.02％,19.55％,15.43％,根、茎、叶生物量的RSD分别为0.57%,0.49%,0.76%。较低密度处理的甘草甘草酸质量分数在0.52%～0.59%,而最高密度处理的甘草甘草酸仅为0.29%。结论：在一定范围内,密度与甘草侧枝和地下茎萌发的时间、复叶上的小叶数量、株高和地径生长量、芦头粗度、侧根数量、单株根和枝叶量、单株生物产量及甘草酸含量成负相关,与甘草群体生物产量成正相关。     

甘草柠条水浸物对种子萌发和幼苗生长的相互影响

目的：通过甘草与柠条种间化感作用的研究，揭示二者之间相互作用的特点，为甘草柠条复合种植模式的应用提供理论依据。方法：采用甘草和柠条根、茎叶和枯落物的水浸液处理彼此的种子、幼苗和移栽苗。结果：柠条根和茎叶水浸液(1～50 g·L-1)对甘草种子萌发主要表现为抑制作用，但影响的程度很小。高质量浓度(50 g·L-1)柠条茎叶水浸液对甘草种子萌发的抑制程度较大。柠条的枯落物、根和茎叶的水浸液对甘草移栽苗的外部生长和内在质量都没有产生显著的影响。甘草根和茎叶的水浸液对柠条种子萌发和幼苗生长均表现为促进作用，但影响的程度未达到显著水平。结论：在试验所采用的水浸液的质量浓度范围内，甘草柠条的种间化感作用不明显，彼此之间没有产生负面影响。     

高通量测序筛选冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络

目的:筛选冠心病血瘀证相关差异表达非编码RNA(lncRNA),微小RNA(microRNA,miRNA),信使RNA(mRNA),构建基因间调控网络,从转录组层面研究冠心病血瘀证物质基础和病理机制。方法:使用高通量测序技术,分别检测冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证和正常(各5例)lncRNA,miRNA和mRNA表达情况,通过交联分析筛选冠心病血瘀证相关的差异基因表达谱。对获得的差异基因进行功能通路分析,根据基因间Pearson相关分析和star Base靶基因预测平台,构建基因间调控网络,通过网络拓扑分析,筛选其中的关键基因。在另一匹配队列中(每组各15例)对基因调控网络中的关键节点进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)验证。结果:39个lncRNA,229个miRNA和221个mRNA与冠心病血瘀证密切相关。功能与通路分析结果显示,冠心病血瘀证差异表达基因主要与免疫和炎症相关。共有9个lncRNA(均为下调),31个mRNA(11个上调,20个下调)和24个miRNA(14个上调,10个下调)构成共调控网络,包括76个基因间调控关系。CTA-384D8.35,CTB-114C7.4,RP11-567M16.6和hsa-miR-3158-3p是冠心病血瘀证基因调控网络中的关键节点。Real-time PCR结果验证了上述结果。结论:冠心病血瘀证存在lncRNA-miRNA-mRNA差异表达基因谱,其与免疫和炎症密切相关;差异表达基因间存在相互调控关系,并可依此构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。对冠心病血瘀证的物质基础进行深度挖掘,可为从转录组层面开展中医证型相关研究提供了一定的科学基础。     

“寒淫”致病对大鼠基因表达及相关通路影响的实验研究

寒淫致病以及中药干预下,寻找大鼠差异基因表达及相关信号通路,探讨寒淫对大鼠免疫功能的影响。方法:分析正常组与寒淫组、正常组与麻黄细辛附子汤药组比较筛选差异表达基因,采用了基因功能、信号通路分析等方法探讨寒淫致病对大鼠免疫功能的影响,并作RT-PCR验证。结果:通过差异表达基因作高级筛选,得到共同的差异表达基因21条及通路10条,其中与寒淫致病密切相关的免疫功能基因及其通路有RT1-Ba基因与抗原处理和递呈通路。结论:结合差异表达基因谱的分析,提示寒淫致病与细胞因子等有密切的相关性,为下一步的研究寒淫致病提供了重要的指示性研究方向。     

基于转录组测序初步揭示天麻生长代谢的分子机制

目的以箭麻(天麻Gastrodia elata的一个生长阶段)和共生天麻(白麻与蜜环菌共生的天麻)为实验材料,通过转录组测序分析初步揭示箭麻和共生天麻生长代谢特征。方法采用Trizol Reagent(Invitrogen)提取天麻样品中的RNA,建立测序文库并利用Illumina Hiseq^TM2000进行测序,通过与基因数据库比对分析注释和发现差异表达基因。结果箭麻与共生天麻间共获得72244条序列,其中有26312条得到注释。在False Discovery Rate(FDR)<0.05和|log2FC|>1筛选条件下,共有12498条基因发生显著差异表达,其中9000条基因表达上调,3498条表达下调。京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)功能富集分析表明,差异基因显著富集在20个代谢途径中,其中包含氮代谢,碳代谢和能量代谢等途径。差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)注释到蛋白相邻类的聚簇(cluster of Orthologous Groupsof proteins,KOG)的25个分类中,其中差异表达基因与生长代谢过程相关过程能量的产生和转化(energy production and conversion,C)、碳水化合物转运与代谢(carbohydrate transport and metabolism,G)、次生代谢产物的合成、转运和代谢(secondary metabolites biosynthesis,transport and metabolism,Q)类别获得2218个注释结果。基于转录组数据,分析了生长代谢过程中相关基因差异表达水平,发现有利于碳、氮、能量等物质积累的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,ASNS)、蔗糖合成酶(sucrose synthase,Su Sy)、可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase,SSS)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸脱氢酶(pyruvatedehydrogenase,PDH),苹果酸脱氢酶(malatedehydrogenase,MDH),异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)基因呈上调表达,除分解ATP的ATP酶(adenosine-triphosphatase,ATPase)上调外,分解氮、碳物质的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)、精氨酸酶(arginase,Argase)和淀粉酶(amylase,AMS)基因呈下调表达。q RT-PCR分析结果表明这些基因表达水平与转录组表达情况基本一致。相比较于箭麻,共生天麻生长代谢中物质积累比较旺盛。结论共生天麻通过消解侵入的蜜环菌合成有机营养物质和能量,有利于其从蜜环菌和周围环境吸收营养物质供箭麻生长需要,为进一步研究天麻不同发育阶段代谢特征奠定基础,并为天麻栽培提供理论指导。     

基于冠层光谱数据的甘草产地识别研究

目的：建立不同产地甘草的近红外光谱识别方法。方法：利用甘草冠层的可见光近红外光谱数据,运用Wilks’lambda逐步法选择甘草的特征波长,采用Fisher线性判别方法对不同产地的甘草进行识别。结果：利用17个特征波段,不同产地甘草的总正确识别率达到98．3％。结论：可见光近红外光谱可作为鉴别不同产地甘草的有效方法。