6-羟基多巴胺制备帕金森病大鼠模型的神经行为学特点

目的:采用在大鼠脑右侧黑质注射6-羟基多巴胺制备帕金森病模型,观察帕金森病模型大鼠神经行为学的特点。方法:实验于2001-03/12在上海中医药大学病理学实验室完成。将62只Wistar大鼠随机分为3组。模型组:采用6-羟基多巴胺(溶于含0.2g/L抗坏血酸的生理盐水中,浓度为2g/L,以1.0mm/min速度缓慢进针,3μL/孔,注射速度为1μL/min,注射完毕后留针5min,然后以1.0mm/min速度缓慢退针)。注射于大鼠脑右侧黑质造成偏侧帕金森病模型。假手术组:注射含0.2g/L抗坏血酸的等量生理盐水,其余条件与模型组相同。正常对照组:不进行任何处理。在模型制备后第10天,以腹腔注射阿朴吗啡0.5mg/kg诱发大鼠向一侧旋转,记录开始旋转至30min内的旋转圈数,以旋转圈数平均每分钟超过7次者为合格的帕金森病模型。并观察各组大鼠在第45天的旋转行为。结果:62只大鼠中有23只大鼠造模不成功,39只大鼠进入结果分析。①正常对照组、假手术组无旋转行为。模型组在腹腔注射阿朴吗啡后0.5～4min,均开始出现旋转行为,即以左侧后肢为支点原地旋转,头尾相接,身体成环状,同时还伴有觅食、嗅探动作。②42只模型组大鼠中,造模成功19只,成功率为45%(19/42)。向左旋转的大鼠显著多于向右旋转及向左一圈,右一圈旋转的大鼠[14只,4只,1只,(P<0.05)]。③模型组在第45天的旋转圈数与第10天时接近[(526.10±173.96),(538.52±187.88)圈/h,(t=1.448,P>0.05)]。结论:①模型大鼠具有典型的神经行为学特点,主要表现为以健侧后肢为支点原地旋转。②该模型不能自行恢复,是研究帕金森病的稳定、可靠模型。     

改良帕金森病大鼠模型的建立及评价

目的：建立一种改进的帕金森病大鼠模型制作方法，并对模型进行综合评价。 方法：实验于2004—02／2005—06在军事医学科学院干细胞研究中心完成。（1）选取Wistar大鼠60只，随机分为3组，传统组20只。改良组30只。对照组10只。（2）传统组向右侧中脑黑质致密部和中脑腹侧被盖区两点各注射6-羟基多巴胺8μg制作传统帕金森病大鼠模型。改良组向中脑腹侧被盖区单点6-羟基多巴胺12μg制作改良帕金森病大鼠模型。对照组向右侧中脑黑质致密部和中脑腹侧被盖区两点各注射含2g／L抗坏血酸的生理盐水4μL。（3）检测各组大鼠行为学变化及黑质多巴胺能神经元变化。 结果：对照组和传统组术后分别有1只和4只动物在1周内死亡，改良组无动物死亡。行为学和免疫组化检测显示：（1）改良组30只大鼠有22只旋转稳定。平均转数〉7r／min。成功率超过70％，与传统组相当。改良组大鼠死亡率低于传统组（20％）和对照组（10％）。（2）术后传统组和改良组均有部分动物出现震颤、活动迟缓、易激惹、竖毛、尾僵等异常行为。（3）成功帕金森病模型大鼠中脑黑质注射侧神经元数量明显减少．达90％以上，改良组与传统组比较差异无显著性（P〉0．05），与对照组比较注射侧黑质多巴胺能神经元显著减少（P〈0．001）。 结论：改良帕金森病大鼠模型方法简便实用，动物死亡率低，模型成功率高，可以较快建立稳定的帕金森病大鼠模型。     

胎鼠中脑细胞移植对帕金森病鼠纹状体感觉门控的影响

目的：在帕金森病鼠纹状体内移植孕14～18d同种胎鼠中脑细胞，观察植入细胞对纹状体感觉门控的影响及对大鼠旋转行为的改善。 方法：①实验于2004—04／2005—05在昆明医学院生理教研室神经生理室完成。取孕龄14-18d的SD胚胎鼠．无菌条件下分离出中脑腹侧区组织，调整细胞浓度为1&;#215;10^11 L^-1．取细胞成活率大于85％的细胞悬液用于移植。②选取3月龄健康成年雌性SD大鼠25只，制备帕金森病模型，于纹状体内埋置记录电极，坐标为AP：-0．8mm．ML：2．6mm．DV：4．2mm。25只模型大鼠皮下注射阿朴吗啡1mL／kg，以雌鼠首尾相接向损伤对侧旋转360&;#176;为1圈，定向旋转大于7r／min、持续时间大于30min为帕金森病模型成功的标志，未达到标准的动物舍弃不用。共17只造模成功，随机数字表法分成两组：中脑细胞移植组12只、DMEM培养液移植组5只。③中脑细胞移植组注入已制备好的中脑腹侧细胞悬液，每点注射3μL，注射速度为0．5μL／min，注射完毕留针5min DMEM培养液移植组按同方法操作，每点注射DMEM培养液3μl。④记录清醒、自由活动状态下帕金森病鼠纹状体感觉门控的变化．以第2个声音诱发的峰一峰值／第1个声音诱发的峰-峰值（T／C）作为评价指标，并观察帕金森病鼠旋转行为的改变. 结果：实验选取25只成年雌性SD大鼠进行造模，共17只造模成功而进入结果分析. ①胎鼠中脑细胞移植对帕金森病大鼠纹状体感觉门控的影响：中脑细胞移植组大鼠移植后第3～19天，纹状体感觉门控的T／C值较DMEM培养液移植组明显增大（66．74&;#177;11．83，43．23&;#177;7．99．P〈0．05）。而第21-27天中脑细胞移植组纹状体感觉门控的T／C值明显减小，两组基本相似（46．28&;#177;9．86，43．23&;#177;7．99，P〉0．05）。②帕金森病大鼠旋转行为的评价结果：与移植前比较，DMEM培养液移植组大鼠于移植后第3，6，10，14，21，28天的旋转行为未见改善（P〉0．05）；中脑细胞移植组移植后第1周其旋转行为亦无明湿变化（P〉0．05），但第9～21天大鼠的旋转行为明显改善[（5．32&;#177;1．56）r／min．（8．78&;#177;2．19）r／min，P〈0．051，第24天起大鼠每分钟的旋转次数出现逆转，为（8.33&;#177;9．19）r／min，与移植前基本相似（P〉0．05）。 结论：①接受胎鼠中脑细胞移植的帕金森病鼠，在一定时间内可使纹状体感觉门控的T／C值显著回升，且21d内可显著改善帕金森病鼠的旋转行为。②黑质一纹状体多巴胺系统功能的修复与多巴胺能神经元及其存活状况有关，移植较成熟的胚胎中脑细胞可使该系统功能的修复提前.     

正常雌鼠及6-羟基多巴型帕金森病雌鼠黑质听觉P50诱发电位的实验研究

目的：在清醒安静的自然状态下记录雌鼠黑质听觉P50诱发电位，同时观察6一羟基多巴胺对雌鼠黑质听觉P50诱发电位的影响。 方法：实验于2003—01／2004-01在昆明医学院生理教研室神经电生理和帕金森病研究室进行。取成年雌性Sprague-Dawley鼠61只，在右侧黑质致密带埋置电极后随机分为3组：①模型组（n=25）雌鼠黑质致密带给予4μL的6-羟基多巴（2g／L），以0．5IMMmin速度推注，注射完毕留针5min。②溶剂对照组（n=15）则向黑质致密带内注入同等剂量维生素C。③正常对照组（n=21）不给药。采用试验／条件（T／C）刺激模式，在清醒安静的自然状态下记录各组雌鼠黑质听觉P50诱发电位。 结果：51只大鼠进入结果分析。①黑质内微量注射神经毒剂6-羟基多巴可成功建立帕金森病模型（皮下注射阿朴吗啡1mL／kg后，定向旋转〉7r／min，持续时间〉30min为造模成功）；成功率60％（15／25）。②P50试验／条件（T／C）比值：正常对照组为66．68&#177;3．71：溶剂对照组和正常对照组比较差异不显著（64．05&#177;5．89，P〉0．05），模型组显著低于溶剂对照组和正常对照组（39．90&#177;5．41，P〈0．01）。 结论：①正常雌鼠黑质内存在听觉P50诱发电位。②多巴胺可能对黑质P50起着重要的调节作用。     

含NURR1基因腺病毒修饰神经干细胞移植治疗帕金森病的试验

目的：观察含NURR1基因腺病毒修饰的C17.2神经干细胞移植治疗对帕金森病模型症状和组织学的改善。方法：实验于2004—03／2005-01在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。6-羟基多巴脑内立体定向及单侧纹状体两点定位注射制作SD大鼠帕金森病模型，1周后，行阿朴吗啡行为学检测，即阿朴吗啡（0．5mg／kg）腹腔内注射后30min内，计数大鼠平均每分钟身体旋转360&;#176;的次数，达到6圈／min及以上者为合格帕金森病模型，每周测1次，连续4周，获取稳定动物模型共31只，分为帕金森病模型对照组10只、帕金森病＋C17.2组11只、帕金森病＋C17．2＋腺病毒组10只，无菌收集所需的C17.2神经干细胞、含NURR1基因腺病毒载体修饰C17.2神经干细胞，浓度为（1．0-4．0）&;#215;10^9L^-1细胞，对入组的帕金森病模型进行无菌细胞注射移植，注射点与造模时注射点相同，每点约3μL，帕金森病模型对照组注射生理盐水。细胞移植后10d和4周进行阿朴吗啡诱发的帕金森病模型旋转试验，免疫组化检测帕金森病模型纹状体内酪氨酸羟化酶阳性神经元数量。结果：在实验过程中又有4只死亡，共有27只帕金森病模型鼠进入试验。①帕金森病模型旋转圈数：移植后10d和4周帕金森病＋C17．2组和帕金森病＋C17．2＋腺病毒组均少于帕金森病模型对照组，帕金森病＋C17．2＋腺病毒组少于帕金森病＋C17.2组（移植后10d：帕金森病模型对照组21．57&;#177;5．26，帕金森病＋C17．2组3．90&;#177;0．90，帕金森病＋C17．2＋腺病毒组1．56&;#177;0．58；移植后4周：帕金森病模型对照组18．40&;#177;5．84，帕金森病＋C17.2组3．60&;#177;0．67，帕金森病＋C17．2＋腺病毒组1．00&;#177;0.55，P〈0．05）。②纹状体内酪氨酸羟化酶阳性细胞数：移植后10d帕金森病＋C17．2组和帕金森病＋C17．2＋腺病毒组多于帕金森病模型对照组，帕金森病＋C17．2＋腺病毒组多于帕金森病＋C17．2组（帕金森病模型对照组3．50-0．67，帕金森病＋C17．2组13．17&;#177;1．89，帕金森病＋C17．2＋腺病毒组20．50-1．67，P〈0．05）。结论：NURR1基因结合神经干细胞有效改善了帕金森病模型症状，提高移植后酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞的数量。     

微囊化PC12细胞移植治疗帕金森病：微胶囊材料的生物学特征

背景：帕金森病系中脑黑质多巴胺能神经元变性，使纹状体内多巴胺减少而出现一系列临床症状。将分泌多巴胺的细胞或转染多巴胺合成限速酶基因的细胞进行脑内移植，能一定程度地逆转或改善症状，但存在免疫排斥的问题。目的：探讨在不使用免疫抑制剂的情况下，应用免疫隔离的方法进行细胞移植治疗帕金森病大鼠，观察微胶囊的生物相容性及其机械强度。设计：随机对照实验。单位：中国科学院大连化学物理研究所生物技术部生物医用材料工程组，吉林大学第二医院神经内科。材料：实验于2003—08／2004-02在吉林大学第二临床学院动物实验中心完成。选择雄性Wistar大鼠40只。PC12细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。方法：在纹状体内注射6-羟多巴胺盐溶液制备帕金森病动物模型。其中制备模型成功大鼠25只，随机分为微囊化细胞移植组12只：将25μL的微囊化细胞悬液（相当于2．5&;#215;10^4个细胞）分两点定位注射到动物模型右侧（损毁侧）纹状体内。非微囊化细胞移植组7只：植入25μL裸PCI2细胞悬液（相当于5&;#215;10^4个细胞）。空微胶囊移植组6只：植入25μL的空微胶囊悬液。各组大鼠在移植后第7天注射阿朴吗啡（0．05mg／kg），然后记录每只大鼠的旋转行为，1次／周，共12周。术后12周处死大鼠，取脑组织进行病理学观察，回收微胶囊观察生物相容性和免疫隔离作用。主要观察指标：①微胶囊在大鼠纹状体内的生物相容性。②微胶囊的免疫隔离作用。③各组大鼠移植前后平均旋转圈数。结果：进入结果分析25只，其余均为模型制备不成功而脱落。①微胶囊的生物相容性：回收的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微胶囊，形态完整，表面光滑，无炎细胞浸润。②微胶囊的免疫隔离作用：微胶囊内的PC12细胞继续增殖，部分形成了细胞团。③各组大鼠移植前后平均旋转圈数：移植前各组大鼠的单侧旋转记录无明显不同（P〉0．05）。微囊化细胞移植组移植2周后平均旋转圈数明显低于移植前，甚至停止旋转，症状的改善保持至移植后12周。非微囊化细胞移植组的平均旋转圈数也明显低于移植前，但8，12周又有上升趋势，与移植前无明显变化（P〉0．05）。空微胶囊移植组移植前后的旋转圈数基本一致。结论：①海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微胶囊有良好的生物柑容性和机械强度，在移植部位不引发炎症反应，并保持形态的完整性。②海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微胶囊有免疫保护作用，包封的PC12细胞移植到帕金森病大鼠的脑内可以长期存活，继续保持正常的生理功能，通过合成和释放多巴胺，改善帕金森病大鼠的症状。     

肿瘤坏死因子α在帕金森病模型鼠纹状体中的表达

目的：探讨前炎性细胞因子肿瘤坏死因子在帕金森病模型大鼠发病中的作用。方法：实验于2004—02／04在吉林大学第二医院动物实验室完成。将50只Wistar大鼠，随机分为模型组（n=26）、生理盐水组（n=12）和正常对照组（n=12）。将5μL神经毒素6-羟基多巴（2μL）立体定向术注入大鼠右侧纹状体内，制备帕金森病模型，生理盐水组以等量的生理盐水代替，正常对照组不干预。术后2周开始检测由阿朴吗啡诱发的旋转行为（向左侧旋转速度大于7r／min为模型成功的标志）。术后2个月每组取2只鼠行病理切片观察黑质多巴胺能神经元的改变及肿瘤坏死因子α的表达，每组取10只鼠采用酶联免疫吸附法检测纹状体内肿瘤坏死因子α的含量。结果：36只大鼠进入结果分析。①造模组造模成功有18只。模型组右侧黑质致密区内多巴胺能神经元几乎消失，残存细胞萎缩；右侧黑质和纹状体内均有肿瘤坏死因子α的阳性表达，且主要分布在激活的小胶质细胞上。②纹状体内肿瘤坏死因子α的含量：模型组右侧显著高于左侧[（3．853&;#177;0．364），（2．891&;#177;0．306）ng／g，t=2．391，P〈0．05]；也显著高于正常对照组和生理盐水组右侧[（2．721&;#177;0.446），（2．960&;#177;0．341）ng／g，P〈0．05]。结论：肿瘤坏死因子α参与了6-羟基多巴胺导致的多巴胺能神经元死亡的过程。帕金森病大鼠模型的发病机制中有炎症因子的参与，氧化应激与炎性作用机制可能密切相关。     

中西药合用对帕金森病大鼠神经细胞凋亡的影响

目的：观察滋补肝肾、通络解毒中药与美多巴台用对帕金森病大鼠神经细胞凋亡的影响。 方法：实验于2003一03／200406在上海中医药大学科研实验中心完成。①选用雄性Wistar大鼠58只。7-8周龄。将其中40只大鼠用于制备帕金森病模型（以6-羟基多巴胺注射于大鼠脑右侧黑质，10d后腹腔注射阿朴吗啡0．5ms／kg诱发大鼠向一侧旋转，以开始旋转至30min内旋转圈数平均每分钟超过7次者为合格帕金森病模型），造模成功18只，随机分为2组：模型组、中西药治疗组，每组9只；另纳入9其正常大鼠为正常对照组（只固定大鼠，不进行任何处理），9只大鼠注射含0．2g／L抗坏血酸的等量生理盐水（其余条件与造模手术相同大鼠）为假手术组。②然后，正常对照组、假手术组、模型组：灌胃生理盐水2mL。中西药治疗组：灌胃中西药混悬液2mL[滋补肝肾、通络解毒巾药：汤药内含熟地、桑寄生、拘杞予、天麻、钩藤、僵蚕、丹参、莪术、白芍、生南星，按既定工艺煎煮成汤药，每毫升含原药材2．961g，由上海中医药大学附属龙华医院制剂室制备；蝎蜈胶囊内音全蝎、蜈蚣，0．3S／粒．由上海中医药大学附属龙华医院提供，批号；010813。按比例将胶囊混匀于汤药中，使浓度为3．006S／mL；含美多巴（上海罗氏制药公司产品，批号：052000，250mg／片）135mg／kg），1次／d，共45d。③实验结束后，每组取6只大鼠，处死，取出中脑组织，甲醛固定，梯度脱水，常规白蜡包埋，冠状切片，每块脑组织5张切片；每组取3只大鼠进行心脏灌注同定，后分离中脑黑质，制作电镜标本。用原位末端标记法染色和透射电镜（&;#215;9000）的方法观察中西药合用对神经细胞凋亡的影响。④组间比较采用方差分析。 结果：造模失败22只，由于造模失败脱失22只，进入结果分析36只。每组9只。①模型组标本中均能检测到原位末端标记法染色阳性细胞核，细胞核呈棕褐色。但主要集中在损毁侧黑质区内，细胞核体积缩小。或明显皱缩，形态呈圆形或不规整。模型组神经细胞凋亡数明显多于正常对照组、假手术组和中西药治疗组[（37．83&;#177;6．46），（1．67&;#177;1．9），（1．83&;#177;1．92），（1．28&;#177;4．75）个，P〈0.01]。中西药治疗组也能检测到凋亡细胞核，但与模型组比较，凋亡细胞数较少，单个散在分布。②电镜检查结果显示中西药合用组神经细胞病理变化明显比模型组轻，细胞膜稍有皱缩，细胞体积略缩小，线粒体等细胞器形态正常，细胞核稍呈皱缩状态，染色质有轻度凝聚成块并有边聚倾向，核膜基本完整。 结论：中西药合用对帕金森病犬鼠神经元细胞凋亡有明显抑制作用。     

海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PCI2细胞脑内移植改善帕金森病模型鼠的旋转行为

背景：细胞组织的微囊化移植是近年来帕金森病治疗的研究热点之一。目前发展较成熟、应用较多的是海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊，但其易于囊周纤维化、易破碎等缺点，使其临床应用受到了限制。应用国内研制的新型微胶囊材料海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊将PC12细胞微囊化后移植入帕金森病模型鼠纹状体内，观察其作用。目的：观察海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞脑内移植治疗，改善帕金森病模型大鼠旋转行为的作用。设计：随机对照动物实验。单位：吉林大学第二医院和中国科学院大连化学物理研究所。材料：成年雄性Wistar大鼠40只，体质量（220&;#177;10）g；海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊；PC12细胞。方法：实验于2002—05／12在吉林大学第二医院动物实验室和中国科学院大连化学物理研究所完成。①应用国产新型材料壳聚糖制成的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞。②将成功建立的23只帕金森病大鼠模型随机分为3组，微囊化PC12细胞组10只、裸PC12细胞组7只、空微胶囊组6只。分别将海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊化PC12细胞、裸PC12细胞、空微胶囊移植入帕金森病模型鼠损伤侧纹状体内。③以阿朴吗啡检测移植前后大鼠旋转行为的差异。观察黑质及纹状体内微包囊的形态并检测微胶囊内细胞的活性。主要观察指标：①移植前后大鼠的旋转行为。②黑质和纹状体的病理形态。（3）回收的微包囊的完整性及囊内PC12细胞的活性。结果：①微囊化PC12细胞移植组在移植4周时旋转行为显著低于移植前和空微囊移植组【（6．9&;#177;2．8），（11．7&;#177;5．5），（10．5&;#177;1．6）r／min，P〈0．05】，症状改善至少持续3个月；裸PC12细胞移植组大鼠的旋转行为与移植前相比也有改善【（5．6&;#177;1．1），（9．5&;#177;1．5）r／min,P〈0．05]，但仅持续了2个月，且部分大鼠颅内有致死性肿瘤形成。空微囊移植组移植前后大鼠的旋转行为无明显差异。（爹回收微胶囊内的PC12细胞再培养生长良好，并且具有生物活性。结论：微囊化PC12细胞脑内移植能够改善阿朴吗啡诱发的帕金森病模型鼠的旋转症状。海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠新型微胶囊具有免疫隔离和抑制肿瘤形成的作用，有着广泛的临床应用前景。     

针刺苍白球内侧部对帕金森病模型大鼠脑内抗氧化酶的调节

目的；观察针刺苍白球内侧部对帕金森病模型大鼠行为学及纹状体抗氧化酶的影响。方法：①实验于2001—07／12在黑龙江中医药大学针灸生理实验室完成。选用健康Wistar大鼠45只。②选取35只大鼠，应用偏侧纹状体立体定位注射6-羟基多巴胺的方法制备帕金森病模型大鼠，将造模成功的帕金森病模型大鼠18只随机分为2组：模型组9只，治疗组9只．治疗组：借助脑赢体定位技术将改制的针灸针垂直刺入帕金森病模型大鼠患侧苍白球内侧部进行针刺治疗，1次／d，连续治疗1周；然后再应用G．6805Ⅱ型电针治疗仪进行电针治疗[强度1mA左右（以大鼠能耐受且不激怒、嘶叫为标准），频率为100Hz，连续波1，持续15min，1次／d，连续治疗2周。另取10只大鼠为空白对照组，在大鼠左侧纹状体区注射含0．2％的抗坏血酸的生理盐水5μL。模型组及空白对照组：不再做任何处理，正常饲养3周。③分别于钊刺治疗前、针刺后1周、电针后1周、电针后2周后于3组大鼠背部皮下注射阿朴吗啡0．5mg/kg诱发旋转，记录给药后10-40min内各组大鼠的旋转次数。④行为学检测完毕后，按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明步骤，取组织匀浆上清液，通过722分光光度仪用化学比色法测定各组大鼠纹状体谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、丙二醛的含量。⑤计量资料差异比较采用t检验。结果：因造模失败脱失17只，进入结果分析28只。①治疗组从治疗后1周开始，旋转次数逐渐减少，针刺治疗后1周，电针治疗后1和2周分别比治疗前减少14．55％，49．50％，67，07％，即随着治疗时间的延长，帕金森病大鼠的行为学改变明显好转。针刺治疗后1周，其旋转次数与治疗前比较，差异不明显（P〉0．05）；电针治疗后1和2周，旋转次数明显少于治疗前（P〈0．01）。②模型组大鼠纹状体丙二醛含量明显高于空白对照组（P〈0．01）。治疗组大鼠纹状体丙二醛含量明显低于模型组（P〈0．01）。模型组超氧化物歧化酶含量与空白对照组比较，整异不明显（P〉0．05）。模型组大鼠谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶含量明显低于空白对照组和治疗组（P〈0．05-0．01）。3组大鼠纹状体超氧化物歧化酶含量差异不显著（P〉0．05）。结论：针刺苍白球内侧部可明显改善帕金森病模型大鼠的行为学，同时针刺苍白球内侧部可以减轻多巴胺能神经元的脂质过氧化反应，对氧化应激所引起的神经损伤且有保护作用。