脂多糖诱导肺微血管内皮细胞SSeCKS mRNA表达的研究

目的 研究脂多糖(LPS)对体外培养大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)中Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)mRNA表达的影响,以及甲泼尼龙对其的干预作用.方法 体外培养大鼠PMVEC,根据与LPS孵育时间和LPS剂量不同随机分组,并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PMVEC中SSeCKS mRNA的表达变化.结果 正常情况下,PMVEC中SSeCKS mRNA低表达.LPS在体外可诱导SSeCKS mRNA的表达明显增高,表达水平变化与LPS呈剂量和时间依赖关系:LPS孵育1 h后,PMVEC中SSeCKS mRNA的表达量随LPS剂量增加而逐渐增高(正常对照组为0.263±0.033;LPS 0.1 mg/L时为0.529±0.066,1 mg/L时为1.391±0.048,10 mg/L时为2.339±0.055,100 mg/L时为2.861±0.069),组间比较差异有统计学意义(F=639.096,P＜0.05);10 mg/L的LPS与PMVEC共用孵育,0.5 h SSeCKS mRNA表达开始增高,1 h时达峰值,之后逐渐降低,12 h表达仍高于正常水平(正常对照组为0.301±0.022;LPS 0.5 h为1.617±0.018,1 h为2.378±0.031,3 h为2.148±0.056,6 h为1.322±0.042,12 h为0.772±0.044),组间比较差异有统计学意义(F=726.346,P＜0.05).甲泼尼龙干预后可显著抑制LPS诱导的SSeCKS mRNA表达增高(2.664±0.104比1.759±0.151,F=156.000,P＜0.05).结论 ①LPS可诱导大鼠PMVEC中SSeCKS mRNA表达上调,并呈剂量和时间的依赖关系,提示SSeCKS与LPS诱导的大鼠PMVEC损伤有关.②甲泼尼龙参与可抑制LPS诱导的SSeCKS mRNA表达增高.     

src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF-α

目的 探讨src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响.方法 体外培养Wistar大鼠PMVEC,按随机数字表法分组(n=4),10 mg/L LPS刺激1h、3h、6h、12h、24 h或0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L LPS刺激24 h;蛋白激酶C抑制剂(BIM)预处理0.5h或50 nmol/L SSeCKS-siRNA转染PMVEC 48 h后再加入10 mg/L LPS孵育24 h,酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清TNF-α量(ng/L).采用SPSS10.0软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析,以P＜ 0.05为差异具有统计学意义.结果 0.1、1、10 mg/L LPS刺激PMVEC 24 h后的,TNF-α分泌量分别为(253.70±23.55)、(327.88±37.25)、(403.20±36.22) ng/L,均高于未刺激组(82.28±22.56) ng/L(均P =0.000);10 mg/L LPS刺激PMVEC后,TNF-α分泌量于1h升高(170.11±49.22) ng/L,6h达峰值(404.82±13.78) ng/L,刺激24 h后仍维持高水平(395.67±36.23) ng/L,分别与未刺激组(84.60±23.61) ng,/L比较:P=0.001,0.000,0.000;BIM预处理PMVEC后再给予LPS刺激,TNF-α分泌量(200.44±27.39) ng/L较LPS单独刺激(402.28±31.07) ng/L显著较少(P=0.000);与LPS单独刺激比较(407.28±32.64) ng/L,SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS表达后,LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应(195.20±13.28)ng/L也显著下降(P=0.000).结论 下调SSeCKS表达和蛋白激酶C活性可抑制LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应,从而减轻PMVEC的炎症反应.     

Src抑制的蛋白激酶C底物在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓中的表达及其意义

目的 研究Src抑制的蛋白激酶C底物(Src-suppressed C kinase substrate,SSeCKS)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)进程中的表达情况,探讨其在EAE病理过程中可能的功能及意义,为多发性硬化(mul...     

血小板内蛋白激酶C活化诱导血小板发生凋亡

蛋白激酶C （Protein Kinase C,PKC）在血小板信号转导和粘附、聚集、释放等多种生理功能的发挥中均起到重要的作用.目前报道,PKC通过激活去整合素金属蛋白酶（ADAM） 10或ADAM17诱导血小板膜表面糖蛋白受体发生酶切,对血小板活化后产生负调控作用.那么PKC活化是否可诱导血小板凋亡进而负调控血小板功能,目前还不清楚.本研究目的是探讨血小板内PKC活化对血小板凋亡的影响.取健康志愿者外周静脉血并分离血小板.选择PKC特异性激活剂和抑制剂,并设置不同的时间梯度和浓度梯度,与洗涤血小板共同孵育,应用流式细胞术和Western blot等技术,检测PKC激活剂和抑制剂对血小板线粒体膜电位（△（Ψ）m）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）和磷脂酰丝氨酸（PS）的影响.实验结果表明,PKC激活剂呈时间依赖性诱导血小板发生△（Ψ）m去极化;PKC激活剂呈浓度依赖性地诱导血小板内caspase-3活化裂解,而PKC抑制剂则不能诱导血小板发生△（Ψ）m去极化和PS暴露的变化.结论：血小板内PKC活化后,可以通过影响线粒体功能和激活Caspase-3而诱导血小板凋亡,提示PKC可能参与调控活化血小板的凋亡过程,本研究结果对探明血小板活化的负调控功能及PKC活化相关疾病的发病机理具有意义.     

G蛋白偶联受体激酶2参与血小板活化因子致肺微血管内皮细胞损伤的机制

目的　探讨G蛋白偶联受体激酶 2 (GRK2 )参与血小板活化因子 (PAF)诱导大鼠肺微血管内皮细胞 (PMVEC)损伤的机制。方法　在体外分离、培养PMVEC的基础上 ,采用微滤器检测PAF作用于PMVEC前后单层通透性的变化 ;用流式细胞仪检测F 肌动蛋白 (F actin)的变化 ;并用Westernblot方法检测PMVEC的GRK2表达 ,用佛波酯刺激PMVEC以观察GRK2的变化及其对单层通透性和F actin的影响。结果　 10mg·L- 1 剂量的PAF在 12 0min内可使PMVEC单层通透性增高、F actin解聚 ,GRK2表达明显高于正常对照组 ,佛波酯刺激PMVEC可使GRK2表达进一步增高并可抑制PMVEC单层通透性增高和F actin解聚。结论　PAF作用后可引起PMVEC单层通透性增高和GRK2表达增加 ,且PMVECF actin解聚与单层通透性增高密切相关 ,GRK2表达增加可抑制PMVEC单层通透性增高和F actin解聚 ,减轻PAF对PMVEC的损伤。     

大鼠肺微血管内皮细胞通透系数检测的方法

目的 探讨肺微血管内皮细胞(PMVEC)通透系数检测的实验方法。方法 分别在trans well 小室和聚碳酸酯纤维膜上构建大鼠PMVEC单层模型,用电阻抗仪和倒置显微镜观察到细胞单层汇合后,分别应用电阻抗仪监测跨内皮细胞电阻(TER),用异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖法检测通透系数(Pd),用Hanks平衡液法检测通透系数（Lp）;同时观察脂多糖(LPS)刺激0.5h和2h后的PMVEC通透性变化,以测量值与其相应静息状态值的比值表示。结果 倒置显微镜下观察到细胞接种后3d时已汇合成单层时TER值为(39.45±3.96)Ω．cm2,Pd值为(8.52±0.50)×10-6 cm/s;随细胞接种时间增加,TER值稳定升高,接种后4d达高峰[(49.84±3.93)Ω．cm2]。静息状态下汇合成PMVEC单层的TER值、Pd值和LP值分别为(49.84±3.93) Ω·cm2、(6.15±0.63)×10-6 cm/s和(6.80±0.62)×10-7 cm．s-l．cm H2O-l。与未刺激组比较,10 mg/L LPS刺激PMVEC 0．5 h和2h后,TER法测定的通透性均下降（0.87±0.03、0.45±0.04比1．00±0.08）,Pd法和Lp法测定的通透性均增加(Pd:1.33±0.11、2.43±0.14比1．00±0.10;Lp:1.30±0.07、2.38±0.15比1．00±0.11),差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 TER法、Pd法和Lp法均能有效检测PMVEC通透系数,倒置显微镜联合TER和Pd法所测值更加精确,从而为体外研究急性肺损伤发病机制提供实验方法。     

休克淋巴液对大鼠肺微血管内皮细胞炎症介质表达的影响

目的 观察休克淋巴液对大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)自由基及一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)表达的影响,进一步探讨休克淋巴液损伤PMVECs的机制.方法 原代培养大鼠PMVECs至第3代进行研究.无菌条件下复制大鼠重症失血性休克模型(动脉压40 mm Hg维持90 min,1 mm Hg=0.133 kPa).引流正常大鼠和休克大鼠肠系膜淋巴液及门静脉血,与PMVECs孵育6h,同时以胎牛血清(FBS)和无血清的DMEM培养液作为对照.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α和IL-6的mRNA表达;检测培养上清液中丙二醛(MDA)、NO、TNF-α和IL-6的含量.结果 体积分数为4%终浓度的休克淋巴液作用6 h后,PMVECs中iNOS、TNF-α和IL-6的mRNA表达以及培养上清液中MDA、NO、TNF-α和IL-6水平均显著高于空白对照组、正常淋巴液组、休克血浆组、正常血浆组和无血清对照组;且休克血浆作用PMVEC 6 h后的iNOS、TNF-α和IL-6的mRNA表达及培养上清液中NO水平均显著高于空白对照组、正常淋巴液组、正常血浆组和无血清对照组(P<0.05或P<0.01).结论 4%终浓度的休克淋巴液可致大鼠PMVECs中iNOS、TNF-α和IL-6的mRNA表达增强,促进自由基释放,从而诱导细胞损伤.     

冠心病患者血小板和红细胞蛋白激酶C及其抑制剂活性的表达

目的探讨蛋白激酶C(PKC)在冠心病发生发展中的作用.方法测定47例稳定性心绞痛(SP)患者、49例不稳定性心绞痛(UP)患者、52例急性心肌梗死(AMI)患者、50例健康对照组血小板及红细胞胞浆与胞膜的PKC活性以及血小板胞浆蛋白激酶C抑制剂(PKCI)的活性.结果 SP、UP和AMI组红细胞胞膜和血小板胞膜中的PKC活性明显高于对照组,而其胞浆中PKC活性明显低于对照组;SP、UP和AMI组血小板胞浆中PKCI活性明显低于对照组.结论 PCK可能参与冠心病的发病.     

miR-204-5p靶向TRIB3对脂多糖诱导的肺微血管内皮细胞损伤的影响

目的 探讨miR-204-5p对脂多糖(LPS)诱导的肺微血管内皮细胞损伤的影响及其可能作用机制。方法 采用LPS诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)建立细胞损伤模型,实验分组：NC组、LPS组、LPS+miR-con组、LPS+miR-204-5p组、LPS+si-con组、LPS+si-TRIB3组、LPS+miR-204-5p+pcDNA组、LPS+miR-204-5p+pcDNA-TRIB3组;MTT法检测细胞活力;qRT-PCR、Western blot检测miR-204-5p、TRIB3表达;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测TNF-α、IL-6水平;双荧光素酶实验检测miR-204-5p与TRIB3的靶向关系。结果 与NC组比较,LPS组细胞活力、miR-204-5p表达量降低(1.00±0.10比0.43±0.04),细胞凋亡率、TRIB3 mRNA(1.00±0.09 vs 2.13±0.18)和蛋白(0.40±0.04 vs 0.83±0.08)水平、TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05);过表达miR-204-5p或敲低TRIB3可升高细胞活力,...     

血小板中蛋白激酶C活性在急性冠脉综合征患者体内的变化

测定50例不稳定型心绞痛（UA），50例ST段抬高急性心肌梗死（AMI）患者及50例正常人（NC）的血小板胞膜、胞浆蛋白激酶C（PKC）活性。结果显示：UA和AMI组血小板胞膜中的PKC显著高于NC组（P〈0．01），而UA组高于AMI组（P〈O．05）UA和AMI组血小板胞浆中PKC活性显著低于NC组（P〈0．01），而UA组低于AMI组（P〈0．05）。提示PKC可能与急性冠脉综合症（ACS）的发生和发展有关。     

脂多糖诱导大鼠主动脉内皮细胞表达血管性血友病因子裂解酶的研究

目的 从剂量-效应和时间-效应关系探讨脂多糖(LPS)对大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS-13)mRNA和蛋白表达的影响.方法 采用组织贴块法培养Wistar大鼠的RAECs,1周后按1∶3传代至第4～5代,将细胞分为空白对照组和0.01、0.1、1、5 μg/ml LPS刺激组,分别于12、24、48、72 h用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定内皮细胞ADAMTS-13 mRNA表达;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液内ADAMTS-13蛋白水平.结果 空白对照组有一定量的ADAMTS-13mRNA和蛋白表达.随着LPS刺激浓度增加和刺激时间延长,ADAMTS-13 mRNA和蛋白表达逐渐下降.与空白对照组(25.22±1.41)比较,0.01μg/ml LPS刺激48 h时ADAMTS-13 mRNA表达(18.78±0.86)即明显下降(P＜0.01);0.1μg/ml和1μg/ml LPS刺激24 h时ADAMTS-13 mRNA表达(23.43±0.63、22.41±0.76)即明显下降(P＜0.05和P＜0.01);5μg/ml LPS刺激12 h时ADAMTS-13 mRNA表达(20.01±2.47)即明显下降(P＜0.01).与空白对照组[(115.76±2.36)ng/ml]比较,0.01 μg/ml LPS刺激12 h时ADAMTS-13蛋白表达[(113.43±1.07)ng/ml]即明显下降(P＜0.05);至5 μg/ml LPS刺激72 h时ADAMTS-13蛋白表达[(7.63±2.64)ng/ml]降至最低(P＜0.01).结论 RAECs有一定量的ADAMTS-13mRNA和蛋白表达;不同浓度LPS刺激内皮细胞不同时间后ADAMTS-13 mRNA和蛋白表达降低,具有剂量依赖性和时间依赖性.     

Notch信号和血管内皮生长因子基因对大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化后内皮细胞功能的影响

目的 探讨Notch信号和血管内皮生长因子(VEGF165)基因对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化后内皮细胞功能的影响.方法 分离、培养大鼠MSCs,用含VEGF165和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的细胞培养液培养大鼠MSCs 2周诱导其向内皮细胞分化;用脂质体将携带有VEGF165基因的质粒转染诱导内皮细胞并对转染效果进行鉴定,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后细胞上Notch信号受体Notch 1和配体Jagged 1的表达变化;用γ-内分泌酶抑制剂L-685458阻断细胞Notch信号通路的转导,划痕实验检测细胞迁移能力;将细胞接种在半固体培养基上,观察其形成毛细血管样结构的能力.结果 转染VEGF165基因的内皮细胞上表达有VEGF165 mRNA,说明实验成功地将VEGF165基因导入诱导后内皮细胞中.转染VEGF165基因后,细胞上Notch信号配体Jagged1 mRNA表达增强(1.08±0.01比1.01±0.02,P＜0.01),Notch1 mRNA表达无明显变化(0.60±0.02比0.59±0.01,P＞0.05);细胞的迁移能力增强(划痕空白处细胞个数:46.45±4.46比41.61±1.42,P＜0.05),形成毛细血管样结构能力无明显变化(细胞分级:3.00±0.89比2.00±0.89,P＞0.05).内皮细胞转染VEGF165基因后,以γ-内分泌酶抑制剂L-685458阻断细胞Notch信号通路的转导,则细胞迁移能力(划痕空白处细胞个数:51.72±3.47比46.45±4.46)和形成毛细血管样结构能力(细胞分级:4.17±0.75比3.00±0.89)均进一步增强(均P＜0.05).结论 转染VEGF165基因可增强大鼠MSCs诱导分化内皮细胞的功能,在此基础上阻断Notch信号通路转导可进一步增强细胞功能.     

宫颈鳞癌组织中PINCH和血管内皮生长因子C蛋白表达的研究

目的 探讨宫颈鳞癌组织中PINCH蛋白和血管内皮生长因子C(VEGF-C)蛋白的表达意义.方法 应用免疫组化SP法检测58例宫颈鳞癌、30名正常宫颈上皮组织中PINCH蛋白和VEGF-C蛋白的表达,并分析PINCH蛋白和VEGF-C蛋白的表达与临床病理特征的关系.结果 58例宫颈鳞癌组织中PINCH和VEGF-C的表达阳性率[分别为(62.1％ (36/58)和67.2％ (39/58)]高于正常宫颈上皮(0),差异有统计学意义(x2值分别为31.512、12.534,P均＜0.001).PINCH蛋白表达与年龄、肿瘤大小、肿瘤组织分化程度无明显相关(P均＞0.05),与有无淋巴结转移及临床分期相关(x2值分别为9.090、8.263,P均＜0.01).VEGF-C的表达与患者年龄、肿瘤大小无相关性(P均＞0.05),与有无淋巴结转移、肿瘤组织分级和临床分期相关(x2值分别为10.775、13.496、5.001,P均＜0.05).PINCH蛋白及VECF-C蛋白表达有关联(C =0.341,P＜0.01).结论 PINCH和VEGF-C可能协同参与了宫颈鳞癌的发生和发展过程,并在宫颈癌的侵袭和转移机制中发挥着重要作用.     

凝血酶对牛主动脉内皮细胞组织因子活性的影响及其与PKC传导途径的关系

目的探讨凝血酶对内皮细胞组织因子（ＴＦ）活性的刺激作用及其与细胞内蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）传导系统的关系。方法传代培养新生牛主动脉血管内皮细胞,取刺激或未受刺激的第４～８代细胞冻融液测定其ＴＦ活性。结果体外培养的血管内皮细胞在静息状态下ＴＦ活性极低（４．２０±１．１９）。与对照组相比,凝血酶的刺激使内皮细胞ＴＦ活性明显升高（ｎ＝８,Ｐ＜０．００１）,且呈剂量依赖性关系（ｒ＝０．７８,Ｐ＜０．０５）和时间依赖性关系（ｒ＝０．８８,Ｐ＜０．０５）。ＰＫＣ抑制剂Ｈ７抑制凝血酶对内皮细胞ＴＦ活性的刺激作用（ｎ＝８,Ｐ＜０．０１）,且抑制作用呈剂量依赖性。ＰＫＣ激动剂佛波酯也可刺激内皮细胞ＴＦ活性增高（３０．５９±３．７９,ｎ＝８,Ｐ＜０．００１）,并可被Ｈ７阻断,ＰＭＡ对凝血酶的刺激作用没有显著影响。结论在凝血酶的刺激下,血管内皮细胞可产生较大量的ＴＦ;凝血酶对内皮细胞的这种刺激作用依赖于细胞内ＰＫＣ系统传导途径。     

内毒素对体外培养大鼠肺微血管内皮细胞血管紧张素转换酶2表达的影响

目的 观察内毒素对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)上血管紧张素转换酶2(ACE2)表达的影响,探讨ACE2参与内毒素性急性肺损伤(ALI)发生的机制.方法 体外培养Wistar大鼠RPMVEC,以10 mg/L的内毒素与之共同孵育;分别于实验3、6、12和24 h用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测ACE2的mRNA和蛋白表达.结果 10 mg/L内毒素处理RPMVEC后3 h,ACE2的mRNA和蛋白表达即显著下降,6 h有所回升,之后显著下降并持续至24 h;统计学分析显示,除6 h外,余各时间点ACE2 mRNA和蛋白表达均显著低于未用内毒素处理对照组(P<0.05或P<0.01).结论 10 mg/L内毒素可下调RPMVEC 中ACE2的mRNA和蛋白表达水平,可能是ALI发生机制之一.