HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki4组细胞24和48h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加（P〈0.05）。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达（P〈0.01）,而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变（P〉0.05）。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞（P〈0.05）,且两组细胞48h的HPV16E6 mRNA表达均较24h显著增高（P〈0.05）;在24和48h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少（P〈0.01）;但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6mRNA表达量无统计学差异（P〉0.05）。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型（p53mt/p53wt）无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗的影响

目的：研究抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗敏感性的影响。方法：以脂质体法将抗HPV16E6－Ribozyme，空载体质粒分别导入CaSKi细胞，命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在我的表达，Northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验控制3种细胞对化疗的敏感性，Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率。结果：点杂交证实核酶能在CaSKi－R细胞中稳定表达，Northern杂交证实CaSKi－R中表达E6较CaSKi－P，CaSKi明显降低。CaSKi－R细胞的生长速率较CaSKi－P，CaSKi明显减慢，泰索作用后相对克隆形成率和凋亡率在3种细胞间亦无差异（P＞0．05）；顺铂作用后CaSKi－R细胞的相对克隆形成率较CaSKi－P，CaSKi明显下降（P＜0．01），而凋亡率明显增加（P＜0．01）。结论：转染抗HPV16E6－ribozyme的CaSKi－R细胞出现一定程度的生长抑制，且对顺铂的敏感性增加，而对泰素的敏感性没有发生改变。     

宫颈癌组织中HPV16E6的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的进行人乳头瘤病毒16型相关肿瘤的E6血清学研究。方法采用聚合酶链反应(PCR)从宫颈癌组织DNA中扩增出HPV16E6基因片段,克隆至测序质粒pGEM-T中,并用限制性内切酶将HPV16E6基因切下,克隆至表达质粒pGEMEX-1中,经IPTG诱导表达为融合蛋白,分子量约45KD。结果融合蛋白占菌体总蛋白的25％,免疫印迹检测表明HPV16E6融合蛋白能被抗HPV16E6抗体识别。结论大肠杆菌表达HPV16E6蛋白的获得可为HPV相关性肿瘤的血清学诊断和流行病学研究打下基础。     

抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗的影响

目的研究抗HPV16E6核酶对宫颈癌CaSKi细胞化疗敏感性的影响。方法以脂质体法将抗HPV16E6-Ribozyme、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R、CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达,Northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达。用克隆形成试验检测3种细胞对化疗的敏感性,Annexine/PI双标法检测细胞凋亡率。结果点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,Northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P、CaSKi明显降低。CaSKi-R细胞的生长速率较CaSKi-P、CaSKi明显减慢,泰素作用后相对克隆形成率和凋亡率在3种细胞间亦无差异(P>0.05);顺铂作用后CaSKi-R细胞的相对克隆形成率较CaSKi-P、CaSKi明显下降(P<0.01),而凋亡率明显增加(P<0.01)。结论转染抗HPV16E6-ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,且对顺铂的敏感性增加,而对泰素的敏感性没有发生改变。     

宫颈癌组织中HPV16E6的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：进行人乳头瘤病毒１６型相关肿瘤的Ｅ６血清学研究。方法：采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）从宫颈癌组织ＤＮＡ中扩增出ＨＰＶ１６Ｅ６基因片段,克隆至测序质粒ｐＧＥＭ－Ｔ中,并用限制性内切酶将ＨＰＶ１６Ｅ６基因切下,克隆至表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１中,经ＩＰＴＧ诱导表达为融合蛋白,分子量约４５ＫＤ。结果：融合蛋白占菌体总蛋白的２５％,免疫印迹检测表明ＨＰＶ１６Ｅ６融合蛋白能被抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体识别。结论：     

人乳头瘤病毒16型E2/E6癌基因与宫颈癌关系的研究

目的探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2/E6癌基因在宫颈癌发生中的作用。方法采用以医院为基础的1∶1配比病例对照研究,应用热启动PCR法检测经病理诊断确诊的74例宫颈鳞癌新发病例,及同期就诊的74例宫颈良性肿瘤患者的高危型HPV16 E2/E6癌基因的状况。结果病例组HPV16 E2、E6阳性率(41.89%,52.70%)高于对照组(17.57%,21.62%),差别有统计学意义,OR分别为3.250(1.471-7.178)和3.875(1.824-8.233);病例组HPV16 E2缺失率较对照组略高。结论宫颈癌的发生与HPV感染,特别是高危型HPV16的感染密切相关;HPV16 E2基因缺失、E6基因高阳性率在宫颈癌的发生发展中起重要作用。     

慢病毒携带shRNA对宫颈癌细胞中HPV16型E6表达的抑制作用

目的研究慢病毒携带的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA, shRNA)对宫颈癌Caski细胞中人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)16型E6表达的抑制作用.方法将靶向HPV16型E6的shRNA表达序列克隆到改建的慢病毒表达载体PLL3.7中,经限制性酶切鉴定和测序后,与3种包装质粒混合,以Lipofectamine 2000包裹后转染293FT细胞,72 h后收取含病毒的上清液并感染宫颈癌Caski细胞,感染48 h后加入G418筛选阳性克隆.每天对阳性细胞克隆进行细胞计数;提取细胞总mRNA,进行RT-PCR反应.结果与对照组相比HPV16型E6的表达降低70%,宫颈癌Caski细胞生长速度减慢50%.结论慢病毒携带的短发夹状干扰RNA能干扰宫颈癌细胞中HPV16型E6的表达并有抑制癌细胞生长的作用.     

HPV16 E6基因反义寡核苷酸诱导SiHa细胞凋亡的研究

目的　探讨 HPV16 E6反义寡核苷酸 (AE6 )对宫颈癌细胞 Si Ha细胞凋亡的诱导作用 .方法　应用细胞生长抑制实验 (MTT)、透射电子显微镜 (TEM)、DNA电泳及流式细胞术 (FCM)研究 AE6对 Si Ha细胞生长抑制、超微结构改变、核酸及细胞增殖周期的影响 .结果　 AE6 1～ 40μmol· L- 1对 Si Ha细胞抑制率为 9.9%～ 6 0 .3% ,相互间有显著性差异(P<0 .0 5 ) .AE6 2 0 μmol· L- 1作用 72 h,Si Ha出现凋亡形态学改变 ,DNA电泳呈梯状带型 .AE6 5 ,10 ,2 0和 40μmol· L- 1 作用 72 h后 ,Si Ha细胞凋亡率分别为 1.9% ,7.9% ,8.1%和 19.7% .结论　 HPV16 E6基因与 HPV16阳性宫颈癌细胞的增殖和细胞凋亡密切相关 ,AE6可通过诱导 Si Ha细胞凋亡而抑制其生长 ,它的分子克隆有助于阐明宫颈癌发生的分子机制     

宫颈癌组织中乳头瘤病毒感染及抑癌基因p53突变的检测

探讨人乳头瘤病毒１６，１８型感染及抑癌基因Ｐ５３突变与宫颈癌发生的关系。方法：应用ＰＣＲ及其单链构象多态性方法，对６０例宫颈癌组织ＤＮＡ进行检测，同时选择宫颈糜烂及正常宫颈各５０例作为对照。结果：宫颈癌组织中ＨＰＶ１６感染呈明显梯度关系，且鳞癌组织中ＨＰＶ１６的检出率远比腺癌高，并高于ＣＩＮ和正常宫颈组织；相反，腺癌中ＨＰＶ１８的检出率比鳞癌高。     

pcDNA3转染HPV16E6基因对人宫颈癌细胞C33A细胞生长及周期的影响

目的 探讨HPV16E6对宫颈癌C33A细胞生长增殖的影响.方法 通过脂质体法将HPV16E6基因稳定转染宫颈癌C33A细胞,RT-PCR及Western blot分别检测转染细胞中HPV16E6 mRNA和蛋白表达水平,流式细胞仪检测HPV16E6基因转染对C33A细胞生长增殖与细胞周期的影响.结果 稳定转染获得了稳定表达pcDNA3-HPV16E6质粒的C33A细胞克隆(C33A-E6细胞,即pcDNA3/HPV16E6/C33A组)及稳定复制空载体质粒的细胞克隆(C33A-P细胞,即pcDNA3/C33A组),并将未转染的C33A细胞作为对照组.pcDNA3/HPV16E6/C33A组细胞的生长速度比pcDNA3/C33A组和对照组明显加快(P<0.05).在转染了HPV16E6基因的C33A细胞中,其DNA合成前期G1和静止期G0(G0/G1期)细胞百分率(39.3%)明显低于pcDNA3/C33A组(53.7%)和对照组(55.4%)(P<0.01);而处于S期细胞的百分率(38.3%)、DNA合成后期G2及分裂期M的细胞百分率(G2/M:32.9%),均明显高于pcDNA3/C33A组(S:29.4%;G2/M:17.0%)和对照组(S:28.0%;G2/M:16.6%)(P<0.01).pcDNA3/C33A组和对照组细胞周期的各期分布无明显差异(P>0.05).结论 HPV16E6可能通过某种途径参与了C33A细胞的周期调控,促进细胞分裂,从而促进C33A细胞的增殖.     

抗人乳头瘤病毒16型E6基因核酶对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响

目的研究抗HPV16E6核酶(Ribozyme)对宫颈癌CaSKi细胞生长和端粒酶活性的影响.方法以脂质体法将抗HPv16E6-Ribozyne、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R和CaSKi-P细胞.点杂交检测核酶在细胞中的表达,northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达;细胞生长曲线检测细胞生长的改变;TRAP-Elisa法检测端粒酶活性.结果点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达,northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P和CaSKi明显降低.CaSKi-R细胞生长速度较CaSKi-P和CaSKi明显减慢(P＜0.01);CaSKi,CaSKi-P和CaSKi-R三种细胞的端粒酶活性分别为0.89±0.14,0.90±0.11,0.36±0.06,转染了抗HPV16E6核酶的CaSKi-R的端粒酶活性的抑制率为59.55%.经统计学处理,CaSKi-R的端粒酶活性较CaSKi和CaSKi-P细胞明显下降(P＜0.01).结论转染抗HPV16E6-Ribozyme的CaSKi-R细胞出现一定程度的生长抑制,端粒酶活性较前明显下降.     

HPV16相关宫颈癌组织中MUC16和E6表达的关系

目的:探讨人乳头瘤病毒(HPV)16相关宫颈癌组织中粘蛋白抗原16(MUC16)与E6表达的关系。方法:以HPV16 E6阳性和阴性的宫颈癌细胞系和宫颈鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织(184例)为研究对象,采用Western blot和免疫组化方法检测HPV16 E6和MUC16的表达。结果:Western blot结果显示:C-33A细胞中HPV16 E6无表达,Ca Ski细胞和Si Ha细胞中可见HPV16 E6表达;C-33A细胞中MUC16的表达低于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(P<0.05),Ca Ski细胞和Si Ha细胞中MUC16的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示:HPV16E6阳性的宫颈鳞癌组织中MUC16的表达高于HPV16 E6阴性的宫颈鳞癌组织(χ2=43.670,P<0.001)。结论:宫颈癌细胞系和鳞癌组织中MUC16与E6表达可能有关。     

HPV16E6和p53在口腔癌中的表达及相关性研究

目的 探讨HPV16E6和抑癌基因p53在口腔癌中的表达,及其与口腔癌临床分期、病理分级的相关性.方法 用免疫组织化学方法检测149例口腔癌、88例口腔癌癌前病变和49例癌周正常组织标本中HPV16E6和p53的表达,统计口腔癌不同临床分期和病理分级中HPV16E6和p53的阳性表达率.结果 口腔癌组织、口腔癌癌前病变组织和口腔癌癌周正常组织中HPV16E6的阳性表达率分别为79.9％ (119/149)、38.6％ (34/88)和2.0％ (1/49),p53的阳性表达率分别为24.2％(36/149)、55.7％(49/88)和91.8％ (45/49).随着临床分期和病理分级的增加,HPV16E6阳性表达率明显增加,而p53阳性表达率却明显减少(P＜0.05).结论 HPV16E6蛋白的表达升高和p53蛋白的表达降低可能会导致口腔癌的发生和发展.检测患者口腔癌组织中HPV16E6和p53的表达可用于评定口腔癌的恶性程度.     

HPV16相关宫颈癌细胞系和组织中E7和DRR1蛋白的表达

目的:研究人乳头瘤病毒16(HPV16)相关宫颈癌细胞系和组织中E7和肾细胞癌下调基因1(DRR1)表达的关系。方法:以HPV16 E7阳性的宫颈癌Ca Ski和Si Ha细胞、HPV16 E7阴性的宫颈癌C-33A细胞及184例宫颈鳞状细胞癌组织为研究对象,采用Western blot方法和免疫组化染色方法检测E7和DRR1蛋白的表达,分析E7与DRR1蛋白表达的关系。结果:Western blot结果显示,C-33A细胞中HPV16 E7无表达,DRR1蛋白的表达显著高于Ca Ski细胞和Si Ha细胞(F=454.982,P<0.001);Ca Ski细胞和Si Ha细胞表达HPV16 E7,二者DRR1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化染色结果显示,HPV16 E7阳性宫颈鳞状细胞癌组织141例,其中DRR1蛋白阳性34例;HPV16 E7阴性宫颈鳞状细胞癌组织43例,其中DRR1蛋白阳性32例;HPV16 E7阳性组织中DRR1蛋白的表达显著低于HPV16 E7阴性组织(χ2=36.250,P<0.001)。结论:DRR1可能是HPV16 E7作用的潜在靶基因。     

子宫颈癌新辅助化疗的疗效

目的：研究宫颈癌新辅助化疗的疗效及与临床资料之间的关系。方法：选择行新辅助化疗的Ib2~IIIa期宫颈癌患者97例,分析化疗后的近期疗效,影响疗效的有关因素和术后病理结果。结果：新辅助化疗的近期有效率为86.6%;与疗效有关的因素为临床分期和病理类型;新辅助化疗后84例患者可以手术,术后病理降级的有17例,术后淋巴结阳性者19例,宫旁浸润者6例;随访中1例患者术后1年内死亡,5例复发,余患者均健在。结论：局部晚期宫颈癌新辅助化疗效果好,新辅助化疗后手术能改善患者预后,提高术后生存率。     

Effects of anti- HPV16E6- ribozyme on phenotype and gene expression of a cervical cancer cell line

Objective To investigate the effects of anti- HPV16E6- ribozyme (HRz) on phenotype and gene expression of a cervical cancer cell line. Methods HRz was designed by computer programs.HRz’s activity was identified by cleavage experiments in vitro.HRz and empty eukaryotic plasmids were transfected into CaSKi cells with lipofectin, then renamed CaSKi- R and CaSKi- P, respectively. The expression of ribozyme in transfected cells was observed by RNA dot blot.The amounts of E6 mRNA in three kinds of cells lines were detected by Northern blot.Cell growth curves and soft agar forming ability were studied.The ability of each cell line to form tumors was assessed in nude mice.Apoptosis rates and expression of c- myc, bcl- 2, p53 and Fas were detected by flow cytometry (FCM).Antigens of tumor cells, HLA- 1, HLA- 2, B7- 1 and B7- 2 were also detected.NK, LAK, and CD3AK cells were induced.Their cytotoxicities were detected in CaSKi- R, CaSKi- P, and CaSKi cells. Results In vitro cleavage reaction demonstrated that HRz could cleave HPV16E6 mRNA in a site- specific manner.HRz could be expressed stably in transfected CaSKi cells.Northern blot analysis showed that E6 mRNA levels were lower in CaSKi- R than in CaSKi.The growth rate of CaSKi- R was slower than those of CaSKi and CaSKi- P.The soft agar- forming rate of CaSKi- R was lower compared with those of CaSKi and CaSKi- P cells.The ability of CaSKi- R to form tumors in nude mice was also poor.The apoptosis rate of CaSKi- R cells was much higher than those of CaSKi and CaSKi- P.HRz could reduce the expression of E6, c- myc and bcl- 2 proteins, and increase the expression of p53 as well.HRz could increase the expression of HLA- 2, B7- 1 and B7- 2 antigens.The cytotoxicity of NK, LAK and CD3AK cells was much higher in CaSKi- R than in CaSKi- P and CaSKi cells.Conclusion HRz not only reverses the malignant phenotype of CaSKi cells partially, but also induces apoptosis in the cells, and increases sensitivity of CaSKi cells to immune cells.     

重庆地区1例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6,E7基因的结构和变异

目的：报告1例重庆地区宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7基因的结构及其变异，方法：应用聚合酶链式反应（PCR）从宫颈癌组织扩增出人乳头瘤病毒16型重庆株E6，E7基因，分子克隆技术进行基因的克隆，测序。结果：成功地扩增出重庆地区宫颈癌人乳头瘤病毒16型株E6，E7基因，并克隆于质粒载体pBKS( )，结论：该例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7与标准株HPV16 E6，E7基因的长度相同，E6基因无变异，但E7基因有两处点突变。