大鼠耳蜗大上皮嵴的分离和鉴定

目的：探讨利用酶消化和机械解剖相结合分离大鼠耳蜗大上皮嵴(GER)的方法。方法：取出生后0～3d的SD大鼠耳蜗基底膜后,将其放人含有嗜热菌蛋白酶和少许DNA酶的D-Hank溶液中,37℃孵箱孵育25min进行酶消化,然后在高倍显微镜下进行显微机械分离;对分离的GER细胞用免疫组织化学和RT-PCR扩增GER细胞特异性表达基因Hesl的方法进行鉴定,并进行GER的原代培养以验证其活性。结果：免疫组织化学染色表明分离的GER细胞是单一的上皮组织;对Hesl基因进行RT-PCR分析表明,分离的GER细胞表达该基因;分离的GER具有活性并可以进行原代培养。结论：利用酶消化和机械解剖相结合的方法可以分离出纯粹的有活性的GER,为进一步建立GER细胞系,进行各种基因转染试验以及耳蜗内的各种基础实验建立细胞模型提供有效的实验手段。     

Ⅱ型胶原酶体外分离并培养成年小鼠血管纹边缘细胞

目的探讨单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外分离并培养成年小鼠耳蜗血管纹边缘细胞(marginal cell,MC)的方法。方法选取6只出生75±3 d的健康C57BL/6J小鼠,显微分离其耳蜗血管纹组织,以Ⅱ型胶原酶原代消化培养边缘细胞。倒置显微镜观察细胞形态,噻唑蓝(MTT)法测细胞生长曲线,透射电镜观察细胞的超微结构,免疫荧光法检测上皮细胞标志物——中间丝角蛋白18(CK18)和耳蜗血管纹的独特标志物KCNQ1的表达,RT-PCR法检测CK18和KCNQ1mRNA的表达。结果接种24～48 h后可见细胞贴壁增殖,形成大小不等的细胞岛,一周后细胞迅速生长,相互融合,紧密连接,形成单层极性上皮层,呈典型的"铺路石"样外观。透射电镜观察可见多角形细胞表面有较多微绒毛,胞浆内线粒体、内质网等细胞器丰富。免疫荧光检测显示CK18和KCNQ1蛋白表达阳性,RT-PCR结果示CK18和KCNQ1mRNA均有表达。结论采用原代消化培养技术可成功建立成年小鼠耳蜗血管纹MC的体外原代培养,为进一步研究成年期MC的功能和某些内耳疾病的发病机制提供了实验基础。     

酶消化分离法原代培养人鼻黏膜上皮细胞的改进

目的：探讨酶消化分离法原代培养人鼻黏膜上皮细胞的实验步骤和技术要点，以提高原代培养成功率，为后续实验提供良好的培养模型。方法：在酶消化分离细胞、无血清培养法的基础上，对取材处理、消化酶应用等步骤进行改进，如翻揭分离获取黏膜层、消化中加入I型DNA酶（DNase type I）、胶原酶消化后含黏膜块的溶液中直接加入胰蛋白酶，以及应用不包被的培养皿培养等。原代培养的鼻黏膜上皮细胞经免疫荧光染色细胞角蛋白（CK）8／18进行鉴定。结果：鼻黏膜原代培养细胞生长良好，6-8d汇合可用于后续实验。CK8／18免疫荧光染色阳性鉴定为上皮源性细胞。结论：酶消化分离细胞、无血清培养法可成功建立人鼻黏膜上皮细胞原代培养模型，对取材处理、酶消化等步骤进行上述改进，可提高原代培养成功率，并获得一定数量级，以及纯度较高和可靠的原代上皮细胞。     

羊水干细胞拟胚体与耳蜗基底膜共培养向神经元分化的可行性

目的探讨人来源的羊水干细胞以拟胚体样结构与小鼠耳蜗基底膜组织共培养,分化为神经元的可行性。方法分离培养人来源的羊水干细胞,悬滴法培养,观察羊水干细胞拟胚体形成情况;免疫荧光检测拟胚体细胞干性标记物的表达;将拟胚体与小鼠基底膜组织共培养,不添加神经生长因子及神经元信号诱导因子,观察拟胚体向神经元分化情况。结果羊水干细胞经悬滴培养可形成拟胚体样结构,表达神经干细胞标记物Sox2、Nestin;与小鼠耳蜗基底膜组织共培养,拟胚体细胞有神经元标记物Tuj1表达,但无神经元形态特征。结论羊水干细胞体外悬滴后可形成形态均一且具有神经干性的拟胚体,与耳蜗基底膜组织共培养,不能诱导拟胚体细胞向形态典型的神经元分化。     

老年大鼠耳蜗毛细胞凋亡的信号通路

目的通过观察耳蜗基底膜毛细胞凋亡相关因子caspase-3、caspase-8和caspase-9表达的变化,揭示老年大鼠耳蜗毛细胞凋亡的信号通路。方法入选Fischer344大鼠27只,青年组12只,3～4月龄;老年组15只,20～27月龄。3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶荧光标记青年大鼠耳蜗各8个,老年大鼠耳蜗各10个。应用电位反应测听仪检测不同频率短纯音(5、10、20和40kHz)诱发的青年和老年大鼠双侧听性脑干诱发电位反应阈值(ABR)。听觉功能测试后,用微量注射器分别将新鲜配制的3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶荧光染色液缓慢注入动物内耳,耳蜗内灌注后1h,动物断头处死。采用细胞核DNA荧光染料碘化丙锭(PI)染色耳蜗基底膜细胞,荧光显微镜下观察不同月龄大鼠耳蜗基底膜毛细胞3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶荧光染色的变化。结果老年大鼠的不同频率听性脑干反应阈值均高于青年对照组(P<0.05)。青年大鼠耳蜗毛细胞核周围未见3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶阳性荧光标记物,老年大鼠耳蜗基底膜以核固缩为特征的凋亡外毛细胞核周围存在caspases-3和caspases-9绿色荧光标记物,未见caspases-8标记物。以核肿胀为特征的坏死外毛细胞核周围未见3种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶阳性荧光标记物。结论老年大鼠耳蜗毛细胞凋亡可能通过caspases-9相关的线粒体信号转导通路而不是cas-pases-8相关的死亡受体通路启动完成。     

大鼠椭圆囊感觉上皮细胞长期培养体系的建立及毛细胞标记物表达的意义

目的：建立椭圆囊感觉上皮细胞（USEC）长期培养体系，为内耳毛细胞再生研究提供稳定的活性细胞。方法：取1d龄wistar大鼠，在显微镜下取出椭圆囊上皮，嗜热菌蛋白酶处理，获得具活性的纯椭圆囊感觉上皮，胰蛋白酶＋胶原酶消化，培养传代，传25代。取第25代USEC在倒置显微镜、透射电镜下对USEC的生长特征、形态结构进行观察；免疫细胞化学检测细胞角蛋白18、波形蛋白、Brn3．a及Calretinin的表达。RT—PCR检测毛细胞的特征性标记物AchRa9、MyosinVIIamRNA的表达。结果：USEC细胞培养达6个月传25代，第25代USEC均呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态，细胞之间连接紧密，形成单层时均呈“铺路石样”外观，可见dome结构。该细胞表达角蛋白18和不表达波形蛋白，微绒毛丰富，细胞间连接紧密，提示其上皮起源。第25代USEC表达毛细胞的特征性标志物Brn3．a、Calretinin及AchRa9、Myosin Ⅶa mRNA，表明长期培养USEC仍具有毛细胞的前体细胞的特性。结论：本实验成功建立了USEC长期培养体系。长期培养的USEC性状未发生明显改变，表达上皮细胞及毛细胞的特征性标志物，具有毛细胞前体细胞的特征。这为毛细胞再生的机制及内耳分子、基因研究提供了稳定的细胞来源。     

大鼠耳蜗胶质细胞的分离培养和纯化北大核心CSCD

目的探讨大鼠耳蜗胶质细胞的体外分离培养和纯化的方法,为进一步研究耳蜗胶质细胞功能提供实验基础。方法分离出生后3天的新生大鼠(18只,36耳)耳蜗轴组织,通过组织酶消化及阿糖胞苷补充法、组织酶消化及免疫磁珠分选法、组织块培养及细胞冷喷注法三种方法(各2只,4耳,均重复三次)进行耳蜗胶质细胞分离、培养和纯化,通过细胞计数、CCK-8检测以及胶质细胞标记物免疫荧光染色计算细胞的产量、活性及纯度。结果组织块培养及细胞冷喷注法获得的耳蜗胶质细胞的产量尽管最低,但其细胞活性最高并优于其它两种方法,且细胞纯度较高,接近组织酶消化及免疫磁珠分选法。结论蜗轴组织块培养及细胞冷喷注法获得的耳蜗胶质细胞活性良好且细胞纯度较高,操作简便且成本低,可作为一种便捷的耳蜗胶质细胞体外培养和纯化方法。     

大鼠椭圆囊再生毛细胞前体细胞来源的初步研究

目的 探讨哺乳动物椭圆囊再生毛细胞前体细胞的可能来源.方法 取出生1天的大鼠的椭圆囊,经嗜热菌蛋白酶(thermolysin)处理,消化法进行原代培养.在倒置显微镜下观察椭圆囊感觉上皮细胞(utricular sensory epichelial cell,USEC)的形态、生长特征;透射电镜观察、免疫细胞化学法检测上皮细胞角蛋白18、波形蛋白等鉴定USEC上皮细胞来源.免疫细胞化学法、RT-PCR技术检测支持细胞标记物p27k1plmRNA及毛细胞的特征性标记物Brn3a、Calretinin及AchRa9、Myosin Ⅶ a mRNA的表达.结果 原代培养的USEC呈扁平、多角形、核大而圆的上皮细胞形态,细胞之间连接紧密,形成单层时呈"铺路石样"外观.可见由数百个USEC包绕液体而成的dome(穹窿样)结构,表达细胞角蛋白,不表达波形蛋白,微绒毛丰富,细胞间连接紧密,提示其上皮来源.原代培养的USEC表达支持细胞标记物p27k1pl mRNA及毛细胞的特征性标志物Brn3a、Calretinin及AchRa9、MyosinⅦa mRNA,表明培养的USEC可能来源于支持细胞并具有毛细胞的特性.结论 原代培养的USEC能产生毛细胞样细胞且表达支持细胞标记物,表明其来源为支持细胞.椭圆囊感觉上皮的支持细胞可能为毛细胞再生的前体细胞之一.     

新生大鼠耳蜗前体细胞的培养及鉴定

目的对新生大鼠耳蜗前体细胞进行分离、培养和鉴定。方法从出生7天的大鼠耳蜗中分离、培养前体细胞,用免疫细胞化学的方法对前体细胞进行鉴定;血清诱导分化后鉴定分化潜能,进一步了解其多向分化特性。结果原代培养的细胞,培养1d后即可见"细胞球"。细胞球内大部分细胞呈nestin、musashi1、pax2和BrdU阳性,表明其具有自我更新及有丝分裂的能力。细胞球经诱导分化14d后,对分化细胞行免疫细胞化学鉴定,发现分化细胞表达毛细胞标志物myosin VIIA和phalloidin,表达成熟神经元标志物NeuN,表达不成熟神经元标志物Tuj1,表达星形胶质细胞标志物GFAP,表达少突胶质细胞标志物galactocerebroside,以及谷氨酸能神经元标志物GluR-1,证明其具有多向分化潜能。结论本实验证明耳蜗前体细胞具有神经干细胞的多向分化潜能,为研究通过基因治疗的方法促进耳蜗神经细胞增殖提供了一种体外模型。     

豚鼠耳蜗外毛细胞的简化分离

目的:为获得能够满足电生理需要的外毛细胞,探讨简单可靠的分离外毛细胞的方法。方法:暴露听泡后去除耳蜗骨壳,将螺旋韧带连同基底膜和蜗轴一起放入酶液消化,减少显微镜下分离基底膜的操作程序,同时避免去除螺旋韧带时部分基底膜片段的丢失。结果:获得较多的保持良好活性的单离外毛细胞,耳大约80%的细胞能保持活性平均约6h。结论:去除骨壳后的残余耳蜗整体消化并适当提高消化液浓度的分离法,操作简单,可以获得能够满足电生理实验需要的较多的单离的耳蜗外毛细胞,有利于内耳研究工作的开展。     

新生大鼠耳蜗增殖细胞的培养鉴定及超微结构观察

目的 研究新生大鼠耳蜗内是否存在增殖细胞,以及该增殖细胞能分化为何种细胞.方法 分离新生SD大鼠耳蜗细胞并进行培养,加入5-溴-2-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2-demoxyuridine,BrdU)检测细胞的增殖状态,通过免疫荧光鉴定细胞球及分化细胞的性质.分离48个耳蜗Corti器,采用数字表格法随机分成4组进行细胞培养:对照组、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)组、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)组和EGF+bFGF组,每组12个,定量计数单个耳蜗培养细胞球的数量,结果进行方差分析.采用透射和扫描电镜观察细胞球的超微结构.结果 耳蜗Corti器细胞培养可见细胞球形成,90.1%球内细胞BrdU表达阳性,且大部分细胞巢蛋白表达阳性.分化细胞表达毛细胞标志物肌球蛋白7A、espin及鬼笔环肽阳性,神经元标志物神经丝蛋白(neurofilament M,NF-M)表达阳性,并且可见肌球蛋白7A和BrdU,espin和BrdU,以及NF-M和BedU双标阳性的分化细胞.对照组平均((-x)±s,以下同)每个耳蜗Corti器的增殖细胞数量为(45.3±23.0)个,EGF组(86.2±34.1)个,bFGF组(96.5±33.6)个,EGF+bFGF组(131.2±47.0)个.除EGF组和bFGF组之间P＞0.05外,其余各组之间P值均＜0.05,差异具有统计学意义.扫描和透射电镜下细胞球内细胞呈圆球形,大小均匀一致,表面具有众多微绒毛.胞质内有丰富的内质网、微管、微丝和线粒体等细胞骨架结构和细胞器,相邻细胞之间可见紧密连接、桥粒与缝隙连接.结论 大鼠耳蜗内存在增殖细胞,可分化为具有纤毛样结构的毛细胞及神经元.EGF和bFGF均可诱导增殖细胞分裂增殖.该增殖细胞的超微结构显示其具有早期幼稚细胞发育的特征.     

胰岛素样生长因子1抑制小鼠耳蜗毛细胞凋亡

目的 利用耳蜗基底膜离体培养技术建立庆大霉素(gentamicin,GM)损伤模型,研究胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对小鼠耳蜗毛细胞(hair cell,HC)凋亡的影响及可能机制.方法 取新生小鼠耳蜗基底膜,在分别含有预先制备的培养液(A组),含有GM 0.5 mmol/L(B组),含有GM 0.5 mmol/L和IGF-1 1 ng/ml(C组),GM 0.5 mmol/L和IGF-1 10 ng/ml(D组),GM 0.5 mmol/L和IGF-1 50 ng/ml(E组),GM0.5 mmol/L和IGF-1 100 ng/ml(F组)的培养液中离体培养后制作耳蜗铺片.利用DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end Iabeling,TUNEL)结合活性半胱氨酸蛋白酶-3抗体为标记物多重荧光免疫组织化学方法,激光共聚焦显微镜下观察各组耳蜗HC的凋亡情况.结果 耳蜗铺片观察显示A组各转及各组顶转未发现TUNEL染色阳性的凋亡HC.C、D、E、F各组耳蜗底转和中转HC的TUNEL染色阳性HC数较B组减少(P＜0.05),其中以D组减少最为明显.活性半胱氨酸蛋白酶-3抗体标记和TUNEL染色阳性的耳蜗HC凋亡的部位不完全重合.结论 GM可诱导离体培养的小鼠耳蜗HC凋亡的发生.应用IGF-1能够通过抑制其凋亡作用,在特定浓度达到最佳效果.半胱氨酸蛋白酶-3活化参与耳蜗HC凋亡过程.     

重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验分析

目的观察重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的情况。方法取新生1～5 d小鼠的耳蜗基底膜,离体培养1 d后,加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d,在荧光显微镜及Confocal显微镜下观察病毒对离体耳蜗基底膜的转染情况。结果耳蜗基底膜离体培养1 d后,在显微镜下观察,可见基底膜贴壁生长良好,外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出;高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构。离体耳蜗基底膜培养组织加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d后,可见重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜及其外周长出的新生上皮细胞和成纤维细胞;在新生小鼠离体耳蜗基底膜上,不仅大上皮嵴细胞区域、小上皮嵴细胞区域的细胞能被高效转染,毛细胞也能被高效转染。结论重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。     

miR-182可以促进耳蜗前体细胞分化为毛细胞

目的探讨miR-182诱导耳蜗前体细胞向毛细胞分化的作用及机制。方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞并用血清诱导分化,BrdU、Nestin免疫荧光染色鉴定细胞自我增殖能力;myosinⅦa和phalloidin免疫荧光染色鉴定其是否具有分化为毛细胞的潜能。分别利用miR-182 mimics和siRNA在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182,然后在细胞诱导分化7天后,用流式细胞仪检测分化细胞中myosinⅦa阳性细胞比例,用Western-blot检测支持细胞标志分子中Sox2的变化。结果使用miR-182 mimics进行过表达后,耳蜗前体细胞分化为myosinⅦa阳性表达的细胞比例显著高于对照组,使用miR-182 siRNA进行低表达后此比例显著低于对照组。Western-blot检测显示,Sox2在miR-182 mimics组较对照组降低,miR-182 siRNA组较对照组增加。结论过表达miRN182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞方向分化,ox2可能是此过程中的靶基因。     

转基因诱导新生大鼠耳蜗大、小上皮嵴细胞分化为毛细胞样细胞实验

目的通过转染Hathl基因诱导大鼠耳蜗大上皮嵴细胞（greater epithelial ridge,GER）和小上皮嵴细胞（1esser epithelial ridge,LER）分化为毛细胞样细胞。方法取出生后第l天的大鼠耳蜗,利用机械分离和酶消化相结合的方法分别分离出纯的GER和LER细胞,并转染Hathl基因,培养后做免疫组化染色观察。结果GER和LER体外培养并转染Hathl基因后,免疫组化检测显示肌球蛋白（myosinVIIa）染色阳性,表达毛细胞的特异标记物。提示GER和LER已分化为毛细胞样细胞。结论GER和LER细胞作为毛细胞前体细胞可以实现体外培养,转染Hathl后．可分化为毛细胞样细胞。     

新生小鼠膜迷路耳蜗外侧壁的组织培养

目的培养小鼠耳蜗螺旋韧带/血管纹来源的细胞,为体外研究提供细胞模型。方法显微解剖新生小鼠耳蜗螺旋韧带/血管纹组织,组织块外植培养,胰蛋白酶消化分离细胞,免疫组织化学染色,原位透射电镜观察鉴别细胞的来源。结果自外植耳蜗螺旋韧带/血管纹组织生长出上皮样细胞及成纤维样细胞。前者呈典型的上皮细胞形态,表达细胞角蛋白,并具血管纹边缘细胞的超微结构特征。后者呈成纤维细胞形态,表达波形蛋白,具有耳蜗螺旋韧带成纤维细胞的超微结构特征。结论培养出小鼠耳蜗血管纹边缘细胞及螺旋韧带成纤维细胞来源的原代上皮细胞及传代成纤维细胞,为体外研究提供了细胞模型及方法。     

前庭学

9的243前盛毛细胞分离法裸讨/师洪/临床耳鼻咽喉科杂志一1994,8(2)一110、1 12 取膝鼠球囊、椭圆囊及壶腹蜡,置于含胶原酶的Hank’s液中消化,再辅以机械分离方法获得单个离体I型和11型前庭毛细胞。工型细胞为烧瓶状,有明显颈部、皮板及纤毛。n型细胞较I型细胞为短,无明显颈部,但有皮板及纤毛。I型细胞与n型细胞数量之比为12:1。离体5小时后仍有35纬的前庭毛细胞具有活性。观察结果表明,应用胶原酶能获得较多具有活性的单个离体前庭毛细胞,为前庭的.生理、病理及病理实验研究提供了细胞模型。图2参8(原提要)95024R前魔感受姗冰冻蚀刻标本制…     

大鼠耳蜗毛细胞前体细胞与耳蜗间质细胞共培养的实验研究

目的探讨耳蜗间质细胞对耳蜗毛细胞前体细胞--大上皮嵴（greater epithelial ridge,GER）细胞的诱导分化作用。方法取出生后第1天大鼠20只,随机分为2组,每组各10只,利用酶消化和机械分离相结合的方法分别分离出纯耳蜗GER细胞和耳蜗间质细胞,并进行体外混合培养及形态学的观测,对共培养10天的标本行抗Calretinin（标记幼稚毛细胞）及抗p27抗体（标记支持细胞）的免疫细胞组织化学染色鉴定。结果混合培养的耳蜗GER细胞和间质细胞易形成片状细胞岛,共培养10天后,有部分细胞表达Calretinin,亦有少数细胞表达p27,但无Calretinin及p27双标记者。结论GER细胞与耳蜗间质细胞共培养,可以诱导GER细胞分化为毛细胞及支持细胞表型。     

豚鼠耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的同时分离法

目的：探讨豚鼠耳蜗外毛细胞（OHC）和Deiters细胞（DC）同时分离的方法。方法：选健康杂色豚鼠，解剖出耳蜗基底膜，采用酶消化后机械分离。结果：可以同时获得一定数量，活性良好，长短不一的OHC和DC。结论：熟悉耳蜗的解剖特性，保持Corti器的完整及掌握机械吹打的力度是同时获取活性良好的OHC和DC的关键。     

大鼠耳蜗大上皮嵴细胞体外培养的实验观察

目的建立大鼠耳蜗大上皮嵴（greater epithelial ridge，GER）细胞体外培养体系，探讨其在离体培养条件下的生物学特性、生长模式及超微结构。方法取生后1d大鼠耳蜗，利用机械分离和酶消化相结合的方法分离出纯GER细胞，分别于无血清和含10％胎牛血清的DMEM培基中进行培养，观察细胞生长特性，并对培养物进行溴脱氧尿苷（BrdU）、鬼笔环肽（phalloidin）、Z01、钙视网膜蛋白（calretinin）及肌球蛋白VIIa（myosin VIIa）免疫组化鉴定及扫描电镜观察。结果GER体外培养细胞呈现典型的上皮样多角形外观，细胞间连接紧密，具有明显的增殖能力，在含血清培养基中易形成贴壁细胞岛，而在无血清培养条件下则易形成悬浮细胞球。GER细胞呈现BrdU、phalloidin以及Z01染色的阳性反应，而calretinin及myosinVIIa则表现为阴性。扫描电镜显示GER细胞表面可见微绒毛和中心体，但未见毛细胞特异性结构纤毛束。结论GER体外培养细胞具有增殖能力，在不同培养条件下可分别呈现贴壁细胞岛及悬浮细胞球生长特性，GER细胞表达上皮细胞来源标记物，但不表达毛细胞特异性标记物。