新型肠道病毒分离株(BJ302)全基因组序列测定及分析

目的 测定并分析新分离肠道病毒基因组序列,从病毒的分子生物学角度研究其分类学位置.方法从1例不明病因的急性肝炎患者粪便标本中提取病毒RNA,以随机引物逆转录PCR法及5'、3'RACE扩增病毒全基因序列.将拼接得到的核苷酸序列及推断的氨基酸序列与GenBank数据库中序列进行比较并建立系统进化树.结果分离病毒基因与肠道病毒76、89型有较高的同源性,尤其是与肠道病毒89型,相应片段的核苷酸序列同源性达83%～94%,推断相应氨基酸序列同源性高达91%～100%,而与其他病毒不存在有意义的同源性;系统进化树分析显示新分离肠道病毒株属于肠道病毒属中新型肠道病毒89型一簇.结论新分离病毒属肠道病毒89型,可能为89型的一个新亚型.     

我国分离的两株病毒为重组甲病毒

目的 明确我国分离的XJ－90260和XJ－91006病毒的分类地位、种系发生和遗传型。方法 特异引物逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增两株病毒的NSP4、E1基因区和3′端非编码区,测序,进行核苷酸序列同源性比较和3′端非编码区核苷酸序列分析,并结合同属其他病毒这些基因区的核苷酸序列进行种系进化分析。结果 两株病毒的核苷酸序列同源性为100％,与西方马脑炎病毒的核种酸序列同源性最高,具有西方马脑炎病毒3′端非编码区结构特征,其NSP4基因区与东方马脑炎病毒同源,E1基因区与辛德毕斯病毒同源,两株病毒均位于西方马脑炎病毒B组,与西方马脑炎病毒俄罗斯分离株进化关系最近。结论 我国分离的XJ－90260和91006病毒属于西方马脑炎病毒同一遗传型,均为重组甲病毒。     

心肌炎和克山病患者分离的肠道病毒核酸序列分析

目的 分析自心肌炎和克山病患者分离的肠道病毒的核酸序列,探讨病毒病因的分子基因。方法 使用肠道病毒特异引物对从心肌炎和克山病患者分离的肠道病毒RNA进行RT－PCR扩增,PCR产物经纯经后分别经不同的引物正反向直接核酸循环测序,并应用SeqEd和DNA软件及AssemblyLIGN软件对测序结果进行分析。结果 确定7株病毒5′端从核苷酸位点40到750之间710bp基因序列;序列分析结果发现,尽管为同血清型病毒,但其5′非编码区基因变异率仍在15％左右,而血清型为柯萨奇B5病毒则高达34．08％,与肠道病毒各血清型之间5′端非编码区基因变异率无明显差异;对血清型为CVB3的两分离株病毒5′端基因特殊位点分析,发现与CVB3标准株（Nancy株）比较234位由T→C、690位由C→A。结论 确定了所分离到的一些肠道病毒5′端非编码区序列;肠道病毒5′端非编码区基因与血清型关系不大;CVB3分离株5′端基因特殊位点变异与致病的关系值得进一步探讨。     

肠道病毒71型中国分离株基因组3区的分析

目的 测定我国分离的肠道病毒71型(EV71)SHZH98株3C基因的核苷酸序列，进行遗传进化途径的分析。方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增我国分离的EV71-SHZH98株3C基因cDNA，测定PCR产物的核苷酸序列。结果 SHZH98株3C基因为549bp，和已发表的肠道病毒71型3C基因序列比较，SHZH98株与MS株同源性为78．7％，与BrCr株的同源性为76．7％，与台湾分离株POLY、NCKU、TW2086、TW2272株的同源性分别为74．0％、73．8％、71．9％、69．8％。由其核苷酸序列推导的氨基酸序列同源性比较显示与MS的同源性为93．45％，与BrCr、POLY、NCKU、TW2086、TW2272株的同源性分别为89．1％、90．7％、90．2％、84．2％、82．5％。遗传进化分析显示SHZH98株3C片段在亲缘关系上与Coxsackievirus A16 G-10株及欧美分离株MS、BrCr株较密切，而与台湾分离株相差较远。结论 推测EV71病毒中国分离株非结构蛋白的进化途径可能与台湾流行株不同。     

我国广东、福建地区2000～2001年手足口病肠道病毒71型分离株的种系进化分析

目的 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测我国广东、福建地区2000-2001年手足口病(HFMD)散发病例中的肠道病毒71型(EV71)，进而通过扩增VP1节段的核苷酸序列，进行毒株的种系进化分析。方法以肠道病毒特异引物对EV-1、EV-2进行RT-PCR，经琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的标本，进一步用EV71特异引物对159S、162A进行RT-PCR，扩增的VP1节段经纯化后与测序载体pGEM-T连接，转化大肠埃希菌DH5a，筛选后测序。所得序列与我国深圳、上海、武汉地区的EV71流行株，中国台湾1998年4例HFMD暴发分离的EV71毒株，及来自美国、日本、匈牙利等国家地区的EV71毒株的核苷酸序列，用ClustalX1．8和PHYuP3．5进行比对分析，构建种系进化树。结果 25份标本检测EV71的阳性率为20％，所得序列经种系进化分析，与肠道病毒71型的其他毒株同源，与深圳1998年HFMD散发分离的EV71毒株同源性为94％，与上海2000年HFMD暴发分离株同源性为94％～96％，与武汉1987年HFMD病例中分离的毒株同源性为91％，而与国外EV71毒株同源性仅为82％～84％。结论 EV71是我国南方地区HFMD的主要病原之一；我国大陆地区的EV71毒株在种系进化上有较高的同源性；与我国台湾地区大部分分离株亦有90％～91％的核苷酸同源性，但大陆EV71引起的HFMD发病症状较轻，有别于1998年台湾地区EV71的大暴发。     

RT-PCR扩增汉滩病毒及其核苷酸序列的发生树分析

目的：用RT－PCR方法扩增肾综合征出血热病人血样品的汉滩病毒RNA，对扩增产物进行测序并分析汉滩病毒基因组的变异，方法：用引物PⅠ/PⅡ对22例血样品中的汉滩病毒RNA进行第一次PCR扩增，PⅠ/PⅡ扩增样品有再PⅠ1/PⅡ2引物进行槽式RT－PCR扩增，将扩增效果良好的PCR产物进行测序，对测序结果用生物化学软件进行同源性比较和进化树分析，其中HV226样品用引物P1／P2进行RT－PCR扩增。结果：22例肾综合征病人血样品用PⅠ/PⅡ和P1／P2引物扩增有19例阳性，其中编号W613、W1141样品用PⅠ1／PⅡ2进行槽式增后对其扩增产物直接进行测序。HV226号样品用引物P1／P2进行扩增后，其扩增物也直接进行测序，对该3株序列测定结果进行比较分析发现，编号W613、W1141样品核苷酸序列与HV114株的同源性为84％，而与HTN76－118株的同源性为99％，HV226号样品与HV114有95％的同源性，而与HTN76－118有82％的同源性。进化树分析表明，W613，W1141与HTN76－118株立同一分枝，而HV226与HV114、A9株处于同一分枝。结论：湖北地区汉滩病毒至少存在2个亚型，其中W613、W1141与HTN76－118的核苷酸序列高度同源，属于同一亚型，而HV226与HV114属于另一亚型。     

应用随机PCR方法鉴定一株肠道病毒

目的 从基因水平对一肠道病毒分离株进行分析鉴定,方法 提取病毒RNA,以锚定随机引物反转录合成双链cDNA,用锚定特异引物进行随机扩增,扩增产物进行克隆,测序和序列分析。结果 随机扩增的病毒基因在电泳上呈典型的smear带型;11个随机克隆经GenBank检索,与肠道病毒成员具有最高的同源性且同源率超无穷大0%;11个克隆随机分布于病毒的基因组中,排定后的序列形成4个毗连序列群,共计2261个碱基,涵盖病毒基因组的30%;部分序列与柯萨奇病毒B6型氨基酸同源率达97.3%,参照测定序列合成的引物能够特异性地扩增病毒基因。结论 经序列分析证实小RNA病毒XJ90株为肠道病毒科成员。     

汉坦病毒R36株的基因分型研究

采用汉坦病毒Ｍ片段特异性核苷酸分型引物，对Ｒ３６等７株汉坦病毒进行反转录和聚合酶链式反应扩增鉴定，结果Ｒ３６株仅能被Ⅰ型分型引物扩增出特异性片段，而不能被Ⅱ型引物扩增；ＰＣＲ产物的序列分析结果表明，Ｒ３６与ＨＴＮ型病毒７６－１１８株的同源性为７８．４％，与ＳＥＯ型病毒Ｒ２２株的同源性为６８．１％。文中对Ｒ３６与汉坦病毒其它毒株的核苷酸同源性进行了配对比较。该项研究为从核苷酸水平对Ｒ３６株的分型，提供了科学依据。     

新分离的无乳鼠神经毒力的登革2型病毒福建株基因组结构特征的研究

目的 测定对乳鼠不致病登革2型病毒福建株（DEN2－FJ11）全基因组序列，探讨其基因组结构与功能关系。方法 采用RT－PCR和5′、3′端RACE方法测定病毒基因组的全序列，并运用DNASTAR软件的Clustal法将该毒株的序列与其它6株登革2型病毒进行比较，分析其进化关系。结果 DEN2－FJ11株基因组全长10723个核苷酸，含有1个单一的读码框架，编码3391个氨基酸。5′、3′端非编码区（NCR）长度分别为96和454个核苷酸。DEN2－FJ11与同时分离的对乳鼠致病的FJ10株之共有32个核苷酸不同及13个氨基酸的变化，其中8个氨基酸是其极性或电荷的改变。3′端非编码区134位的单个核苷酸变化导致其二级结构改变。DEN2－FJ11与FJ10株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7%和99.6%，这2株病毒与印度尼西亚株亲缘关系最近，同为Ⅳ基因型。结论 DEN2－FJ11株基因组与FJ10株及其它登革2型病毒株类似。位于病毒编码区的8个氨基酸差异及3′端非编码区134位的核苷酸可能与病毒的乳鼠神经毒力有关。     

戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列鉴定及基因型分型

目的　检测戊型肝炎病毒 (HEV)摩洛哥株非编码区 (UTR)序列 ,探讨HEV非编码区序列能否作为其基因型分型的依据。方法　使用基于RNA连接酶的cDNA末端快速扩增法 (RLM RACE)扩增HEV摩洛哥株 5′和 3′端片段并测序。所得序列使用LASERGENE和PHYLIP软件包与其他 2 9株HEV序列比较。结果　只有基于甲基化帽子结构的RLM RACE扩增出了 5′端片段。HEV摩洛哥株 5′端UTR有 2 6个核苷酸 ,3′端polyA之前有 6 5个核苷酸。基于 3′端UTR序列的进化树与基于全基因序列的进化树不全相同。HEV 3′端至少需要 10 0个左右核苷酸长的序列才可进行HEV基因型分型。结论　HEV摩洛哥株 5′端有甲基化帽子结构。HEV 3′端UTR序列不能完全代替全基因组序列进行基因型分型。部分序列替代全基因组进行基因型分型时需要考虑其部位和长度因素。     

Purification of full-length enterovirus cDNA by solid phase hybridization capture facilitates amplification of complete genomes

The aim of the study was to develop a method for the selective purification of full-length enterovirus single strand (ss) cDNA for subsequent amplification of complete enterovirus genomes by long distance PCR. As a model system we have used the prototype strain of echovirus 5 (EV5). Due to inefficient first strand cDNA synthesis using EV5 RNA as template, only a few molecules of EV5 sscDNA were completely reverse transcribed and no amplification products were observed when long distance polymerase chain reaction (LD-PCR) was used for amplification of complete EV5 genomes. To purify the complete EV5 cDNA present, an oligonucleotide, derived from the conserved 5' end of an enterovirus genome, was immobilized on paramagnetic beads and complete EV5 sscDNA was captured and purified from the less than full-length cDNAs. LD-PCR using the purified EV5 cDNA resulted in amplification of complete EV5 genomes. Transfection of the EV5 RNA transcribed from these uncloned amplicons resulted in production of replicating viruses. This demonstrates that solid phase hybridization capture of sscDNA is an efficient method that can be used for enrichment and purification of full-length enterovirus sscDNAs.     

Characterisation of the putative nucleoprotein gene of infectious salmon anaemia virus (ISAV)

A gene encoding the putative nucleoprotein (NP) of infectious salmon anaemia virus (ISAV), a commercially important salmonid Orthomyxovirus, has been identified. cDNA obtained from a subtractive cDNA library bound specifically to RNA extracted from ISAV-infected SHK-1 cell cultures. The 5' and 3' ends of the gene were amplified using RACE PCR and a full length open reading frame (ORF) of 1851 nt identified encoding a predicted protein of 616 amino acids. No significant homology of this sequence with any other orthomyxovirus nucleoprotein was identifiable using BLAST or FASTA-based database searches. The ISAV-protein was however identified as a nucleoprotein based on its characteristic amino-acid composition. Furthermore the conserved sequence 5' GCAAAGA 3' was identified preceding the ORF, as has been identified in all other ISAV-genes characterised to date.     

2008-2009年北京分离的肠道病毒71型基因组3'末端序列分析

目的 了解2008-2009年北京分离的肠道病毒71型(EV71)基因组3'末端的基因特征(未包括多聚腺苷尾),探讨是否与病毒的致病性有关.方法 于2008-2009年手足口病流行期间采集来首都儿科研究所附属儿童医院就诊的普通手足口病患儿和合并重症神经系统并发症患儿的咽/鼻拭子或疱疹液标本.将标本接种Vero细胞进行肠道病毒分离,同时设计肠道病毒通用引物、EV71和柯萨奇病毒A组16型(CA16)特异性引物通过巢式RT-PCR对分离到的肠道病毒进行型别鉴定.对引起不同临床类型感染的10株EV71分离株的基因组3'末端进行序列测定和分析.结果 10株EV71的3'末端均包含1386 nt的3D、终止密码子TGA和81 nt的3'UTR,由3D核苷酸序列所推导的3D蛋白含462个氨基酸.10株EV71的3D和3'UTR核苷酸同源性分别为95.8%～99.6%和96.3%～100%,重症来源的4株毒株中有3株在3Dpol第140位和第263位同时出现了相同的氨基酸变异(R140K和I263V).10株EV71的3D与C4亚型代表株具有最高的核苷酸和氨基酸同源性,分别为92.7%～94.2%和96.8%～97.6%;在3'UTR与CA16/G10具有最高的核苷酸同源性(88.9%～91.4%).3D区的遗传进化分析表明10株EV71在亲缘关系上与C4亚型最密切,与CA16/G10较密切,而与EV71其他基因型和亚型较疏远.结论 基因组3'末端在EV71进化中可能有一定的作用.     

登革2型病毒04株5‘和3’末端的序列分析

目的 观察登革２型病毒０４株（Ｄ２－０４）基因组５’和３’末端序列。方法 从Ｄ２－０４感染的Ｃ６／３６细胞中提取总ＲＮＡ,以该ＲＮＡ为模板,利用ＲＡＣＥ法,分别扩增Ｄ２－０４株的５’和３’末端ｃＤＮＡ片段。将其分别与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接得到含有５’端５３５ｂｐ和３’端５０３ｂｐ ｃＤＮＡ的重组质粒,并测定上述ｃＤＮＡ插入片段的序列。将Ｄ２－０４的５’和３’端非编码区的核苷酸序列与其它登芏２型毒株进     

Rabbit hemorrhagic disease virus--molecular cloning and nucleotide sequencing of a calicivirus genome.

The RNA genome of rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) was molecularly cloned. The 5' terminal sequence of the genomic RNA was determined after PCR amplification of a G-tailed first strand cDNA template. The cloned cDNA allowed determination of the first complete caliciviral sequence encompassing 7437 nucleotides without poly(A) tail. The RHDV genome contains one long open reading frame of 2344 codons which in the 5' region encodes the nonstructural proteins. Sequence comparison studies revealed significant homology between nonstructural proteins of the feline calicivirus (FCV) and RHDV. In analogy to FCV the deduced RHDV amino acid sequence contains a picornavirus 2C-like sequence, a hypothesized cysteine protease motif, and the conserved polymerase residues GDD. For the protein region containing the GDD motif, alignments of sequences from different viruses including the putative caliciviruses hepatitis E virus and Norwalk virus were performed; concerning the classification of the latter two viruses, a final judgement was not possible. Bacterial expression of sequences derived from the 3' part of the genomic RHDV RNA showed that this region codes for the viral capsid protein.     

肠道病毒71型的全长cDNA感染性克隆的构建与鉴定

目的构建一株肠道病毒71型的全长cDNA克隆并验证感染性。方法用长片段高保真RT-PCR方法扩增肠道病毒71型87-2008 Xi’an株的cDNA,装入pBR322载体。将该克隆线性化,体外转录后转染RD细胞后,通过观察CPE及RT-PCR验证其感染性。随后利用空斑法测定拯救病毒的一步生长曲线。结果成功构建了肠道病毒71型87-2008 Xi’an株的全长cDNA克隆;体外转录及转染RD细胞60 h后可观察到明显的CPE现象;RT-PCR在转染RD细胞中检测到病毒的存在;成功利用空斑法测定了拯救病毒的一步生长曲线,最大滴度达到2×107pfu/mL。结论成功构建了肠道病毒71型87-2008 Xi’an株的全长cDNA克隆并验证了其感染性,同时测定了拯救病毒的一步生长曲线,与野生型病毒相近。