体外肝细胞模型在毒理学中的应用

尽管整体动物在毒性评价时 ,是不可缺少的 ,但由于动物种类之间存在着种族差异 ,即动物与人之间存在着差异 ,使一些研究结果难以准确地推导到人。除此外 ,从伦理学和减低毒性研究的成本角度出发 ,也应尽量减少动物的使用。近些年来 ,越来越重视体外实验方法及其对体内过程的推导。目前 ,肝细胞体外模型的使用非常广泛 ,特别是离体肝细胞模型更为突出 ,从外源性化合物的毒性筛选、危险性评价到肝损伤机制的研究都广泛地应用到离体肝细胞模型。肝脏含有多种类型细胞 ,如肝细胞、孔状内皮细胞、枯否氏细胞、卫星贮备细胞及脂细胞。这些肝细胞占…     

加味茵陈汤含药血清制备及其对体外肝细胞损伤模型的作用

目的：探索加味茵陈汤含药血清的制备方法及其对体外培养大鼠肝细胞损伤模型的作用。方法：制备加味茵陈汤（茵陈、栀子、大黄、三七、丹参、赤芍、生地、丹皮、白芍、柴胡）汤剂（2 g生药/ml）;大鼠中药灌胃（30 g/kg,2次/d,连续3 d）制备药物血清;改进Seglen胶原酶原位灌注分离大鼠肝细胞,培养体系中加入D-氨基半乳糖（25μg/ml）诱导肝细胞损伤模型,以不同浓度（5%、10%1、5%）加入药物血清培养24 h,于培养1、36、1、2和24 h取上清液测定ALT、AST和LDH,同步测定肝细胞的MTT反应,并于倒置相差显微镜下观察肝细胞形态变化。结果：从各时间点观察,随含中药血清浓度的增加,肝细胞培养上清液ALT、AST、LDH水平逐渐下降,10%药物血清与15%药物血清剂量组之间在各时间点比较无统计学差异（P〉0.05）,其余各组比较统计学差异均有显著性（P〈0.05）,培养肝细胞增殖活性则呈升高趋势。结论：大鼠的含中药血清可以降低肝细胞损伤模型AST、ALT及LDH等指标,增加细胞活性指标,随浓度增加而作用增强。     

大鼠原代肝细胞分离培养的实验研究

目的:探讨胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞及培养的可行性.方法:取10只SD大鼠,按照改良Seglen原位两步胶原酶灌流法分离培养原代肝细胞.以SD大鼠作为肝细胞供体,采用Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注,下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离肝细胞,经200目筛过滤,滤液以200 r/min离心3～5 min,重复3次,纯化肝细胞.台盼蓝拒染实验检测分离细胞活性.将10只SD大鼠分离得到的肝细胞混合,稀释50倍后接种于包被有鼠尾胶原的培养皿或培养板中,倒置显微镜下观察分离肝细胞的形态特征,糖原染色法(PAS法)鉴定分离肝细胞,MTT法测定肝细胞在培养不同时期的增殖情况.结果:平均每只大鼠肝脏分离获得(1.8±0.14) ×108/mL肝细胞,细胞活率＞85％.肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS染色后被染成红色.MTT实验结果表明在培养的第八天肝细胞增殖达到峰值,培养的第九天细胞活力开始下降.结论:采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种简单、高效的获得肝细胞的方法.     

微载体和EGF在大鼠肝细胞体外培养中的作用

目的：寻找一种肝细胞在体外长期培养的方法。方法：在被覆poly-HEMA的培养瓶中进行肝细胞微载体悬浮培养，同时加入一定量的EGF，观察其对肝细胞的白蛋白。胆固醇合成分泌的影响。用倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态。结果：肝细胞在微载体和EGF的作用下能够存活1个月左右。同时保持白蛋白和胆固醇的合成分泌功能约12天。结论：EGF能增强肝细胞的生理功能，并延长其离体生存时间。微载体肝细胞数量大，功能强，便于移动，可用于肝病的研究与治疗。特别适用于人工肝。     

体外肝细胞的制备及在药物开发中的应用

体外肝细胞模型(主要是原代肝细胞培养)作为一种强有力的体外研究体系被广泛应用于化学异物的肝毒性研究.由于肝细胞具有Ⅰ相、Ⅱ相药物代谢酶和药物转运载体.肝细胞被应用于药代动力学领域的研究,如:动力学参数、清除率、种属间比较、酶抑制和诱导效应、药物转运载体、药物一药物相互作用等.体外肝细胞模型在毒理学领域也有广泛的应用,如:细胞毒性和基因毒性物质的筛选、化学保护剂的评价、特异性肝损伤及相关生化机制的测定等.到目前为止,体外肝细胞模型已在基础性研究和新药早期筛选中,得、到广泛应用.     

荔枝核总黄酮对肝纤维化模型大鼠肝细胞损伤的改善作用

目的:研究荔枝核总黄酮(TFL)对肝纤维化模型大鼠肝细胞损伤的改善作用。方法:大鼠每周前3天ip给予二甲基亚硝胺(DMN),每天1次,连续30 d以复制肝细胞损伤模型。60只大鼠随机均分为正常对照(等容生理盐水)组、模型(等容生理盐水)与TFL高、低剂量(200、100 mg/kg)组,除正常对照组外其他各组复制模型的同时ig给药,每天1次,连续45 d。采用HE染色,显微镜下观察大鼠肝细胞并分析肝组织病理分期(S1~S4);采用Masson染色与免疫组化染色,显微镜下观察大鼠肝细胞并统计肝组织纤维化程度与Bcl-2、Bax表达水平;检测大鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性。结果:模型组大鼠肝细胞病理分期以S3、S4期为主,TFL高、低剂量组以S1、S2期为主。与正常对照组比较,模型组大鼠肝组织纤维化程度升高,Bcl-2、Bax表达增强,血清中AST、ALT活性增强;与模型组比较,TFL高、低剂量组大鼠肝组织纤维化程度降低,Bcl-2表达增强,Bax表达减弱,血清中AST、ALT活性减弱;以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:TFL对肝纤维化模型大鼠肝细胞损伤具有一定改善作用,其机制可能与上调Bcl-2、下调Bax表达有关。     

氧自由基与肝细胞损伤

在各种原因所致的肝细胞初始和后续损伤过程中,氧自由基(OFR)起了非常重要作用.肝细胞在缺血再灌注时,OFR及其诱发的脂质过氧化产物(LPO)可引起激烈的链式反应,产生几十种毒性分子和活性基因,再次诱发生成更多的OFR,继而加速加重肝细胞膜、细胞器、蛋白质以及DNA的损伤[1-4].OFR致肝细胞损伤的病理生理过程及其致病机理目前尚未完全清楚,清除及拮抗OFR是在各种肝病治疗中不可或缺的手段之一[1、4、5].本文就近年有关OFR致肝细胞损伤的分子生物学方面研究进展作一简述.     

三硝基甲苯在大鼠肝细胞核内的还原活化及对DNA的损伤

三硝基甲苯(TNT)是制造炸药的重要原科,可致肝、眼晶体及血液等方面的损害。江泉观等研究证实,TNT可在大鼠肝脏的微粒体和线粒体部分还原活化。本研究观察了TNT在大鼠肝细胞核内还原活化及其对DNA的损伤,以便为TNT的致畸作用机理提供资科。     

黄芪总提物对体外肝细胞损伤的保护作用

目的研究黄芪总提物 (TEA)对体外肝细胞损伤的保护作用及其机理。方法采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养 ,用CCl4 和H2O2 体外分别诱导肝细胞损伤 ,检测肝细胞丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽 (GSH)含量和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSHpx)活性以及培养上清液中天门冬氨酸转换酶 (AST)和/或丙氨酸氨基转换酶 (ALT)水平。结果 (1)TEA(5～80mg·L-1)可明显降低或恢复由CCl4 升高的肝细胞MDA含量及肝细胞培养上清液中AST水平 ,还可使CCl4 降低的肝细胞GSH含量和GSHpx活性升高或恢复 ;(2)TEA(5～80mg·L-1)可使H2O2升高的肝细胞培养上清液中ALT水平和肝细胞MDA含量明显降低或恢复 ,还可使H2O2降低的肝细胞GHS含量和GSHpx活性明显升高或恢复。结论提示TEA对体外肝细胞损伤有直接保护作用 ,该作用可能与其抗氧化作用有关     

齐墩果酸抗环磷酰胺所致大鼠肝细胞损伤作用

目的研究齐墩果酸（OA）对环磷酰胺所致大鼠肝细胞损伤的保护作用。方法分离大鼠肝细胞，进行原代培养。检测实验大鼠肝细胞上清液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）和肝细胞MTT值。结果环磷酰胺可使肝细胞上清液ALT、AST及LDH活力升高，肝细胞MTT值减小，齐墩果酸能抑制上述变化。结论齐墩果酸可抗环磷酰胺所致肝细胞损伤。     

体外模型在中药代谢研究中的应用

体内代谢研究对阐明中药药效物质基础及作用机制有重要意义。体外模型由于其替代、简化和精准的特点,已成为中药体内代谢研究的重要手段之一。综述药物体内过程研究中常用的体外模型及其特点,并总结其在中药代谢研究中的应用概况,以期为中药成分代谢研究提供理论和方法学参考。     

In Vitro/in Vivo Models for Peptide Oral Absorption: Comparison of Caco-2 Cell Permeability with Rat Intestinal Absorption of Renin Inhibitory Peptides

Pharmaceutical Research -     

酢浆草体外抗炎抗氧化检测方法的建立和优化

目的优化和建立酢浆草体外抗炎抗氧化活性的检测方法。方法建立抗氧化、蛋白酶活性抑制和蛋白变性抑制活性的检测方法。比较醇提水沉法和水提醇沉法、不同保存条件下药物的活性。结果优化检测方法后,不同浓度酢浆草样品的检测结果具有高度相关性,表明检测方法高度稳定且准确可靠。经醇提水沉法和水提醇沉法后,酢浆草的抗氧化活性为100%,蛋白变性抑制活性为90%,酶活性抑制活性为50%,两者出峰位置基本一致。醇提水沉法更易快速获得澄清的提取溶液。室温和4℃冷藏时,蛋白变性抑制成分第3天时均下降40%,第7天时下降至无活性;酶活性抑制成分在冷藏时下降比室温条件慢,在第7天时分别下降30%和60%;抗氧化成分在2种保存条件下均有较高活性。结论所建立的方法可用于体外检测酢浆草的抗炎活性。     

不同原代培养方法培养人牙髓细胞的研究

目的：比较并建立一种操作简单方便的人牙髓细胞原代培养方法。方法：选择因正畸拔除的完整无龋双尖牙,无菌条件下取出牙髓,分别采用组织块法、酶消化法和改良组织块法进行人牙髓细胞的体外原代培养,比较观察三种不同培养方法的成活率、细胞形态和数量,测定生长曲线并进行细胞来源鉴定。结果：三种方法均可从人牙髓组织分离培养获得外胚间充质来源的牙髓细胞,呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。组织块法耗时较长,培养成功率26.7%;酶消化法培养成活率较低,且细胞数量较少,培养成功率仅为13.3%;在改良组织块法中未发现有漂浮的组织块,培养成活率较高为80%。结论：改良组织块法解决了传统组织块法中组织块难以贴壁的问题,简化了操作步骤并具有较高的成功率,是一种科学可行的人牙髓细胞原代培养方法。     

急性肝损伤动物模型的建立

目的：以对乙酰氨基酚、四氯化碳、氨基半乳糖为肝毒剂,建立急性肝损伤动物模型。方法：分别测定不同剂量对乙酰氨基酚、四氯化碳、氨基半乳糖所致急性肝损伤模型小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水丰。结果：剂量为100mg·kg^-1的对乙酰氨基酚、浓度为0．05％～1．0％四氯化碳及剂量600,800mg·kg^-1的氨基半乳糖造模后均能明显升高小鼠血清ALT水平。结论：对乙酰氨基酚、四氯化碳、氨基半乳糖造模可用于保肝药的筛选与评价。     

Hepatocyte growth factor in lung repair and pulmonary fibrosis

Pulmonary remodeling is characterized by the permanent and progressive loss of the normal alveolar architecture, especially the loss of alveolar epithelial and endothelial cells, persistent proliferation of activated fibroblasts, or myofibroblasts, and alteration of extracellular matrix. Hepatocyte growth factor (HGF) is a pleiotropic factor, which induces cellular motility, survival, proliferation, and morphogenesis, depending upon the cell type. In the adult, HGF has been demonstrated to play a critical role in tissue repair, including in the lung. Administration of HGF protein or ectopic expression of HGF has been demonstrated in animal models of pulmonary fibrosis to induce normal tissue repair and to prevent fibrotic remodeling. HGF-induced inhibition of fibrotic remodeling may occur via multiple direct and indirect mechanisms including the induction of cell survival and proliferation of pulmonary epithelial and endothelial cells, and the reduction of myofibroblast accumulation.     

人表皮干细胞体外分离和培养的研究

目的建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法。方法用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞,并以人成纤维细胞条件培养基为基础制备表皮干细胞培养液,用以人表皮干细胞(Ⅳ型胶原快速粘附法富集分离)的体外培养,通过检测β1整合素和角蛋白19的表达水平及其克隆形成率和克隆维持时间对其进行鉴定,角朊细胞作对照。结果表皮干细胞体外培养,可见细胞呈克隆样生长、β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色呈阳性,且其克隆形成率和克隆维持时间分别为(17.04±1.01%)和15～18d,明显高于对照组的(8.72±0.73%)和9～10d(P<0.01)。结论应用Ⅳ型胶原快速粘附法及人成纤维细胞条件培养基,对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养,为表皮干细胞体外的大量扩增奠定了基础。     

三种黑素瘤动物模型的建立

目的：建立黑素瘤动物模型，用于抗黑素瘤药物的疗效评价。方法：分别通过皮下、静脉和腹腔注射方式，将B16F10黑素瘤细胞接种于小鼠体内，建立3种黑素瘤及其肺转移小鼠模型，并以达卡巴嗪作为试药，考察其对这3种模型小鼠的作用。结果：成功建立了小鼠皮下、肺转移及腹腔黑素瘤模型。达卡巴嗪对3种模型均有明显的治疗作用。结论：这3种黑素瘤动物模型可综合用于新药的临床前评价。     

格列美脲片溶出度测定及对其体内外相关性考察

目的 建立格列美脲片体内外相关的溶出度测定方法.方法 采用桨法及流通池法,进行体外溶出试验,计算平均累积溶出度,并与体内吸收分数线性拟合;用相似因子(f2)评价7个厂家格列美脲片溶出度曲线的相似性.结果 传统溶出方法测定格列美脲片在pH6.8条件下区分度较强,但体内外相关性较差;建立的流通池测定体外累积溶出量与体内吸收...