HBV转录激活蛋白HBx、MHBs^178 MHBs^t155真核重组载体构建

目的 分别构建人乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白、羧基端截断的中分子表面蛋白MHBs^178、MHBs^t155编码基因的真核重组表达载体，以便进一步研究其转录激活功能及对宿主细胞信号传导通路的影响。方法 设计合成3对寡核苷酸引物，以adr亚型HBV质粒pHBV DNA为模板，采用PCR法分别扩增HBVX基因、MHBs^178和MHBs^t155编码基因片段；用HindⅢ，Kpn Ⅰ双酶切HBV X基因；用HindⅢ和Barn HⅠ双酶切MHBs^178与MHBs^t155编码基因片段后，分别定向插入到真核表达载体pcDNA3．1相应酶切位点，转化宿主菌JM109，提取质粒，分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果 酶切重组体显示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论 成功构建了HBV X基因、羧基端截断的HBV中分子表面蛋白MHBs^178、MHBs^t155编码基因的真核重组表达载体，为进一步研究HBV转录激活蛋白HBx、MHBs^178 MHBs^t155对宿主细胞信号转导通路的影响奠定基础。     

HBV X基因真核表达载体的构建研究

目的：构建HBVX基因与pCDNA3．1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBVX基因的功能奠定基础。方法：设计并合成HBVX基因的引物,从HBVDNA阳性的血清中,PCR扩增得到HBVX基因全序列,将其连接到真核表达载体pCDNA3．1上后,酶切图谱分析PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体,为下一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

HBV大分子表面蛋白基因真核重组载体的构建与鉴定

目的构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)大分子表面蛋白基因的重组载体，以便进一步研究其基因免疫以及对宿主细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38等信号传导通路的影响。方法设计合成2对寡核苷酸引物，以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板，采用PCR法分别扩增HBV大分子表面蛋白基因(preS1／S2／S基因)片段；用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后，连接到质粒pcDNA3．1( )相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论成功构建了HBV大分子表面蛋白基因的重组载体。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列;将X基因连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

miR-181a真核表达载体的构建及鉴定

目的: 构建miR-181a真核表达载体,获得食管癌细胞TE11在其中稳定表达的细胞系,为研究miR-181a的功能以及其在食管癌细胞TE11中的作用机理奠定基础。方法: 根据miR-181a成熟序列在基因组中的位置及其上下游250个碱基序列,以293T细胞基因组DNA为模板设计PCR引物,扩增包含miR-181a前体的序列,连接到线性化的pMD18-T Simple载体中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后亚克隆到pcDNA3. 1 ( + )中,并对重组质粒进行双酶切和测序分析;鉴定完全正确的重组质粒转染食管癌细胞TE11,用G418 ( 350 mg/L )筛选4周获得miR-181a稳定表达细胞系TE11-miR-181a,提取TE11-miR-181a细胞总RNA,用real-time PCR鉴定pcDNA3. 1 ( + )-miR-181a可在真核细胞中稳定过表达。结果: 成功构建了miR-181a的真核表达载体,并获得了在TE11细胞中稳定表达重组质粒的细胞系TE11-miR-181a。结论: miR-181a真核表达载体在食管癌细胞TE11中稳定高表达,为进一步研究miR-181a在食管癌细胞TE11中的功能及基因调控机制奠定了基础。     

HBV基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

目的：研究HBVT1862变异的生物学意义。方法：采用分子生物学方法,构建HBV前C/C基因EB病毒真核表达载体,利用体外定点突变技术诱导前C/C基因T1862变异经PCR-RFLP初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后,以脂质体介导方法将突变前后的重组质粒转染Cos7细胞,以ELISA检测HBeAg的表达量。结果：未突变的重组质粒可稳定表达HBeAg,突变后的重组质粒未能检测到HBeAg表达。结论：HBV前C/C基因1862点突变的真核表达载体的构建,为体外研究该点突变引起HBV的一系列生物学改变奠定基础。     

人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定

目的利用PCR技术克隆人GRP78基因编码基因（约2000bp）。方法将PCR产物连接到pcDNA3.1（＋）载体上,酶切鉴定后测序分析。结果序列分析表明,扩增片段与GenBank里登陆的序列同源性为100%。并以pcDNA3.1（＋）表达载体为框架结构,尝试构建真核表达载体。结论测序分析结果表明序列同源性为100%。     

HBV C区基因真核表达载体的构建及转染

目的构建含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)增强子Ⅱ(enhancerⅡ,EnhⅡ)、核心启动子区(basal core promoter,BCP)和C区基因的真核表达载体,以研究EnhⅡ、BCP和C区基因的生物功能。方法提取HBV DNA,PCR法扩增EnhⅡ-BCP-C区基因片段;HindⅢ和XbaⅠ双酶切PCR产物,胶回收纯化的DNA片段,连接入载体pBudCE4.1,酶切及DNA测序鉴定重组载体。采用脂质体介导的方法将重组载体DNA转染HepG2细胞和HeLa细胞,酶联免疫吸附试验检测重组载体转染的HepG2细胞、HeLa细胞上清液及细胞裂解物中乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的表达水平。结果双酶切及DNA测序鉴定,含840 bp HBV EnhⅡ-BCP-C区基因片段的重组载体构建成功。EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HepG2细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后裂解物中HBeAg表达水平均明显高于pBudCE4.1空载体转染HepG2细胞(均P<0.05),EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HeLa细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后的裂解物中HBeAg表达水平与pBudCE4.1空载体转染HeLa细胞比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论成功构建HBV EnhⅡ-BCP启动-C基因肝细胞特异表达的真核载体,有利于进一步研究EnhⅡ、BCP和C区基因某些突变位点的生物学意义。     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

成纤维细胞激活蛋白及其突变体真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建并鉴定人成纤维细胞激活蛋白（ FAPα）真核表达质粒pcDNA－wFAPα（野生型FAPα）、pcDNA－tFAPα（胞外段FAPα）和pcDNA－mFAPα（缺失624～704位氨基酸的突变型FAPα）。方法以口腔癌组织总RNA为模板,采用RT－PCR方法扩增wFAPαcDNA基因片段,连接至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）获得重组pcDNA－wFAPα质粒。以重组 pcDNA －wFAPα为模板,扩增 tFAPα基因片段;用 overlap PCR 技术,获得mFAPα基因;分别连接至pcDNA3．1（＋）获得重组pcDNA－tFAPα和pcDNA－mFAPα质粒。结果酶切鉴定和测序验证皆显示pcDNA－wFAPα、pcDNA－tFAPα和pcDNA－mFAPα为正确重组质粒。结论成功构建人野生型FAPα（ wFAPα）、胞外段FAPα（ tFAPα）和突变型FAPα（ mFAPα）真核表达质粒,为进一步研究FAPα在口腔鳞癌发病过程中的分子机制奠定基础。     

乙型肝炎病毒MHBst155蛋白促进肝癌细胞HepG2生长的实验研究

目的研究乙型肝炎病毒羧基末端155位截短的中表面蛋白(MHBst155)对肝癌细胞生长、增殖的影响。方法以Hep G2细胞和稳定表达GFP/MHBst155融合蛋白的Hep G2/GFP-MHBst155作为实验细胞,细胞用5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-Cd R,20μmol/L浓度)处理。采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞吸光度值A490,分析细胞生长增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化。结果 72 h时Hep G2细胞组和Hep G2/GFP细胞组的A490分别为(0.67±0.12)、(0.70±0.06),与Hep G2/GFP-MHBst155细胞组(1.82±0.09)比较,差异均有统计学意义(t=-27.05、-36.71,P值均<0.05),而Hep G2细胞组与Hep G2/GFP细胞组比较差异无统计学意义(t=-1.21,P=0.24)。流式细胞术检测显示Hep G2/GFP-MHBst155细胞组的G0/G1期细胞比例为(26.23±2.70),明显低于Hep G2细胞组(45.20±1.25)和Hep G2/GFP细胞组(41.83±2.14),差异均有统计学意义(t=11.03、7.84,P值均<0.05);而经5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-Cd R)处理的Hep G2/GFP-MHBst155细胞组G0/G1期的比例为(43.03±1.45),与未处理Hep G2/GFP-MHBst155细胞组比较,差异有统计学意义(t=9.49,P<0.05)。结论 MHBst155可能通过缩短Hep G2细胞生长的G0/G1期而加快细胞周期进程,从而促进肝癌细胞的生长,其机制可能与MHBst155蛋白诱导生长调控基因的异常甲基化有关。     

Construction of Eukaryotic Expressing Plasmids Encoding HA and HA1 of Influenza A Virus and Their Transient Expression in HEK293 Cells

The high variability of influenza virus resultsin influenza epidemics , which occurs as numerouslocalized outbreaks or regional epidemics each yearand occasionally as a global pandemic every 10 -30years . Therefore ,seeking a promising approach tocontrol and prevent influenza is a hot subject thathas attracted the attention of researchers world-wide . DNAvaccine has become the focus of wide-spread interest , because of not only the noveltyand si mplicity , but also its efficacy to inducebroad-…     

乙型肝炎病毒X基因蛋白诱导人类白细胞抗原DR表达

乙型肝炎病毒(HBV)所致的肝细胞坏死,被认为是与人类白细胞抗原(HLA)有关的MHC限制的T细胞为主的免疫应答的结果。本研究证实,转染HBV基因组或X基因后的人肝癌细胞系可诱导HLAⅡ(即HLA DR)表达。核转录及RNA杂交分析提示表达X基因的细胞其HLA DR mRNA水平增加,X蛋白增加该基因的转录。氯霉索乙酰基转移酶(CAT)基因分析进一步提示,X蛋白通过作用于HLA DR基因上游的调节序列诱导HLA DR表达。结果表明:X蛋白可能通过调节HLA DR表达参与HBV感染的免疫发病机理。     

乙型肝炎病毒X蛋白在肝细胞癌发生发展中的作用

乙型肝炎病毒(HBV)感染是急慢性病毒性肝炎的主要致病因素,它也是诱发肝硬化,原发性肝细胞癌(HCC)的重要危险因素。据世界卫生组织(WHO)统计,每年全球范围内约有4亿人受到HBV的慢性感染,而约有1亿人死于HBV感染。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)是由乙型肝炎病毒X基因编码的一个由154个氨基酸组成的多功能反式激活蛋白,在病毒的复制和肿瘤的形成和发展中发挥着极其重要的作用,大量研究表明HBx与肝细胞癌的发生、发展有着密切的关系。     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达

目的 构建1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,并观察其在Bewo细胞中的表达.方法 以质粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBV DNA水平.结果 通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1.3倍HBV全基因表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg,并可检测到高水平的HBV DNA.结论 成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础.     

广州市三所高校新生乙肝病毒感染状况调查

目的了解乙肝病毒(HBV)在大学新生中的流行分布情况,为今后的防治工作提供科学依据。方法用酶联免疫吸附法(ELISA)检测广州市三所高校新生的乙肝病毒五项标志物,酶动力学法测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)。结果4162名大学新生HBsAg阳性总体携带率为13.55%;其中男生为16.11%,女生为9.86%,男生显著高于女生(χ2=18.285,P<0.05);HBsAg阳性的模式中以HBsAg、HBeAb及HBcAb同时阳性者比例最高达66.49%,其次为HBsAg、HBeAg及HBcAb同时阳性者占14.01%。结论广州市三所高校新生的HBsAg携带率高于全国平均水平,对其防治工作不容忽视,在学生中加强乙肝健康教育和传染源管理的同时,对易感人群采取相应的乙肝疫苗注射等措施。     

PCR 法检测 HBV DNA 及其与乙肝病毒标志物关系

目的：了解乙型肝炎患者血清中乙肝病毒ＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）的检出情况，探讨其与乙肝病毒标志物的关系。方法：采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测２５６例乙型肝炎患者血清中ＨＢＶＤＮＡ，同时用ＥＬＩＳＡ法检测乙肝病毒五项标志物，即ＨＢｓＡｇ、抗 ＨＢｓ、抗 ＨＢｃ、ＨＢｅＡｇ、抗 ＨＢｅ。结果：ＨＢＶＤＮＡ的检出率在肝炎患者各临床类型之间无明显差异，而在乙肝病毒五项标志物不同组合存在状态之间有差异，以伴有ＨＢｅＡｇ（＋）的组合形式即ＨＢｓＡｇ（＋），抗 ＨＢｃ（＋），ＨＢｅＡｇ（＋）者、ＨＢＶＤＮＡ检出率最高（９４３４％），乙肝病毒五项标志物中出现抗体及其五项全阴者仍有ＨＢＶＤＮＡ检出。结论：ＨＢｅＡｇ确是ＨＢＶ活动性复制的重要标志，但仅靠乙肝病毒五项标志物的检测来判定ＨＢＶ的复制是不够准确的，同时用ＰＣＲ法检测ＨＢＶＤＮＡ能更准确反映体内ＨＢＶ复制情况。     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。     

重组8型腺相关病毒（rAAV8-1.3HBV）介导HBV急性感染树鼩模型建立

【摘要】 目的 利用重组8型腺相关病毒介导1.3拷贝HBV基因组（1.3HBV,ayw亚型）在树鼩肝脏表达,建立HBV急性感染树鼩模型。 方法 通过大腿内侧静脉注射将携带有1.3 HBV的重组8型腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus 8,rAAV8-1.3HBV）导入树鼩肝脏,通过ELISA检测树鼩血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb,荧光定量PCR检测树鼩肝脏和血清中HBV DNA,全自动生化分析仪检测血清中ALT水平,并观察感染后肝脏的病变情况。结果 HBV感染主要血清标志物1-2周内均检测阳性;30天后肝组织仍可检测到病毒抗原阳性细胞;55天时肝组织HBV DNA拷贝数仍可达到104 -105 ;树鼩血清中HBV DNA拷贝数持续一个月高于正常组;肝组织炎细胞略增多,血清ALT水平持续升高。 结论 rAAV8所携带的HBV基因组高效专一导入树鼩肝细胞并复制表达,成功建立HBV急性感染树鼩模型,为进一步探索rAAV8树鼩慢性感染模型打下一定的基础。